CN107904269A - 一种工程菌种转化制备(s)‑(+)‑3‑羟基四氢呋喃的方法 - Google Patents

一种工程菌种转化制备(s)‑(+)‑3‑羟基四氢呋喃的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种工程菌种转化制备(S)‑(+)‑3‑羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：以3‑酮基四氢呋喃为底物，以基因工程菌大肠杆菌LC001发酵获得的持续供酶菌体细胞并经过海藻酸钙固定化为生物催化剂催化反应制得(S)‑(+)‑3‑羟基四氢呋喃。本发明所述的工程菌种转化制备(S)‑(+)‑3‑羟基四氢呋喃的方法，操作简便，收率高；反应条件温和、环境友好；催化专一性高、催化效率高，并且底物和产物耐受度高，成本低廉，具有工业化生产的潜在价值。

Description

一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法
技术领域
本发明属于生物合成技术领域，特别是涉及一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法。
背景技术
(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃，英文名称：(S)-(+)-3-Hydroxytetrahydrofuran，分子式：C4H8O2，分子量：88.10512)；是合成依帕列净、阿法替尼肿瘤、安普那伟、福沙那韦钙的一个重要中间体。
目前国内外已经报道了很多(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的制备方法，主要为化学合成法，可以分为三大类：手性底物合成；手性催化剂不对称合成和消旋体合成后手性拆分。上述化学合成法已经取得了较好的效果，但同时也有一些不足之处，例如手性底物合成对原料要求高，手性催化用到的手性催化剂制备繁琐，光学纯度欠佳，手性拆分收率理论上限也只有50％，并且化学合成法通常存在能耗大、成本高、对环境污染严重等缺点。与之相比，生物催化法制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃具有反应条件温和、手性纯度高、催化底物专一、环境友好等优点，符合绿色化学的发展要求而越来越受到国内外学者的重视。
现有的生物催化制备方法，其中有制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的手性前体，手性底物需要后续合成；有以3-酮基四氢呋喃为底物、含酮还原酶酿酒酵母为催化剂的制备方法，该方法相对污染较小，但酵母菌中含有大量酮还原酶，这些酶具有相同的底物特性而对应选择性却不同，因而产物中不可避免的有杂质产生。
由此可知，采用微生物法制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃与传统的化学合成方法相比，具有成本低，步骤短，收率高，周期短，污染小的特点，是制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的绿色合成工艺，是未来的发展方向。但目前微生物转化法工艺还不成熟，菌种选择范围少，底物浓度普遍偏低，急需开发出底物耐受度高、酮还原酶高表达或高量专一表达的菌种。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，利用基因工程菌，可以获得高浓度的专一的酮还原酶表达，且能够实现足够的辅助因子循环。
本发明采用的技术方案是：
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，以3-酮基四氢呋喃为底物，以基因工程菌大肠杆菌LC001发酵获得的持续供酶菌体细胞并经过海藻酸钙固定化为生物催化剂催化反应制得(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将所述大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，得种子液；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞，再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，以葡萄糖作为辅助底物，以步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞作生物催化剂，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束后倒出转化液；
(5)分离纯化：转化液经萃取、纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，步骤(4)中所述3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为10～100mg/g底物。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，步骤(4)中所述葡萄糖在PBS缓冲液中的初始浓度为50～100g/L。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，步骤(3)中发酵培养具体为：将大肠杆菌LC001接种至发酵培养基中，摇床转速为150～200r/min，22～28℃培养18～24h，将发酵液离心，制得产酶菌体细胞，再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，步骤(5)中分离纯化具体为：用等体积乙酸乙酯连续萃取转化液3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，20～30℃培养15～25h得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h得种子液；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞；再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L，添加葡萄糖作为辅助底物，使葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为50～100g/L，以及细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃10～50％的步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束倒出转化液；
(5)分离纯化：用等体积乙酸乙酯连续萃取步骤(4)中所述转化液3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其中，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，20～30℃培养15～25h得菌体斜面；
所述的斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，琼脂20g/L，NaOH溶液调pH值7.4，溶剂为水；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h得种子液；
所述的种子培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞；再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
所述发酵培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L，添加葡萄糖作为辅助底物，使葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为50～100g/L，以及细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃10～50％的步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束倒出转化液；
(5)分离纯化：将上清液倒出用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
本发明有益效果：
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，比化学手性催化剂成本低，操作简便，收率高；反应条件温和、环境友好；与现有生物转化法相比，大肠杆菌作为宿主细胞本身不具备酮还原酶，通过基因手段插入的酮还原酶基因单一可控高表达的，与葡萄糖脱氢酶基因共表达实现足够的辅酶因子循环确保酮还原酶能够维持很高的浓度，产酶专一性好并且产率高，从而催化专一性高、催化效率高，并且底物和产物耐受度高，成本低廉，具有工业化生产的潜在价值。
本发明所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，添加终浓度为50～100g/L的葡萄糖作为辅助底物实现辅助因子的外循环，有利于提高底物的摩尔转化率。
具体实施方式
实施例1
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，包括以下步骤：
(1)斜面培养：将大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，25℃培养20h得菌体斜面；
所述的斜面培养基的配制：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，LB琼脂20g/L，NaOH溶液调pH值7.4，溶剂为水；121℃灭菌20min，冷却后制成斜面；所述大肠杆菌LC001(购自北京全式金生物技术有限公司)的菌落特征：在LB琼脂培养基上呈现出灰白色、有光泽、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形态；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，25℃，摇床转速为180r/min，培养20h得种子液；
所述的种子培养基的配制：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；121℃灭菌20min；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数15％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为25℃，摇床转速为180r/min，培养20h，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞；再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
所述发酵培养基的配制：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；121℃灭菌20min；
(4)生物转化：在pH 7.5的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1mol/L，添加葡萄糖作为辅助底物，使葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为50g/L，以及细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃30％的步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞，于25℃下转化反应20h，反应结束倒出转化液；所述产酶菌体固定化细胞以细胞干重计为10mg/g 3-酮基四氢呋喃底物；
所述产酶菌体固定化细胞干重的测定是将发酵液离心分离后，弃去上清液，将少量湿细胞称重后在120℃烘干48h至恒重，测定干细胞的重量；余下湿细胞称重后制备成海藻酸钙固定化细胞小球，对固定化小球进行沥干5min后称重，计算出固定化小球单位重量中湿细胞的含量，再以这个含量计算出单位干细胞对应固定化小球的用量；
(5)分离纯化：将上清液倒出用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
实施例2
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除所述3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为3mol/L外，其它同实施例1。
实施例3
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为5mol/L外，其它同实施例1。
实施例4
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为7mol/L的3-酮基四氢呋喃外，其它同实施例1。
实施例5
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为10mol/L外，其它同实施例1。
实施例6
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为80g/L外，其它同实施例3。
实施例7
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中除葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为100g/L外，其它同实施例3。
实施例8
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中20℃下转化反应25h外，其它同实施例3。
实施例9
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中30℃下转化反应15h外，其它同实施例3。
实施例10
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中25℃下转化反应15h外，其它同实施例3。
实施例11
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为30mg/g 3-酮基四氢呋喃底物外，其它同实施例3。
实施例12
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为50mg/g 3-酮基四氢呋喃底物外，其它同实施例3。
实施例13
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为70mg/g 3-酮基四氢呋喃底物外，其它同实施例3。
实施例14
一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，除步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为100mg/g 3-酮基四氢呋喃底物外，其它同实施例3。
本实施例产物(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的摩尔转化率和对映体过剩值(ee％)的确定：采用气相色谱分析检测，色谱柱为CP-ChiraSil-DEX CB毛细管柱，25m*0.25mm*0.25um手性柱。该手性柱可以检测到(R)-(-)-3-羟基四氢呋喃和(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃两种对映体的含量，进一步计算出反应的摩尔转化率和(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的对映体过剩(ee％)，实施例1-20中(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的摩尔转化率及对应体过剩值(ee)的影响见表1。
表1(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的摩尔转化率及对应体过剩值(ee)数据表
实施例 摩尔转化率(％) (S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的对映体过剩值(ee％)
1 96.1 99.5
2 94.7 99.8
3 93.4 100
4 91.2 100
5 90.1 100
6 100 100
7 98.4 100
8 92.5 100
9 92.8 100
10 92.3 100
11 96.2 100
12 98.1 100
13 100 100
14 100 100
由表1可以看出，本发明制备的(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的摩尔转化率≥90.1％，对映体过剩(ee％)≥99.5％。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：以3-酮基四氢呋喃为底物，以基因工程菌大肠杆菌LC001发酵获得的持续供酶菌体细胞并经过海藻酸钙固定化为生物催化剂催化反应制得(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
2.根据权利要求1所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)斜面培养：将所述大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，得种子液；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞，再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，以葡萄糖作为辅助底物，以步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞作生物催化剂，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束后倒出转化液；
(5)分离纯化：转化液经萃取、纯化得到所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
3.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤(4)中所述3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L。
4.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：步骤(4)中所述产酶菌体固定化细胞用量以细胞干重计为10～100mg/g底物。
5.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：步骤(4)中葡萄糖在PBS缓冲液中的初始浓度为50～100g/L。
6.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：步骤(3)中发酵培养具体为：将大肠杆菌LC001接种至发酵培养基中，摇床转速为150～200r/min，22～28℃培养18～24h，将发酵液离心，制得产酶菌体细胞，再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞。
7.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：步骤(5)中分离纯化具体为：用等体积乙酸乙酯连续萃取转化液3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
8.根据权利要求2所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)斜面培养：将大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，20～30℃培养15～25h得菌体斜面；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h得种子液；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞；再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L，添加葡萄糖作为辅助底物，使葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为50～100g/L，以及细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃10～50％的步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束倒出转化液；
(5)分离纯化：用等体积乙酸乙酯连续萃取步骤(4)中所述转化液3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
9.根据权利要求2-8任意一项所述的工程菌种转化制备(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)斜面培养：将大肠杆菌LC001接种到斜面培养基，20～30℃培养15～25h得菌体斜面；
所述的斜面培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，琼脂20g/L，NaOH溶液调pH值7.4，溶剂为水；
(2)种子培养：从步骤(1)中所述菌体斜面取少量菌体转接到种子培养基，20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h得种子液；
所述的种子培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；
(3)发酵培养：取步骤(2)中所述种子液，以体积分数10～20％的接种量接种于发酵培养基中，培养温度为20～30℃，摇床转速为150～200r/min，培养15～25h，将发酵液离心，分离得到产酶菌体细胞；再经过海藻酸钠和氯化钙固定化后制得产酶菌体固定化细胞；
所述发酵培养基的终浓度组成为：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10/L，溶剂为水，用NaOH或HCl溶液调整液体培养基的pH值为7.4，溶剂为水；
(4)生物转化：在pH 7.4～7.6的PBS缓冲液中，以3-酮基四氢呋喃为底物，3-酮基四氢呋喃在PBS缓冲液中的初始浓度为1～10mol/L，添加葡萄糖作为辅助底物，使葡萄糖在PBS缓冲液中的终浓度为50～100g/L，以及细胞干重质量为3-酮基四氢呋喃10～50％的步骤(3)中所述产酶菌体固定化细胞，于20～30℃下转化反应15～25h，反应结束倒出转化液；
(5)分离纯化：将上清液倒出用等体积乙酸乙酯连续萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液再用其一半体积的饱和食盐水洗1次，在乙酸乙酯萃取液中加入无水硫酸钠干燥除去水分，抽滤，滤液减压蒸馏除去乙酸乙酯，即得所述(S)-(+)-3-羟基四氢呋喃。
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