CN101792778B - 一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：采用产琥珀酸重组大肠杆菌先有氧培养菌体后厌氧产酸的两阶段发酵模式生产丁二酸；在两阶段发酵结束时，利用两阶段发酵过程产生的代谢产物(丁二酸，乙酸，丙酮酸等)有氧诱导细胞；无菌收集菌体细胞，在新鲜培养基中厌氧生物转化合成丁二酸；厌氧生物转化结束后再次有氧诱导，并回收细胞在新鲜的培养基下继续生物转化合成丁二酸，实现循环利用细胞生物转化合成丁二酸的目的。本发明技术方案解决了因有氧菌体培养过程消耗大量碳源及时间导致两阶段发酵整个过程丁二酸收率及生产强度偏低的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法，具体涉及利用两阶段发酵时产生的代谢产物有氧诱导提高重组大肠杆菌细胞胞内酶活，并循环利用已提高胞内酶活的细胞生产丁二酸的方法。
背景技术
丁二酸(succinic acid)被广泛应用于医药、农药、染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，同时作为优秀的C4平台化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、γ-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12种最有价值的生物炼制产品之一。
丁二酸的生产方法主要包括化学合成法和微生物发酵法，利用微生物发酵法转化可再生资源(葡萄糖、木糖等)，由于原料来源广泛且价格低廉，污染小，环境友好，且在发酵过程中可吸收固定CO2，能有效缓解温室效应，开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径，近年来成为研究的热点。丁二酸的生产菌株主要包括naerobiospirillumsucciniciproducens、Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、重组谷氨酸棒杆菌和重组大肠杆菌。利用野生菌株生产丁二酸，虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，近年来被广泛用于研究以获得产丁二酸优秀菌株。
利用大肠杆菌生产丁二酸的发酵模式主要包括专一性厌氧发酵及两阶段发酵。专一性厌氧发酵时，菌株生长缓慢，丁二酸终浓度和收率均较低。Vemuri等人利用大肠杆菌AFP111(PYC)两阶段发酵，其厌氧阶段可完成1.1g·g-1的丁二酸收率和1.3g·L-1·h-1的丁二酸生产强度(Applied Environmental Microbiology.2002，68，1715～1727)。但如果考虑有氧阶段消耗的糖及花费的时间，收率和生产强度将下降。Andersson等人通过及时回收厌氧发酵细胞并转化新鲜培养基继续厌氧丁二酸生产，解除了产物抑制，延长了丁二酸的生产时间，在相同时间内较两阶段发酵，产物浓度提高了60％；但过程中菌体密度、细胞比生产强度都不断下降(Bioprocess and Biosystems Engineering.2009，DOI10.1007/s00449-009-0393-y)。因此，若能解决在两阶段发酵结束时通过有氧短时间诱导细胞，并收集已提高胞内关键酶活的细胞进一步厌氧转化合成丁二酸，将可大幅度提高细胞的比生产强度，同时可有效延长厌氧丁二酸的生产时间。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种能提高重组大肠杆菌胞内合成丁二酸途径关键酶酶活的方法，并利用已提高胞内酶活的微生物进一步转化合成丁二酸，以大幅度提高菌株生产丁二酸整个过程的收率及生产强度。
为实现本发明循环利用重组大肠杆菌细胞生产丁二酸的目的，本发明采用以下技术方案：
一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法，包括以下步骤：
(1)利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸；
所述的两阶段发酵，其特征在于先有氧培养菌体，继而转厌氧发酵产丁二酸：首先用LB培养基活化菌体，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12h左右作为种子液；按接种量3％转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25g·L-1，有氧培养至细胞干重在10～12g·L-1，培养过程溶氧维持在40％以上；改通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，并分批补加葡萄糖，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。
(2)利用两阶段发酵产生的中间代谢产物有氧诱导细胞内关键酶活；
两阶段发酵结束时，培养基中无残糖，碳源仅剩丁二酸、乙酸、丙酮酸等中间代谢产物，此时发酵培养基改通空气或者氧气，并维持＞40％的溶氧，以中间代谢产物为碳源，培养＞2h，诱导细胞内生产丁二酸过程中的关键酶酶活。
其中，所述的关键酶活所指的酶是：磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PCK)、异柠檬酸裂解酶(ICLR)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)、富马酸酶(FUM)、富马酸还原酶(FRD)、丙酮酸脱氢酶(PDH)中的一种或者多种；
(3)无菌收集菌体细胞，在新鲜培养基中厌氧生物转化合成丁二酸。
收集已有氧诱导的细胞菌液，离心或者膜过滤获得细胞，并转化新鲜培养基进行厌氧发酵。
其中，本发明所述的方法在步骤(3)结束时可继续有氧诱导并转新鲜培养基生物转化合成丁二酸，达到细胞重复循环利用的目的：待步骤(3)中细胞葡萄糖的消耗速率下降至0.1g·L-1·h-1，终止厌氧发酵并转有氧诱导细胞，继而实施步骤(3)。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的步骤(2)中，有机酸检测表明丁二酸、乙酸能作为碳源被消耗，并有少量富马酸、苹果酸产生。酶活检测表明丁二酸合成途径中的关键酶活有2～10倍的提高；
2、本发明的步骤(3)中，利用已提高胞内酶活的细胞在新鲜培养基下生物转化合成丁二酸，发酵结束时在丁二酸浓度可＞60g·L-1下，收率＞0.92g·g-1，生产强度＞2.8g·L-1·h-1；
3、本发明的技术方案，在两阶段发酵结束时通过有氧短时间诱导细胞，并收集已提高胞内关键酶活的细胞进一步厌氧转化合成丁二酸，大幅度提高了细胞的比生产强度，同时有效延长了厌氧丁二酸的生产时间。
附图说明
图1利用回收的细胞在新鲜发酵培养基中培养过程中葡萄糖、丁二酸、乙酸和细胞密度随时间的变化曲线；
图2细胞多次回收连续生物转化合成丁二酸过程葡萄糖、丁二酸、乙酸和细胞密度随时间的变化曲线。
具体实施方式
本发明中所述的培养基：
(1)LB种子液培养基：酵母粉5g·L-1；蛋白胨10g·L-1；NaCl 5g·L-1；
(2)JSM发酵培养基：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；Na2HPO4·7H2O 3g·L-1；KH2PO48g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl 0.2g·L-1；(NH4)2SO40.75g·L-1；MgSO4·7H2O 1.00g·L-1；CaCl2·2H2O 10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O 0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1；MnSO4·H2O 2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O 1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O 1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mg L-1；生物素2mg·L-1。
本发明所用的重组大肠杆菌Escherichia coli AFP111来源于公开文献(Mutation of theptsG Gene Results in Increased Production of Succinate in Fermentation of Glucose byEscherichia coli，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，0099-2240/01/$04.0010DOI：10.1128/AEM.67.1.148-154)。
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
本实施例说明在两阶段发酵结束后进行有氧诱导过程时，大肠杆菌AFP111可以利用培养基中的代谢产物(丁二酸、乙酸等)以维持细胞的生长及功能。其具体培养条件及步骤如下：
1、两阶段发酵生产丁二酸：先LB培养基活化菌体，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12h左右作为种子液；按接种量3％转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25g·L-1，有氧培养至细胞干重在10～12g·L-1，培养过程溶氧维持在40％以上；改通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值在6.4～6.8之间。
2、两阶段发酵结束时，检测培养基中葡萄糖含量，确保已经耗尽；同时，改通空气或者纯氧，使溶氧在40％以上，控制温度在37℃，pH用20％盐酸控制在7.0；
3、分别取0h，1h，2h，3h的样进行培养基成分分析，结果见表1；
4、分别取0h，1h，2h，3h的样进行胞内关键酶活检测，结果见表2。
表1细胞诱导前后培养基中中间代谢产物的变化情况
表2细胞诱导前后胞内关键酶活的变化情况
注：a代表数据均已实测值加上标准偏差
b中：PCK-磷酸烯醇式丙酮酸激酶；ME-苹果酸酶；ICL-异柠檬酸裂解酶；
FRD-富马酸还原酶；MDH-苹果酸脱氢酶
实施例2
本实施例利用已诱导提高合成丁二酸途径中关键酶活的大肠杆菌AFP111细胞，在新鲜培养基中发酵生产丁二酸。其具体步骤如下：
1、两阶段发酵生产丁二酸：先LB培养基活化菌体，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12h左右作为种子液；按接种量3％转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25g·L-1，有氧培养至细胞干重在10～12g·L-1，培养过程溶氧维持在40％以上；改通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。
2、两阶段发酵结束时，检测培养基中葡萄糖含量，确保已经耗尽；同时，改通空气或者纯氧，使溶氧在40％以上，控制温度在37℃，pH用20％盐酸控制在7.0，有氧诱导3h；
3、无菌回收细胞，并转化新鲜培养基，通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。发酵过程结果如图1所示。
实施例3
本实施例利用已诱导提高合成丁二酸途径中关键酶活的大肠杆菌AFP111细胞，在新鲜培养基中循环利用细胞发酵生产丁二酸。其具体步骤如下：
1、两阶段发酵生产丁二酸：先LB培养基活化菌体，按1％(v/v)接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12h左右作为种子液；按接种量3％转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25g·L-1，有氧培养至细胞干重在10～12g·L-1，培养过程溶氧维持在40％以上；改通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。
2、两阶段发酵结束时，检测培养基中葡萄糖含量，确保已经耗尽；同时，改通空气或者纯氧，使溶氧在40％以上，控制温度在37℃，pH用20％盐酸控制在7.0，有氧诱导3h；
3、无菌回收细胞，并转化新鲜培养基，通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。
4、待厌氧发酵过程葡萄糖的消耗能力下降至0.2g·L-1·h-1时，检测培养基中葡萄糖含量，确保已经耗尽；同时，改通空气或者纯氧，使溶氧在40％以上，控制温度在37℃，pH用20％盐酸控制在7.0，有氧诱导3h。并无菌回收细胞，转化新鲜培养基，通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8。重复操作步骤4两次，过程结果如图2所示。
Claims (3)
1. 一种循环利用重组大肠杆菌AFP111细胞发酵生产丁二酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）利用重组大肠杆菌采用两阶段发酵生产丁二酸：先有氧培养快速提高菌体密度，继而转厌氧发酵产丁二酸；具体地：首先用LB培养基活化菌体，按体积比1%接种量从冻存管接入三角瓶中，有氧培养菌体12 h左右作为种子液；按接种量3%转接JSM发酵培养基，添加葡萄糖至初始浓度为25 g·L-1，有氧培养至细胞干重在10～12 g·L-1，培养过程溶氧维持在40%以上；改通CO2气体，进行厌氧发酵产酸，采用分批补加葡萄糖的方法，且最高浓度不超过50 g·L-1，同时添加碱式碳酸镁用于提供二氧化碳供体，同时调控pH值6.4～6.8；
其中，所述的JSM发酵培养基是：葡萄糖40 g·L-1；柠檬酸3 g·L-1；Na2HPO4·7H2O 3 g·L-1；KH2PO4 8 g·L-1；(NH4)2HPO4 8 g·L-1；NH4Cl 0.2 g·L-1；(NH4)2SO4 0.75 g·L-1；MgSO4·7H2O 1.00 g·L-1；CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1；CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1；MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1；CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1；H3BO3 0.12 mg；Al2(SO4)3·xH2O 1.77 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1；柠檬酸铁 16.1 mg·L-1；VB1 20·mg L-1；生物素 2 mg·L-1；
（2）利用两阶段发酵产生的中间代谢产物有氧诱导细胞内关键酶活：两阶段发酵结束时，培养基中无残糖，碳源仅剩中间代谢产物，此时发酵培养基改通空气或者氧气，并维持>40%的溶氧，以中间代谢产物为碳源，培养>2 h，诱导细胞内生产丁二酸过程中的关键酶酶活；
（3）无菌收集菌体细胞，在新鲜培养基中厌氧生物转化合成丁二酸；
（4）在步骤（3）结束时继续有氧诱导并转新鲜培养基生物转化合成丁二酸，达到细胞重复循环利用的目的：待步骤（3）中细胞葡萄糖的消耗速率下降至0.1 g·L-1·h-1，终止厌氧发酵并转有氧诱导细胞，继而实施步骤（3）。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（2）中的诱导细胞内关键酶活的酶是磷酸烯醇式丙酮酸激酶、异柠檬酸裂解酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸酶、富马酸酶、富马酸还原酶、丙酮酸脱氢酶中的一种或者多种。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤（3）的具体方法为：收集已有氧诱导的细胞菌液，离心或者膜过滤获得细胞，并在新鲜培养基中进行厌氧发酵。
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