CN104975050A - 一种富马酸的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富马酸的制备方法，属于生物工程技术领域。其步骤为：（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；（2）丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收细胞；（3）转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持40%～60%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃～36℃和6.8～7.5，所述新鲜的培养基为JSM-CN培养基、JSM-CP培养基、JSM-CT培养基；（4）以低活性产丁二酸重组大肠杆菌细胞作为催化剂，丁二酸钠为底物有氧转化合成富马酸。本发明的技术方案，以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成富马酸，其转化率达到92%以上。

Description

一种富马酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，本发明涉及富马酸的制备方法。

背景技术

富马酸（又称延胡索酸）作为一种重要的四碳平台化合物，在医药、食品以及表面活性剂等行业有着广泛的用途，可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。目前富马酸主要通过顺丁烯二酸酐异构化和糠醛氧化法生产，化学合成富马酸因成本高和环境污染等原因使得富马酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。

富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母及细菌。其中根霉菌Rhizopus为重点研究的对象，具体包括米根霉Rhizopus oryzae、少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在这一时期，我国科学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53.15g/L，得率为45%，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要11天左右（食品与发酵工业，1988，4:32～36）。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，98g/L初始葡萄糖发酵48h，其富马酸产量为33g/L，得率为33.7%（Bioprocess Biosyst Eng,2002,25:179～181）。

发酵法生产富马酸可以利用可再生资源和二氧化碳，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。因此，以微生物发酵法生产富马酸的研究与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低。开发对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的C4有机酸生产菌株是加速生物法替代石化法生产的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在产丁二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种温和、高效的方法回收菌体细胞，将回收菌体的细胞最终能够转入新鲜培养基中以丁二酸钠为原料转化合成富马酸。

为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：

（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；

（2）丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收细胞回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞；

（3）将回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞，转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持40%～60%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃～36℃和6.8～7.5，以丁二酸钠为底物有氧转化合成富马酸，所述的新鲜培养基为JSM-CN培养基、JSM-CP培养基、JSM-CT培养基。

所述的步骤（1）具体操作为：用活化重组大肠杆菌菌体，转接入发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为20-30g·L^-1，培养过程溶氧维持在40%～60%以上；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在5～20g·L^-1，同时添加用于提供二氧化碳供体，调控pH值在6.8-7.0之间。

所述的活化重组大肠杆菌菌体为从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下至菌体密度的OD600值在0.6～0.8之间。

所述的步骤（2）具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置5～10分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除；或者在发酵罐外面用泵将发酵罐内的上层清液抽出发酵罐即可实现菌体的收集。

本发明利用重组大肠杆菌两阶段发酵（先进行有氧发酵再转入厌氧情况下进行发酵）产丁二酸以后，将菌体进行回收，将原先菌体处于的厌氧状态恢复至有氧状态，让菌体重新恢复生长的能力，再以丁二酸钠为原料来发酵制备富马酸，而这种大肠杆菌经两阶段发酵以后再经过有氧诱导菌体使其恢复生长，再以一定的原料进行发酵生产其他产物的方法目前未见公开，而这种应用将有效提高产丁二酸重组大肠杆菌的利用效率。

在大肠杆菌在厌氧的情况下菌体基本上是不生长的一个状态，而本发明在厌氧发酵结束时又将它恢复成好氧的状态，使得菌体又恢复了生长的能力，同时菌体内部的酶活在一定培养基存在的情况下得到诱导，而富马酸、丁二酸本身都是菌体进行三羧酸循环的中间代谢产物，由于相关酶活得到了诱导，他们之间的互相转化就变的成为可能。

有益效果：

本发明的技术方案，以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成富马酸，其转化率达到92%以上。

说明书附图

图1为富马酸生产过程曲线图

具体实施方式

本发明中所述的菌株及培养基：

菌株：Escherichia coli AFP111（Applied Environmental Microbiology.2002,68,1715-1727）

培养基：

（1）LB种子液培养基：酵母粉5g·L^-1；蛋白胨10g·L^-1；NaCl5g·L^-1；

（2）JSM发酵培养基：葡萄糖40g·L^-1；柠檬酸3g·L^-1；Na₂HPO₄·7H₂O3g·L^-1；KH₂PO₄8g·L^-1；(NH₄)₂HPO₄8g·L^-1；NH₄Cl0.2g·L^-1；(NH₄)₂SO₄0.75g·L^-1；MgSO₄·7H₂O1.00g·L^-1；CaCl₂·2H₂O10.0mg·L^-1；ZnSO₄·7H₂O0.5mg·L^-1；CuCl₂·2H₂O0.25mg·L^-1；MnSO₄·H₂O2.5mg·L^-1；CoCl₂·6H₂O1.75mg·L^-1；H₃BO₃0.12mg；Al₂(SO₄)₃·xH₂O1.77mg·L^-1；Na₂MoO₄·2H₂O0.5mg·L^-1；柠檬酸铁16.1mg·L^-1；VB₁20·mg L^-1；生物素2mg·L^-1。

下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。

实施例1

两阶段发酵产酸的过程采用如下技术方案中所描述的：

菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养至菌体密度（OD₆₀₀）值0.6。

两阶段发酵：添加葡萄糖至初始浓度为25g·L^-1，培养过程溶氧维持在50%；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中采用恒速补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在20g·L^-1，同时间歇性添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值在7.0。

发酵结束时对菌体进行回收，回收细胞的方式采用沉降法收集菌体。具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置5分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除。

回收的菌体细胞随后便进行富马酸的生产，培养条件为维持40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃和6.8，初始细胞干重DCW在10g/L，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20g L^-1。首先对转化过程的培养基进行了筛选，以JSM发酵培养基为参考，为解除葡萄糖效益，葡萄糖被除去，在此基础上去除磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（JSM-CP），磷酸氢二铵和氯化铵和硫酸铵（JSM-CN）以及去除MgSO₄·7H₂O，CaCl₂·2H2O，ZnSO₄·7H₂O，CuCl₂·2H₂O，MnSO₄·H₂O，CoCl₂·6H₂O，H₃BO₃，Al₂(SO₄)₃·xH₂O，Na₂MoO₄·2H₂O，柠檬酸铁，VB1和生物素（JSM-CT）对转化的影响。转化12h后其结果见表1：

表1不同转化培养基对富马酸合成的影响

培养基	DCW（gL-1）	丁二酸（gL-1）	富马酸（gL-1）
				JSM	16.4	20	0
JSM-CP	12.1	0	10.1
				JSM-CN	11.2	0	1.4
JSM-CT	12.7	16.2	1.5

实施例2

菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养8h，至菌体密度（OD₆₀₀）值0.7。

两阶段发酵：添加葡萄糖至初始浓度为20g·L^-1，培养过程溶氧维持在60%；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中采用恒速补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在5g·L^-1，同时间歇性添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值在6.4。

发酵结束时对菌体进行回收，回收细胞的方式采用沉降法收集菌体。具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置8分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除。

回收的菌体细胞随后便进行富马酸的生产，培养条件为维持50%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和7.0，初始细胞干重DCW在10g/L，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL^-1，

考虑到产丁二酸重组大肠杆菌不同活性下对转化丁二酸的能力及产物分布有影响，因此选择了厌氧发酵12h，24h，36h，48h回收的细胞做转化，考察其对产物分布的影响。以JSM-CP为转化培养基，转化12h后其结果见表2：

表2不同活性细胞对富马酸合成的影响

回收细胞时间	DCW（gL-1）	丁二酸（gL-1）	富马酸（gL-1）
				12h	11.3	0	2.4
24h	10.9	0	5.1
				36h	11.1	0	10.5
48h	11.4	0	17.8

实施例3

菌种活化：从甘油冻存管中取少量菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养8h，至菌体密度（OD₆₀₀）值0.8。

两阶段发酵：添加葡萄糖至初始浓度为30g·L^-1，培养过程溶氧维持在40%；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中采用恒速补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在10g·L^-1，同时间歇性添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值在6.8。

发酵结束时对菌体进行回收，回收细胞的方式采用沉降法收集菌体。具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置10分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除。

回收的菌体细胞随后便进行富马酸的生产，培养条件为维持60%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在36℃和7.5，初始细胞干重DCW在10g/L，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20g L^-1，

依据前期试验结果，选择厌氧发酵48h回收的细胞，以JSM-CP为转化培养基，其转化过程曲线图如图1所示。

以上虽然已结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。本领域技术人员可在不脱离本发明的技术思想和主旨的范围内对这些实施方式进行适当的变更，而这些变更后的实施方式显然也包括在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种富马酸的制备方法，其步骤如下：

（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；

（2）丁二酸发酵结束时，采用沉降法收集菌体回收细胞，回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞；

（3）将回收低活性的产丁二酸重组大肠杆菌细胞，转入新鲜培养基中，通空气或者氧气，并维持40%～60%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在33℃～36℃和6.8～7.5，以丁二酸钠为底物有氧转化合成富马酸；所述新鲜的培养基为JSM-CN培养基、JSM-CP培养基、JSM-CT培养基。

2.根据权利要求1所述的富马酸的制备方法，其特征在于：

所述的步骤（1）具体操作为：用活化重组大肠杆菌菌体，转接入发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为20-30g·L-1，培养过程溶氧维持在40%～60%以上；待葡萄糖基本消耗完时改通CO₂气体，进入厌氧发酵产酸阶段，发酵过程中补加葡萄糖的方法，且控制葡萄糖浓度在5～20g·L-1，同时添加用于提供二氧化碳供体，调控pH值在6.8-7.0之间。

3.根据权利要求2所述的富马酸的制备方法，其特征在于：

所述的活化重组大肠杆菌菌体为从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下至菌体密度的OD₆₀₀值在0.6～0.8之间。

4.根据权利要求1所述的富马酸的制备方法，其特征在于：

所述的步骤（2）具体操作为待发酵结束时，发酵罐内停止通气与搅拌，静置5～10分钟，待细胞沉降完全后，将菌体细胞上层的发酵清液通过压缩空气给罐子增压通过压差将发酵罐内的上层清液移除；或者在发酵罐外面用泵将发酵罐内的上层清液抽出发酵罐即可实现菌体的收集。