CN105543294A - 一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法。所述方法包括：菌种活化、种子液制备、发酵产丁二酸过程、以及回收菌体细胞，以丁二酸二钠为底物，转化合成苹果酸。所述应用目前尚无报道，与其他生物发酵生产苹果酸工艺相比，本发明的技术方案以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成苹果酸，其转化率达到90%以上，提高了细胞的利用效率，有效节约了成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法，通过对微生物进行特定的菌种活化、种子液制备后，进行厌氧发酵生产丁二酸发酵结束后收集菌体细胞，在以丁二酸钠为底物的特定培养基和培养环境下，有氧转化合成苹果酸。
背景技术
苹果酸是人体内部循环的重要中间产物，易被人体吸收，因此作为优异的食品添加剂和功能性食品广泛应用于食品、医疗和保健等领域。目前苹果酸生产以富马酸或马来酸为原料，加压与水蒸汽共热形成DL-苹果酸，也可以糠醛为原料，经双氧水处理，在超声波作用下转变而成。化学法由于生产工艺比较复杂，工艺条件要求高，分离精制技术难度大，加之原料为化工产品，成本高和环境污染等原因使得苹果酸的应用受到限制。苹果酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以富马酸为底物，利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用细胞反应器或固定化酶，将富马酸转化成L-苹果酸。随着石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备苹果酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备苹果酸的微生物主要是霉菌，其中黄曲霉Asp.flavu为重点研究的对象，具体包括黄曲霉Asp.flavu，末曲霉Asp.oryzae，寄生曲霉Asp.parasiticus。Takao等报道先用少根根霉(Rhizopusahirrizus)或华根霉(Rhizopuchinensis)把糖质原料转化成富马酸，然后利用膜醭毕赤酵母(Pichamembraneaefaciensfaciens)、普通变形杆菌(proteusvulgaris)及宛氏拟青霉(paeciomycesvarioti)之一，把富马酸转化成L-苹果酸的研究，但转化率不高（J.Ferment.Techno，1983，61：643-645）。山东食品发酵工程实验室等人多年来致力于直接发酵法生产L-苹果酸的研究，并且从土壤中分离筛选、诱变获得一株直接利用淀粉质原料生产L-苹果酸的高产菌株AspergillusflavusHA5800，经过发酵条件的优化，7000升发酵罐产酸达8.68%，糖酸转化率达83.5%，发酵周期112小时，为L-苹果酸产业化奠定了基础。（中国食品添加剂，2003，3：52-56）。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低，开发对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的苹果酸酸生产菌株是加速生物法替代石化法生产的关键。
利用大肠杆菌来发酵生产苹果酸，是利用了大肠杆菌生长快速、培养条件简单、安全性好、易操作易改造等诸多优点。目前，SooYunMoon等人报道了一株生产苹果酸的重组大肠杆菌，其原理是敲除野生大肠杆菌中的磷酸转乙酰酶基因（PTA）并过量表达Mannheimiasucciniciproducens中磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PCK），结果在有氧条件下12h生产苹果酸9.25gL-1（BiochemicalEngineeringJournal，2008,40:312-320）。但其收率仅61%，且产物浓度较低。本发明利用回收的产丁二酸重组大肠杆菌，以丁二酸钠为原料有氧发酵制备苹果酸的方法未见公开，而这种应用将有效提高产丁二酸重组大肠杆菌的利用效率。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在产丁二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种温和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中以丁二酸钠为原料转化合成苹果酸。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6~8h，至菌体密度（OD600）值在0.6~0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先通空气有氧培养至菌体密度（OD600）值在30~40之间，再以0.1~0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4-7.0之间，控制温度在35~40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成苹果酸。
进一步地，所述的菌种为产丁二酸重组大肠杆菌。
进一步地，所述的菌种为EscherichiacoliAFP111。
进一步地，所述步骤（4）中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的转化培养基为JSM-CN培养基。
进一步地，所述的JSM-CN培养基含有：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；Na2HPO4·7H2O3g·L-1；KH2PO48g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
进一步地，步骤（4）中所述的溶氧>20%，所述温度为33~36℃，所述pH在6.8~7.5之间。
本发明的有益效果在于：
本发明的技术方案以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成苹果酸，其转化率达到90%以上，提高了细胞的利用效率，有效节约了成本。
附图说明
图1苹果酸生产过程曲线图。
具体实施方式
本发明中所述的菌株及培养基：
菌株：EscherichiacoliAFP111，菌株来源为：Appliedandenvironmentalmicrobiology，2001，67(1)：148-154。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的DavidP.Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料，且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
培养基：
（1）LB种子液培养基：酵母粉5g·L-1；蛋白胨10g·L-1；NaCl5g·L-1；
（2）JSM发酵培养基：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；Na2HPO4·7H2O3g·L-1；KH2PO48g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；(NH4)2SO40.75g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
首先对转化过程的培养基进行了筛选，以JSM发酵培养基为参考，为解除葡萄糖效益，葡萄糖被除去，在此基础上去除磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（JSM-CP），磷酸氢二铵和氯化铵和硫酸铵（JSM-CN）以及去除MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，CuCl2·2H2O，MnSO4·H2O，CoCl2·6H2O，H3BO3，Al2(SO4)3·xH2O，Na2MoO4·2H2O，柠檬酸铁，VB1和生物素（JSM-CT）对转化的影响，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，转化12h后其结果见表1：
表1不同转化培养基对苹果酸合成的影响
| 培养基 | DCW（g L-1） | 丁二酸（g L-1） | 富马酸（g L-1） | 苹果酸（g L-1） |
| JSM | 16.4 | 20 | 0 | 0 |
| JSM-CP | 12.1 | 0 | 10.1 | 2.9 |
| JSM-CN | 11.2 | 0 | 1.4 | 18.1 |
| JSM-CT | 12.7 | 16.2 | 1.5 | 1.3 |
实施例2
考虑到产丁二酸重组大肠杆菌不同活性下对转化丁二酸的能力及产物分布有影响，因此选择了厌氧发酵12h，24h，36h，48h回收的细胞做转化，考察其对产物分布的影响。以JSM-CN为转化培养基，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，转化12h后其结果见表2。
表2不同活性细胞对苹果酸合成的影响
| 回收细胞时间 | DCW（g L-1） | 丁二酸（g L-1） | 富马酸（g L-1） | 苹果酸（g L-1） |
| 12h | 11.3 | 0 | 2.4 | 0.3 |
| 24h | 10.9 | 0 | 5.1 | 2.9 |
| 36h | 11.1 | 0 | 1.4 | 18.1 |
| 48h | 11.4 | 0 | 1.5 | 17.3 |
实施例3
依据前期试验结果，选择厌氧发酵36h回收的细胞，以JSM-CN为转化培养基，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，其转化过程曲线图如图1所示：
以上虽然已结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。本领域技术人员可在不脱离本发明的技术思想和主旨的范围内对这些实施方式进行适当的变更，而这些变更后的实施方式显然也包括在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6~8h，至菌体密度OD600值在0.6~0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先通空气有氧培养至菌体密度OD600值在30~40之间，再以0.1~0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4-7.0之间，控制温度在35~40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成苹果酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菌种为产丁二酸重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的转化培养基为JSM-CN培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的JSM-CN培养基含有：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；Na2HPO4·7H2O3g·L-1；KH2PO48g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的溶氧>20%，所述温度为33~36℃，所述pH在6.8~7.5之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述发酵产丁二酸过程为36小时。
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