CN105483167B - 一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁二酸三步骤，厌氧发酵采用电化学发酵，在发酵培养基中添加电子载体，并在阴极施加相应的电压值，所述电子载体的浓度为0.01‑0.5 mmol/L。所述电子载体为中性红或者核黄素。在阴极施加的阴极电压值通过循环伏安法在‑0.1V到1V之间进行扫描确定，扫描速度为5‑10 mV/s。厌氧条件下于电化学装置中发酵时，在电子载体的协助下胞内NADH总量有所提高，胞内还原力（NADH/NAD+）水平增加了2倍多，丁二酸积累量达到15.06g/L，有利于还原型产物丁二酸的高效合成。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，属于生物化工技术领域。
背景技术
对于不同碳源和产物而言，还原力供给和消耗水平并不总是一致，如1分子葡萄糖和1分子甘油经糖酵解途径转化为磷酸烯醇式丙酮酸时，均产生2分子NADH，若终产物为还原性较强的丁二酸或乙醇，当以葡萄糖为唯一碳源时，用于产物合成的还原力明显不足，降低了还原性产物的收率，而以甘油为碳源时，又会因为还原力过剩，菌体生长停滞。为了平衡胞内辅酶代谢，恢复菌体生长的同时增加还原型产物的收率，基因工程改造的方法最先被使用。Sánchez等（ Journal of Biotechnology, 2005, 117(4): 395-405）通过在大肠杆菌内过量表达来自酵母菌菌株的甲酸脱氢酶，增加了胞内NADH总量，还原性产物乙醇的量明显增加，同时副产物积累量有所减少。
随着代谢工程和合成生物学的迅猛发展，通过对宿主细胞进行基因工程改造，可以极大地促进目标代谢产物的合成，增加产量和收率。但是，在改造的同时，细胞的原有代谢途径受到影响，代谢不平衡会阻碍目标代谢物产量的进一步提升，尤其是还原型产物合成过程中辅酶不平衡的问题。通过引入辅酶相关代谢途径，如引入1,3-丙二醇或NAD+合成途径以降低胞内还原力水平，或以还原性较高的底物为碳源以增加胞内还原力水平，均可以在一定程度上调控胞内的辅酶平衡。但是代谢工程改造的同时会增加菌体的代谢负荷，对菌体生长及产物合成造成负面影响。
在电化学系统中，通过对阴阳两级或阴极施加某一特定的电压，体系中游离的电子载体可以从阴极电极获得电子被还原，处于还原态的电子载体会通过某种方式进入细胞周知空间，释放电子用于胞内代谢及NADH的再生，增加胞内的还原力水平。这样既可以避免因基因工程改造引起的菌株生长问题，又可以增加胞内还原力的供给。曹占平等（化工学报，2012，63(12)：4042-4047）通过电化学系统辅助微生物降解五氯酚时发现，电化学辅助微生物体系中存在着细胞与电极之间的电子传递，胞内NADH的增多有利于五氯酚的降解。
但是，不同的代谢物所需的还原力以及所需的电化学调控手段存在差异。在2,3-丁二醇的合成过程中，供给还原力的同时应该考虑电子及辅酶代谢平衡对细胞生长的影响，而对于1,4-丁二醇，增加了的还原力在很大范围内并不会导致胞内辅酶代谢不平衡现象，反而是越多的还原力越有利于其合成（Frontiers in Microbiology, 2015, 6: 575-592）。因此，必须根据目标代谢产物的性质和合成途径，将增加了的还原力水平控制在一定的水平，在提高还原性产物收率的同时，又不会因还原力过高而抑制细胞的生长。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，将电化学系统引入微生物发酵体系中用于调控胞内辅酶平衡，包括增加还原力总量(NAD(H))及平衡辅酶代谢（NADH/NAD+），在不达到抑制细胞生长阀值的情况下，提高产物丁二酸的产量。
为了实现本发明的技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁二酸三步骤，厌氧发酵采用电化学发酵，在发酵培养基中添加电子载体，并在阴极施加相应的电压值，所述电子载体的浓度为0.01-0.5 mmol/L。
所述电子载体为中性红或者核黄素。
在阴极施加的阴极电压值通过循环伏安法在-0.1V 到1V之间进行扫描确定，扫描速度为5-10 mV/s。
所述电化学发酵中阳极电解液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中添加氯化钠（0.1mol/L）以增加电解液的导电率，pH 6.5-7.5，浓度0.1-0.5mol/L。
所述发酵培养基为一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25 mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4 )3 1.77mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B120 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L。
电化学发酵时，阴极室内填充的发酵培养基中包含不同浓度的电子载体，并在阴极施加相应的电压值。当电子载体为中性红（NR）时，浓度为0.05mmol/L，阴极施加电压为-0.65 V。当电子载体为核黄素（VB2）时，浓度为0.1mmol/L，阴极施加电压为-0.21 V。
所述磷酸盐缓冲液中添加氯化钠以增加电解液的导电率，pH 7.0，浓度0.1mol/L。
所述菌株为任意可在厌氧条件下生长并可发酵积累丁二酸的菌株，包括但不限于大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111。
所述电化学发酵中，采用气密性良好的H-Cell微生物电解池装置，选用石墨碳毡作为阴阳两极电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作为参比电极，发酵培养基和磷酸盐缓冲液分别作为阴极和阳极电解液，并通过电子载体介导电子由电极向菌体的传递，通过外加电子载体的协助，将电子从阴极电极传递至细胞内部用于NADH再生。
阴极电势的施加采用一步调控或者分阶段调控的方法。本发明所述一步调控为将种子液接种到发酵培养基同时向阴极室施加电压；本发明所述分阶段调控为接种之后立刻通电，时长5-8小时，以便将氧化态电子载体转化为还原态；之后停止通电，每3小时取样，当菌体浓度开始增长时，菌株由停滞期迅速进入对数生长期，此时再次通电以促进胞内NADH的再生。
前期通电将氧化性中性红还原，减少毒性作用，被还原之后停止通电，降低胞内还原力，回复菌株生长能力，到达对数期后再次通电，促进还原力再生，增加丁二酸的合成通过电化学手段的调控，胞内NADH的量有所增加，分阶段条件下，NADH的增加与细胞生长、丁二酸的合成过程相平衡，丁二酸产量最高。
所述菌株为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111，厌氧条件下于电化学装置中发酵时，通过采用两阶段发酵模式，在电子载体的协助下胞内NADH总量有所提高，胞内还原力（NADH/NAD+）水平增加了2倍多，有利于还原型产物丁二酸的高效合成。
本发明所述的菌种活化、种子培养步骤是常规的菌种活化方法及种子培养方法，本发明中将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111菌株经固体平板培养基活化后，37℃，有氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液；
将所述种子液按照10%（v/v）的接种量接种于所述发酵培养基中，添加不同浓度的电子载体，充二氧化碳，并在37℃厌氧培养48小时考察不同电子载体浓度下菌株生长情况。
优选地，所述充二氧化碳均为向装置中通入无菌二氧化碳2分钟，以保证培养时的厌氧环境。
优选地，在分阶段调控策略实施中，当菌体进入对数生长期时开始通电，增加胞内还原力（NADH/NAD+）的同时，平衡细胞生长和丁二酸合成。
优选地，所述固体平板培养基和种子培养基的配方为：蛋白胨 10 g·L-1，酵母粉5 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，琼脂粉15-20 g·L-1。
本发明通过采用电化学调控手段，动态调控了胞内还原力水平，与不通电条件下产丁二酸实验相比，其有益效果在于：
本发明所用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111菌株可以在发酵培养基中，以葡萄糖为唯一碳源在纯厌氧条件下生长、合成并积累丁二酸：在厌氧条件下发酵48小时后丁二酸积累量可达10.38g/L；当进行电化学发酵时，在一步施加-0.65V的电压并添加有0.05mmol/L中性红的条件下，胞内NADH总量提高28.75%，NADH/NAD+提高了67.50%，证明电化学可以应用于胞内NADH的再生。但是胞内过高的还原力会抑制细胞生长，丁二酸产量降低，因此，采用分阶段调控策略平衡胞内还原力水平。在分阶段发酵调控过程中，前期NADH/NAD+处于较低的水平，后期施加-0.65V将NADH/NAD+提高到1.21，相比一阶段电化学调控时有所下降，在此种发酵模式下丁二酸积累量达到最大值，产量达到15.06g/L，相比对照实验组丁二酸产量增加了45.09%。由此可见，通过电化学手段可以调控胞内辅酶总量及比例，可以提高还原性产物丁二酸的产量，因此本发明方法具有重大的社会意义和经济价值。
附图说明
图1.不同电子载体浓度下菌株的生长性能
厌氧条件下，通过向发酵体系中添加不同类别、不同浓度的电子载体，考察不同电子载体在不同浓度下对大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111生长的影响:从图中可以看出，中性红对细胞生长具有毒性作用，当浓度超过0.05mmol/L时，严重抑制菌体的生长；而对于核黄素，当浓度为0.1mmol/L时，菌体生长最高。因此，优选两种电子载体的浓度分别为0.05mmol/L中性红及0.1mmol/L核黄素。
图2.H-cell 微生物电解池装置示意图
在外加电势的推动作用下，氧化态电子载体在电极表面被阴极电极产生的电子还原，还原态的电子载体通过某种方式跨过细胞外膜进入周质空间，再次将电子传递给NAD+用于NADH的再生。
图3.0.05mmol/L中性红存在条件下的循环伏安曲线
在-0.1V 到1V 之间对含有0.05mmol/L中性红的发酵体系进行循环伏安扫描以确定阴极反应电势。从图中可以看出，当体系中存在中性红时，CV曲线会出现明显的氧化峰（下）及还原峰（上），还原峰所对应的电势（虚线处）在-0.65V附近。因此，优选阴极施加电势为-0.65V。
图4.0.1mmol/L核黄素存在条件下的循环伏安曲线
在-0.1V 到0.7V 之间对含有0.1mmol/L核黄素的发酵体系进行循环伏安扫描以确定阴极反应电势。从图中可以看出，当体系中存在核黄素时，CV曲线会出现明显的氧化峰（下）及还原峰（上），还原峰所对应的电势（虚线处）在-0.21V附近。因此，优选阴极施加电势为-0.21V。
具体实施方式
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111 菌种由D.P. Clark教授惠赠，保存于本实验室，且该菌株已处于公知公用状态，于非专利文献发表，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要，南京工业大学可对外提供。
本发明中将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111菌株通过固体平板培养基培养后接种至种子培养基中培养得到种子液；然后将种子液接种到发酵培养基中，并通过电化学调控，检测胞内NADH及NAD+水平。所述方法可以包括以下步骤：
（1）大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111菌株经固体平板培养基活化后转接至试管，37℃，有氧条件下培养12-14小时后转接于种子培养基，在37℃，200转/分钟的条件下培养6-8小时得到种子液；
（2）将上述种子液按照10%(v/v)的接种量接种于含有发酵培养基的电化学装置(电化学装置见图2所示)中，充二氧化碳，并在37℃厌氧培养。
（3）在发酵培养基中添加电子载体后，通过电化学工作站一步或分阶段对阴极室施加-0.1V~1V的电压，以促进胞内NADH的再生。
（4）在发酵过程中每隔4小时进行无菌取样，对样品离心后分别提取细胞内部的NADH及NAD+，并通过分光光度法进行定量检测。
根据以下实施例，可以更好的理解本发明。实施案例中所描述的具体的物料配比，工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
本实施例说明将大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行厌氧发酵的方法。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111作为出发菌株，以1%（v/v）接种量接种于含有5mL种子培养基中的试管中培养，37℃，200r/min培养12h得到一级种子液；将一级种子液以1%（v/v）的接种量接种到装有100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200r/min培养6h得到二级种子液。将二级种子液以10%（v/v）的接种量接种于含有450mL发酵培养基的700mL恒化器装置中，与此同时，向恒化器内持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样，检测培养装置中菌体的密度；将样品离心后收集并裂解菌体，提取NADH及NAD+，上清液保留，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L。检测的有机酸产量和辅因子浓度如表1所示。
表1 厌氧发酵48h后有机酸及辅因子浓度
| 有机酸 | 浓度（g/L） | 辅因子 | 浓度（μmol/g） |
| 丁二酸 | 10.38 | NADH | 35.20 |
| 乙酸 | 3.93 | NAD+ | 44.48 |
| 丙酮酸 | 1.50 | NAD/NAD+ | 0.80 |
实施例2
本实施例说明在-0.65V和添加有0.05mmol/L的中性红条件下利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行一步法电化学厌氧发酵的方法。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行一步法电化学厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111作为出发菌株，以1%（v/v）接种量接种于含有5mL种子培养基中的试管中培养，37℃，200r/min培养12h得到一级种子液；将一级种子液以1%（v/v）的接种量接种到装有100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200r/min培养6h得到二级种子液。将二级种子液以10%（v/v）的接种量接种于含有450mL发酵培养基的700mL阴极室中，与此同时，向阴极室施加-0.65V电压并持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样，检测培养装置中菌体的密度；将样品离心后收集并裂解菌体，提取NADH及NAD+，上清液保留，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L，中性红0.05mmol/L。检测有机酸产量和辅因子浓度如表2所示。
表2 一步法电化学厌氧发酵48h后有机酸和辅因子浓度
| 有机酸 | 浓度（g/L） | 辅因子 | 浓度（μmol/g） |
| 丁二酸 | 10.09 | NADH | 45.32 |
| 乙酸 | 2.37 | NAD+ | 33.91 |
| 丙酮酸 | 1.65 | NAD/NAD+ | 1.34 |
实施例3
本实施例说明在-0.65V和添加有0.1mmol/L的核黄素条件下利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行一步法电化学厌氧发酵的方法。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行一步法电化学厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111作为出发菌株，以1%（v/v）接种量接种于含有5mL种子培养基中的试管中培养，37℃，200r/min培养12h得到一级种子液；将一级种子液以1%（v/v）的接种量接种到装有100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200r/min培养6h得到二级种子液。将二级种子液以10%（v/v）的接种量接种于含有450mL发酵培养基的700mL阴极室中，与此同时，向阴极室施加-0.21V电压并持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。发酵过程中定时无菌取样，检测培养装置中菌体的密度；将样品离心后收集并裂解菌体，提取NADH及NAD+，上清液保留，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L，核黄素0.1mmol/L。检测的菌体密度、有机酸产量和辅因子浓度如表3所示。
表3 一步法电化学厌氧发酵48h后有机酸和辅因子浓度
| 有机酸 | 浓度（g/L） | 辅因子 | 浓度（μmol/g） |
| 丁二酸 | 9.94 | NADH | 41.33 |
| 乙酸 | 2.76 | NAD+ | 35.76 |
| 丙酮酸 | 1.93 | NAD/NAD+ | 1.16 |
实施例4
本实施例说明在-0.65V和添加有0.05mmol/L的中性红条件下利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行分阶段电化学调控厌氧发酵的方法。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行分阶段电化学调控厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111作为出发菌株，以1%（v/v）接种量接种于含有5mL种子培养基中的试管中培养，37℃，200r/min培养12h得到一级种子液；将一级种子液以1%（v/v）的接种量接种到装有100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200r/min培养6h得到二级种子液。将二级种子液以10%（v/v）的接种量接种于含有450mL发酵培养基的700mL阴极室中。接种完毕后向阴极室通电（-0.65V）6小时，之后断电以促进菌株生长。在之后的发酵过程中每3小时进行无菌取样，检测培养装置中菌体的浓度，当菌体由延滞期进入对数生长期时，再次向阴极室施加-0.65V电压并持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。将定期取得的样品离心后收集并裂解菌体，提取NADH及NAD+，上清液保留，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L，中性红0.05mmol/L。检测的菌体密度、有机酸产量和辅因子浓度如表4所示。
表4 分阶段电化学调控厌氧发酵48h后有机酸和辅因子浓度
| 有机酸 | 浓度（g/L） | 辅因子 | 浓度（μmol/g） |
| 丁二酸 | 15.06 | NADH | 47.73 |
| 乙酸 | 4.49 | NAD+ | 39.42 |
| 丙酮酸 | 0.05 | NAD/NAD+ | 1.21 |
实施例5
本实施例说明在-0.21V和添加有0.1mmol/L的核黄素条件下利用大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行分阶段电化学调控厌氧发酵的方法。
大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111进行分阶段电化学调控厌氧发酵方法如下：
将冻存管中的大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111作为出发菌株，以1%（v/v）接种量接种于含有5mL种子培养基中的试管中培养，37℃，200r/min培养12h得到一级种子液；将一级种子液以1%（v/v）的接种量接种到装有100mL种子培养基的500mL三角摇瓶中，37℃，200r/min培养6h得到二级种子液。将二级种子液以10%（v/v）的接种量接种于含有450mL发酵培养基的700mL阴极室中，接种完毕后向阴极室通电（-0.21V）6小时，之后断电以促进菌株生长。在之后的发酵过程中每3小时进行无菌取样，检测培养装置中菌体的浓度，当菌体由延滞期进入对数生长期时，再次向阴极室施加-0.21V电压并持续通入无菌二氧化碳以维持厌氧环境。将定期取得的样品离心后收集并裂解菌体，提取NADH及NAD+，上清液保留，通过高效液相色谱检测有机酸含量。
其中，所述的种子培养基的配方为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L。
所述发酵培养基的配方为：一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L，核黄素0.1mmol/L。检测的菌体密度、有机酸产量和辅因子浓度如表5所示。
表5 分阶段电化学调控厌氧发酵48h后有机酸和辅因子浓度
| 有机酸 | 浓度（g/L） | 辅因子 | 浓度（μmol/g） |
| 丁二酸 | 13.96 | NADH | 45.60 |
| 乙酸 | 4.12 | NAD+ | 40.03 |
| 丙酮酸 | 1.37 | NAD/NAD+ | 1.14 |
Claims (4)
1.一种基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，包括菌种活化、种子培养、厌氧发酵生产丁二酸三步骤，其特征在于，厌氧发酵采用电化学发酵，在发酵培养基中添加电子载体，并在阴极施加相应的电压值；所述菌种为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）AFP111菌株，所述电子载体为中性红或者核黄素；
发酵采用分阶段调控模式，接种之后立刻通电，时长6-8小时，将氧化态电子载体转化为还原态；之后停止通电，每3小时取样，当菌体浓度开始增长时，菌株由停滞期迅速进入对数生长期，此时再次通电以促进胞内NADH的再生；
当电子载体为中性红时，浓度为0.05mmol/L，阴极施加电压为-0.65 V；当电子载体为核黄素时，浓度为0.1mmol/L，阴极施加电压为-0.21 V。
2.根据权利要求1所述的基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，其特征在于，所述电化学发酵中阳极电解液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的pH6.5-7.5，浓度0.1-0.5mol/L，所述磷酸盐缓冲液中添加氯化钠以增加电解液的导电率。
3. 根据权利要求1所述的基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，其特征在于，所述发酵培养基为一水合柠檬酸 3 g·L-1，Na2HPO4·12H2O 4 g·L-1，KH2PO4 8 g·L-1，(NH4)2HPO4 8 g·L-1，NH4Cl 0.2 g·L-1，(NH4)2SO4 0.75 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，CaCl2·2H2O 10.0 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.5 mg·L-1，CuCl2·2H2O 0.25mg·L-1，MnSO4·H2O 2.5 mg·L-1，CoCl2·6H2O 1.75 mg·L-1，H3BO3 0.12 mg·L-1，Al2(SO4)3 1.77 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.5 mg·L-1，柠檬酸铁 16.1 mg·L-1，生物素2 mg·L-1，维生素B1 20 mg·L-1，葡萄糖30-40g/L。
4.根据权利要求2所述的基于电化学系统调控细胞内还原力再生发酵产丁二酸的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH 7.0，浓度0.1mol/L。
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| US20130081947A1 (en) * | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Uchicago Argonne, Llc | Bioprocess utilizing carbon dioxide and electrodeionization |
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| 丁二酸生产工艺技术进展;杨如惠等;《合成技术及应用》;CNKI;20150630;第30卷(第2期);第33-39页 * |
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