CN105543295A - 一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用低活性丁二酸菌体细胞转化丁二酸为富马酸的方法，具体步骤包括菌种活化，种子液制备，发酵产丁二酸，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成富马酸。办发明所述应用目前尚无报道，与其他生物发酵生产富马酸工艺相比，该方法其底物转化率在92%以上，有效利用了低活性丁二酸菌体细胞，大大降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法，通过对微生物进行特定的菌种活化、种子液制备后，进行厌氧发酵生产丁二酸发酵结束后收集菌体细胞，在以丁二酸钠为底物的特定培养基和培养环境下，有氧转化合成富马酸。
背景技术
富马酸（又称延胡索酸）作为一种重要的四碳平台化合物，在医药、食品以及表面活性剂等行业有着广泛的用途，可以通过酶催化转化、酯化、加氢等工艺生产L-天冬氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、1,4-丁二醇、γ-丁内酯和四氢呋喃等四碳化合物。目前富马酸主要通过顺丁烯二酸酐异构化和糠醛氧化法生产，化学合成富马酸因成本高和环境污染等原因使得富马酸作为基本化工原料的广泛应用受到限制。
富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、酵母及细菌。其中根霉菌Rhizopus为重点研究的对象，具体包括米根霉Rhizopusoryzae、少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在这一时期，我国科学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53.15g/L，得率为45%，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要11天左右（食品与发酵工业，1988）。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，98g/L初始葡萄糖发酵48h，其富马酸产量为33g/L，得率为33.7%（BioprocessBiosystEng,2002,25:179～181）。
发酵法生产富马酸可以利用可再生资源和二氧化碳，不仅摆脱了对石化原料的依赖，而且开辟了温室气体二氧化碳利用的新途径。因此，以微生物发酵法生产富马酸的研究与开发正在美国、日本等国家深入地进行着。但霉菌生长速度慢，产品生产强度偏低。开发对营养条件需求简单、生长迅速、收率高的C4有机酸生产菌株是加速生物法替代石化法生产的关键。
利用大肠杆菌来发酵生产富马酸，是利用了大肠杆菌生长快速、生长周期短、培养条件简单、安全性好、价格低廉等诸多优点，实现富马酸优质高产工业化生产的方向。目前尚无利用该菌株生产富马酸的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是在产丁二酸重组大肠杆菌发酵结束时，通过一种温和、高效的方法回收菌体细胞，并最终能够转入新鲜培养基中以丁二酸钠为原料转化合成富马酸。
为实现本发明的技术目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法，包括以下步骤：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6~8h，至菌体密度OD600值在0.6~0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体密度OD600值在30~40之间，再以0.1~0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4-7.0之间，控制温度在35~40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成富马酸。
所述的菌种为产丁二酸重组大肠杆菌。
进一步地，所述的菌种为EscherichiacoliAFP111。
所述步骤（4）中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的特定培养基为JSM-CP培养基。该JSM-CN培养基含有：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；(NH4)2SO40.75g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
进一步地，步骤（4）中所述的溶氧>20%，所述温度为33~36℃，所述pH在6.8~7.5之间。
进一步地，步骤（3）中所述发酵产丁二酸过程为48小时。
本发明的有益效果在于：
本发明的技术方案，以回收的低活性的产丁二酸重组大肠杆菌为催化剂，丁二酸钠为底物，有氧转化合成富马酸，其转化率达到92%以上，低活性丁二酸菌体细胞，提高了细胞的利用效率，有效节约了成本。
附图说明
图1富马酸生产过程曲线图。
具体实施方式
本发明中所述的菌株及培养基：
菌株：EscherichiacoliAFP111，菌株来源为：Appliedandenvironmentalmicrobiology，2001，67(1)：148-154。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的DavidP.Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料，且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
培养基：
（1）LB种子液培养基：酵母粉5g·L-1；蛋白胨10g·L-1；NaCl5g·L-1；
（2）JSM发酵培养基：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；Na2HPO4·7H2O3g·L-1；KH2PO48g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；(NH4)2SO40.75g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。
实施例1
首先对转化过程的培养基进行了筛选，以JSM发酵培养基为参考，为解除葡萄糖效益，葡萄糖被除去，在此基础上去除磷酸氢二钠和磷酸二氢钾（JSM-CP），磷酸氢二铵和氯化铵和硫酸铵（JSM-CN）以及去除MgSO4·7H2O，CaCl2·2H2O，ZnSO4·7H2O，CuCl2·2H2O，MnSO4·H2O，CoCl2·6H2O，H3BO3，Al2(SO4)3·xH2O，Na2MoO4·2H2O，柠檬酸铁，VB1和生物素（JSM-CT）对转化的影响，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，转化12h后其结果见表1：
表1不同转化培养基对富马酸合成的影响
| 培养基 | DCW（g L-1） | 丁二酸（g L-1） | 富马酸（g L-1） | 苹果酸（g L-1） |
| JSM | 16.4 | 20 | 0 | 0 |
| JSM-CP | 12.1 | 0 | 10.1 | 2.9 |
| JSM-CN | 11.2 | 0 | 1.4 | 18.1 |
| JSM-CT | 12.7 | 16.2 | 1.5 | 1.3 |
实施例2
考虑到产丁二酸重组大肠杆菌不同活性下对转化丁二酸的能力及产物分布有影响，因此选择了厌氧发酵12h，24h，36h，48h回收的细胞做转化，考察其对产物分布的影响。以JSM-CP为转化培养基，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，转化12h后其结果见表2：
表2不同活性细胞对富马酸合成的影响
| 回收细胞时间 | DCW（g L-1） | 丁二酸（g L-1） | 富马酸（g L-1） | 苹果酸（g L-1） |
| 12h | 11.3 | 0 | 2.4 | 0.3 |
| 24h | 10.9 | 0 | 5.1 | 2.9 |
| 36h | 11.1 | 0 | 10.5 | 3.1 |
| 48h | 11.4 | 0 | 17.8 | 2.3 |
实施例3
依据前期试验结果，选择厌氧发酵48h回收的细胞，以JSM-CP为转化培养基，维持>40%的溶氧，温度及发酵液pH值分别控制在35℃和6.8，初始细胞干重DCW在10，添加的底物丁二酸钠折合丁二酸的质量浓度为20gL-1，其转化过程曲线图如图1所示：
以上虽然已结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但是需要指出的是，本发明的保护范围并不受这些具体实施方式的限制，而是由权利要求书来确定。本领域技术人员可在不脱离本发明的技术思想和主旨的范围内对这些实施方式进行适当的变更，而这些变更后的实施方式显然也包括在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用低活性丁二酸生产菌株转化合成富马酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）菌种活化：从甘油冻存管中取菌液，在LB平板上划线后放置于37℃下培养12h；
（2）种子液制备：从LB平板上取单菌落，接种于LB液体培养基，在37℃，200r/min条件下摇瓶培养6~8h，至菌体密度OD600值在0.6~0.8之间；
（3）发酵产丁二酸过程：按3~10%的接种量接种发酵培养基，先同空气有氧培养至菌体密度OD600值在30~40之间，再以0.1~0.2vvm的通气流量连续通二氧化碳气体维持发酵罐中厌氧环境，并以碳酸钠作为酸中和剂控制pH值在6.4-7.0之间，控制温度在35~40℃；
（4）在一次厌氧发酵结束时，回收菌体细胞，在转化培养基中维持溶氧，温度及发酵液pH值，以丁二酸二钠为底物，转化合成富马酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的菌种为产丁二酸重组大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中厌氧发酵结束时，回收的菌体细胞转化采用的特定培养基为JSM-CP培养基。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的JSM-CN培养基含有：葡萄糖40g·L-1；柠檬酸3g·L-1；(NH4)2HPO48g·L-1；NH4Cl0.2g·L-1；(NH4)2SO40.75g·L-1；MgSO4·7H2O1.00g·L-1；CaCl2·2H2O10.0mg·L-1；ZnSO4·7H2O0.5mg·L-1；CuCl2·2H2O0.25mg·L-1；MnSO4·H2O2.5mg·L-1；CoCl2·6H2O1.75mg·L-1；H3BO30.12mg；Al2(SO4)3·xH2O1.77mg·L-1；Na2MoO4·2H2O0.5mg·L-1；柠檬酸铁16.1mg·L-1；VB120·mgL-1；生物素2mg·L-1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的溶氧>20%，所述温度为33~36℃，所述pH在6.8~7.5之间。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述发酵产丁二酸过程为48小时。
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| CN104975050A (zh) * | 2014-04-10 | 2015-10-14 | 中国石化扬子石油化工有限公司 | 一种富马酸的制备方法 |
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