CN103642859A - 一种用于提高卷枝毛霉产γ-亚麻酸产量的发酵培养基及用途 - Google Patents
一种用于提高卷枝毛霉产γ-亚麻酸产量的发酵培养基及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基，它含有酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源，还涉及使用所述发酵培养基提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法。该方法包括菌种活化、种子培养、发酵培养与烘干等步骤。采用本发明得到的卷枝毛霉CBS108.16菌体生物量达到16.5～19.8g/L，比对照组提高25～52%；脂肪酸含量达到24～35%，比对照组提高11～48%；发酵液中γ-亚麻酸含量达到810～1300mg/L，比对照组提高41～124%。本发明方法操作工艺简便，加工设备要求低，产量提高效果显著，因此具有广阔的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明属于微生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基，还涉及使用所述发酵培养基提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法。
【背景技术】
γ-亚麻酸(顺式-6,9,12-十八碳三烯酸)作为一种重要的不饱和脂肪酸，它是组成人体各组织生物膜的结构材料，也是合成前列腺素的前体。γ-亚麻酸在营养保健方面有重要的作用，它能够抗心血管疾病，降血脂，降血糖，抗癌以及美白和抗皮肤老化，其潜在的药用价值受到广泛的关注。
天然的γ-亚麻酸主要存在于琉璃苣、月见草和黑加仑中，其中油脂中γ-亚麻酸含量分别为22%、8%、16%。但是，植物种子采集困难，产量低，受气候地区的影响较大，且生产周期长，现已不能满足市场的需求。与这些传统的富含γ-亚麻酸的植物相比，微生物拥有生长速率快，培养条件简单，不依赖天气等优点。因此，用微生物来替代传统植物生产γ-亚麻酸具有广阔的前景。卷枝毛霉，作为富含γ-亚麻酸的一种微生物，其γ-亚麻酸含量约为15～18%，在上世纪已被作为生产γ-亚麻酸的模式菌株。
微生物培养基中的氮源是其生长必不可少的营养成分，也对一些活性物质的产量起着重要的重要，其中对微生物油脂积累的影响已被广泛研究。而氨基酸作为重要的氮源，能够直接参与蛋白质的合成，已有文献报道它们能调控酿酒酵母的基因表达水平，另外，氨基酸和它们的一些代谢产物也能调控其它代谢过程。
目前，对于添加氨基酸为氮源来提高γ-亚麻酸产量的研究在国内外并不多见。本发明以卷枝毛霉CBS108.16为出发菌株，以氨基酸为营养氮源提高其γ-亚麻酸产量。
【发明内容】
[要解决的技术问题]
本发明的目的是提供一种用于提高卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述发酵培养基提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法。
[技术方案]
本发明是通过下述技术方案实现的。
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基。
所述的发酵培养基含有一种或多种选自酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源。
所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.3～3g/L。
根据本发明的一种优选实施方式，所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.5～2.6g/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，除氨基酸外，它还含有其它的有机氮源，其它有机氮源的浓度以N元素计是0～0.2g/L。
根据本发明的另一种优选实施方式，其它的有机氮源是酵母粉、尿素或蛋白胨。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3.0g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0.01～2.0g/L酵母粉、尿素或蛋白胨、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法。
该方法的步骤如下：
A、菌种活化
按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液与活化培养基的体积比1:1000～2000，将卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入装有活化培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种活化菌种液；
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的5～15%，将所述的活化菌种液接入装有种子培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种种子培养液；
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的5～15%，将所述的种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，在通气流量1～3L/min、pH为5.0～7.0、温度25～35℃与转速500～1000rpm的条件下恒温培养80～120h，得到一种发酵培养液；
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度60～105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。
根据本发明的一种优选实施方式，所述的活化培养基与种子培养基组成如下：30g/L葡萄糖、3.3g/L酒石酸铵、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、1.5g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0～2g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的卷枝毛霉CBS108.16菌液含有810～1300mg/Lγ-亚麻酸。
根据本发明的另一种优选实施方式，所述的卷枝毛霉CBS108.16菌体含有以该菌体总重量计24～35%脂肪酸。
下面将更详细地描述本发明。
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基。
本发明使用的卷枝毛霉CBS108.16是从荷兰微生物菌种保藏中心商业途径获得的，其保藏号CBS108.16。
首先，按照下述方式培养卷枝毛霉CBS108.16，并就各种氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸的影响进行了研究：
A、菌种活化
按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液与活化培养基的体积比1:1000～2000，将卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入装有活化培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种活化菌种液；
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的5～15%，将所述的活化菌种液接入装有种子培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种种子培养液；
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的5～15%，将所述的种子培养液接入装了含有氨基酸的发酵培养基的发酵罐中，在通气流量1～3L/min、pH为5.0～7.0、温度25～35℃与转速500～1000rpm的条件下恒温培养80～120h，得到一种发酵培养液；
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度60～105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。
采用上述培养方法研究了氨基酸对该菌生长、产脂、γ-亚麻酸产量的影响：
1、氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16生长的影响
卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸产量与其生长密切相关，因此，本发明收集上述发酵菌体，通过称重法（Song,Y.,Wynn,J.P.,Li,Y.,Grantham,D.&Ratledge,C.(2001).Apregeneticstudyoftheisoformsof malic enzyme associated with lipid accumulation in Mucorcircinelloides.Microbiology147,1507–1515.）测得卷枝毛霉CBS108.16在以不同氨基酸为氮源时的生物量，其结果列于图1。这些结果清楚地表明，与对照组相比，脯氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酸，尤其是酪氨酸和天冬氨酸，显著促进卷枝毛霉CBS108.16的生长，而缬氨酸，苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺或赖氨酸对其生长不利，其它氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16生长影响不大。
2、氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16总脂肪积累的影响
γ-亚麻酸产量与其总脂肪酸含量相关。为了研究氨基酸对总脂肪积累的影响，本发明采用有机溶剂提取与气相色谱分析的方法，对上述发酵菌体的总脂肪酸进行了分析，得到在不同氨基酸下卷枝毛霉CBS108.16总脂肪酸的含量，其结果列于图2。这些结果表明，与对照组相比，酪氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸能够显著提高卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸含量。
3、氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸组分的影响
由表1的数据知道，氨基酸可以影响卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸的组分，而脂肪酸组分中γ-亚麻酸含量也影响着其产量。这些结果表明亮氨酸、色氨酸、蛋氨酸显著减少了脂肪酸中γ-亚麻酸的含量，虽然缬氨酸增加了卷枝毛霉CBS108.16脂肪酸中γ-亚麻酸的含量，但是由于缬氨酸不利于卷枝毛霉CBS108.16的生长，因此其γ-亚麻酸产量依然很低。
表1：以不同氨基酸作为氮源，在发酵培养后卷枝毛霉CBS108.16的脂肪酸的组成
4、氨基酸对卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸产量的影响
卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸产量的结果列于图3。这些结果表明酪氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸可以有效提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸的产量，其中酪氨酸能够显著提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸产量，其产量与对照组（以酒石酸铵为氮源）相比提高了约120%（图3）。
5、酪氨酸对脂肪积累相关酶活的影响
为了分析酪氨酸能够显著提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸产量的原因，本发明比较分析了以酪氨酸和酒石酸为氮源时脂肪积累相关酶活的差异性(图4)，结果表明，酪氨酸显著提高了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活力，为脂肪积累提供了更多的还原力，同时酪氨酸也提高了柠檬酸裂解酶的活力，为脂肪积累提供更多的乙酰辅酶A。
上述结果非常清楚地表明，在发酵培养基中添加酪氨酸、天冬酰胺或者天冬氨酸作为氮源，有效提高了提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸的产量，其操作简单，其中酪氨酸提高γ-亚麻酸产量最为显著，其产量与对照组（以酒石酸铵为氮源）相比提高了约120%，其γ-亚麻酸产量能达到810～1300mg/L。
因此，在所述的发酵培养基中使用一种或多种选自酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸作为培养卷枝毛霉CBS108.16的氮源。
所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.3～3g/L。
根据本发明的一种优选实施方式，所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.5～2.6g/L。
具体地，所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3.0g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0.01～2.0g/L酵母粉、尿素或蛋白胨、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
本发明涉及一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法。
该方法的步骤如下：
A、菌种活化
按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液与活化培养基的体积比1:1000～2000，将卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入装有活化培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种活化菌种液。
本发明使用的活化培养基组成如下：30g/L葡萄糖、3.3g/L酒石酸铵、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、1.5g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
在所述的活化培养基中，葡萄糖、酒石酸铵、酵母粉等都是目前市场上销售的产品。
所述卷枝毛霉CBS108.16孢子液与活化培养基的体积比优选地是1:1200～1800；更优选地是1:1400～1600。
所述的菌种活化优选地是在温度28～32℃与转速140～160rpm的条件下恒温培养20～26h。
在这个步骤以及后续步骤中，进行活化培养所使用的摇床都是目前市场上销售的产品，例如由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的产品。
所述的带挡板三角瓶是生物实验室里通常使用的一种微生物培养器皿。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的5～15%，将所述的活化菌种液接入装有种子培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种种子培养液。
步骤A得到的活化菌种液体积优选地是种子培养基体积的7～13%，更优选地是8～12%。
这个步骤使用的种子培养基、摇床与上述活化培养基、摇床相同，因此在此不再赘述。
在这个步骤中，所述的种子培养优选地是在温度28～32℃与转速140～160rpm的条件下恒温培养20～26h。
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的5～15%，将所述的种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，在通气流量1～3L/min、pH为5.0～7.0、温度25～35℃与转速500～1000rpm的条件下恒温培养80～120h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0～2g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
在所述的发酵培养基中，酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、酵母粉等都是目前市场上销售的产品。
步骤B得到的种子培养液体积优选地是发酵培养基体积的7～12%，更优选地是8～10%。
所述的发酵培养优选地是在通气量为发酵培养基体积的1～8倍、pH为5.0～7.0、温度28～32℃与转速600～800rpm的条件下恒温培养90～110h。
所述的发酵罐是一种对发酵培养基物料进行机械搅拌与发酵的设备。该设备通常配备搅拌、通气、加热、冷却与温度控制系统等装置。本发明使用的发酵罐是目前市场上销售的产品，例如由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的产品。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度60～105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。
本发明使用的过滤设备与烘干设备都是目前市场上销售的产品。
采用有机溶剂萃取的方法（Folch,J.,Lees,M.&Sloane-Stanley,G.H.(1957).Asimple method for the isolation of total lipides fromanimaltissues.J Biol Chem226,497-509.），在气相色谱条件下测定了所得到的卷枝毛霉CBS108.16菌体，它含有以该菌体总重量计24～35%脂肪酸。通过换算得到卷枝毛霉CBS108.16发酵液中含有810～1300mg/Lγ-亚麻酸。
本发明通过添加酪氨酸、天冬酰胺或者天冬氨酸作为氮源，可以有效地提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸的产量，本发明的卷枝毛霉CBS108.16菌体以氨基酸为氮源的生物量达到16.5～19.8g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了30～52%。本发明的卷枝毛霉CBS108.16菌体以氨基酸为氮源的脂肪酸含量达到24～35%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了11～48%；以氨基酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到810～1300mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了41～124%。本发明方法操作工艺简便，加工设备要求低，产量提高效果显著，因此具有广阔的应用前景。
[有益效果]
本发明的有益效果是：本发明通过添加酪氨酸、天冬酰胺或者天冬氨酸作为氮源，可以有效地提高卷枝毛霉CBS108.16γ-亚麻酸的产量。本发明的卷枝毛霉CBS108.16菌体以氨基酸为氮源的生物量达到16.5～19.8g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了30～52%。本发明的卷枝毛霉CBS108.16菌体以氨基酸为氮源的脂肪酸含量达到24～35%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了11～48%；以氨基酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到810～1300mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了41～124%。本发明方法操作工艺简便，加工设备要求低，产量提高效果显著，因此具有广阔的应用前景。
【附图说明】
图1为以不同氨基酸作为氮源，发酵培养后卷枝毛霉CBS108.16的菌体干重(g/L)。
其中酒石酸铵是对照组，没有相同字母上标的组之间有显著性差异（P<0.05）。
图2为以不同氨基酸作为氮源，发酵培养后卷枝毛霉CBS108.16的细胞中总脂肪酸占菌体干重的比例。
其中酒石酸铵是对照组，没有相同字母上标的组之间有显著性差异（P<0.05）。
图3为以不同氨基酸作为氮源，发酵培养后卷枝毛霉CBS108.16的发酵液中γ-亚麻酸的含量。
其中酒石酸铵是对照组，没有相同字母上标的组之间有显著性差异（P<0.05）。
图4为酪氨酸对油脂积累相关酶的影响。
其中酒石酸铵是对照组，*表示组之间有显著性差异（P<0.05）。
【具体实施方式】
通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
实施例1：
A、菌种活化
在无菌条件下，从-80℃超低温冰箱中取出卷枝毛霉CBS108.16孢子甘油管，吸取100μL接入盛有150mL下述活化培养基的带挡板三角瓶中，在由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的摇床中，在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养恒温培养24h，得到一种活化菌种液。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的10%，将所述的活化菌种液接入装有150mL种子培养基的带挡板三角瓶中，在所述的摇床中在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养24h，得到一种种子培养液。
所述的活化培养基与种子培养基组成如下：30g/L葡萄糖、3.3g/L酒石酸铵、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、1.5g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的10%，将所述的种子培养液接入装有4L下述发酵培养基的由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的发酵罐中，在通气流量2L/min、pH6.0、温度30℃与转速700rpm的条件下恒温培养120h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：120g/L葡萄糖、以N元素计1g/L酪氨酸（对照为酒石酸铵）、1.5g/L酵母粉、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。该菌体以酪氨酸为氮源的生物量达到19.8g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了52%。
采用本说明书中描述的方法，得到的菌体采用有机溶剂萃取，再用气相测脂肪酸组分，以酪氨酸为氮源的脂肪酸含量达到以该菌体总重量计32%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了45%，以酪氨酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到1262mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了122%。
实施例2：
A、菌种活化
在无菌条件下，从-80℃超低温冰箱中取出卷枝毛霉CBS108.16孢子甘油管，吸取100μL接入盛有100mL下述活化培养基的带挡板三角瓶中，在由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的摇床中，在温度30℃与转速200rpm的条件下恒温培养恒温培养16h，得到一种活化菌种液。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的10%，将所述的活化菌种液接入装有150mL种子培养基的带挡板三角瓶中，在所述的摇床中在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养16h，得到一种种子培养液。
所述的活化培养基与种子培养基组成与实施例1的相同
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的5%，将所述的种子培养液接入装有4L下述发酵培养基的由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的发酵罐中，在摇床中在通气流量2L/min、pH6.0、温度30℃与转速700rpm的条件下恒温培养80h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：100g/L葡萄糖、以N元素计0.5g/L酪氨酸（对照为酒石酸铵）、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。该菌体以酪氨酸为氮源的生物量达到18.9g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了49%。
采用本说明书中描述的方法，得到的菌体采用有机溶剂萃取，再用气相测脂肪酸组分，以酪氨酸为氮源的脂肪酸含量达到以该菌体总重量计34%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了47%，以酪氨酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到1165mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了114%。
实施例3：
A、菌种活化
在无菌条件下，从-80℃超低温冰箱中取出卷枝毛霉CBS108.16孢子甘油管，吸取100μL接入盛有200mL下述活化培养基的带挡板三角瓶中，在由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的摇床中，在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养恒温培养16h，得到一种活化菌种液。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的5%，将所述的活化菌种液接入装有100mL种子培养基的带挡板三角瓶中，在所述的摇床中在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养24h，得到一种种子培养液。
所述的活化培养基与种子培养基组成与实施例1的相同
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的10%，将所述的种子培养液接入装有4L下述发酵培养基的由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的发酵罐中，在摇床中在通气流量2L/min、pH6.0、温度30℃与转速700rpm的条件下恒温培养120h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：100g/L葡萄糖、以N元素计0.5g/L酪氨酸（对照为酒石酸铵）、1.5g/L酵母粉、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。该菌体以酪氨酸为氮源的生物量达到19.5g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了51%。
采用本说明书中描述的方法，得到的菌体采用有机溶剂萃取，再用气相测脂肪酸组分，以酪氨酸为氮源的脂肪酸含量达到以该菌体总重量计35%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了48%，以酪氨酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到1286mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了124%。
实施例4：
A、菌种活化
在无菌条件下，从-80℃超低温冰箱中取出卷枝毛霉CBS108.16孢子甘油管，吸取100μL接入盛有150mL下述活化培养基的带挡板三角瓶中，在由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的摇床中，在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养恒温培养30h，得到一种活化菌种液。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的15%，将所述的活化菌种液接入装有1L种子培养基的带挡板三角瓶中，在所述的摇床中在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养16h，得到一种种子培养液。
所述的活化培养基与种子培养基组成与实施例1的相同
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的10%，将所述的种子培养液接入装有4L下述发酵培养基的由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的发酵罐中，在摇床中在通气流量2L/min、pH6.0、温度30℃与转速800rpm的条件下恒温培养96h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：120g/L葡萄糖、以N元素计0.5g/L天冬酰胺（对照为酒石酸铵）、1.5g/L酵母粉、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。该菌体以天冬酰胺为氮源的生物量达到16.5g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了25%。
采用本说明书中描述的方法，得到的菌体采用有机溶剂萃取，再用气相测脂肪酸组分，以天冬酰胺为氮源的脂肪酸含量达到以该菌体总重量计25%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了13%，以天冬酰胺为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到814mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了41%。
实施例5：
A、菌种活化
在无菌条件下，从-80℃超低温冰箱中取出卷枝毛霉CBS108.16孢子甘油管，吸取100μL接入盛有150mL下述活化培养基的带挡板三角瓶中，在由上海智诚分析仪器制造有限公司以商品名ZHWY-2102型回转式恒温摇床销售的摇床中，在温度30℃与转速200rpm的条件下恒温培养16h，得到一种活化菌种液。
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的15%，将所述的活化菌种液接入装有1L种子培养基的带挡板三角瓶中，在所述的摇床中在温度30℃与转速150rpm的条件下恒温培养30h，得到一种种子培养液。
所述的活化培养基与种子培养基组成与实施例1的相同
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的10%，将所述的种子培养液接入装有4L下述发酵培养基的由NewBrunswick公司以商品名BF-115销售的发酵罐中，在摇床中在通气流量2L/min、pH6.0、温度30℃与转速600rpm的条件下恒温培养96h，得到一种发酵培养液。
所述的发酵培养基组成如下：120g/L葡萄糖、以N元素计0.5g/L天冬氨酸（对照为酒石酸铵）、1.5g/L酵母粉、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。该菌体以天冬氨酸为氮源的生物量达到17.1g/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了30%。
采用本说明书中描述的方法，得到的菌体采用有机溶剂萃取，再用气相测脂肪酸组分，以天冬氨酸为氮源的脂肪酸含量达到以该菌体总重量计24%，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了11%，以天冬氨酸为氮源的发酵液中γ-亚麻酸含量达到845mg/L，与以酒石酸铵为氮源的对照组相比提高了44%。
Claims (10)
1.一种用于提高卷枝毛霉（Mucorcircinelloides）CBS108.16产γ-亚麻酸产量的发酵培养基，其特征在于所述的发酵培养基含有一种或多种选自酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的氨基酸氮源，所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.3～3g/L。
2.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于所述酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸的浓度以N元素计是0.5～2.6g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于除氨基酸外，它还含有其它的有机氮源，其它有机氮源的浓度以N元素计是0～0.2g/L。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于其它的有机氮源是酵母粉、尿素或蛋白胨。
5.根据权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征在于所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3.0g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0.01～2.0g/L酵母粉、尿素或蛋白胨、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
6.一种用于提高卷枝毛霉CBS108.16产γ-亚麻酸产量的方法，其特征在于该方法的步骤如下：
A、菌种活化
按照卷枝毛霉CBS108.16孢子液与活化培养基的体积比1:1000～2000，将卷枝毛霉CBS108.16孢子液接入装有活化培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种活化菌种液；
B、种子培养
在无菌的条件下，按照在步骤A得到的活化菌种液体积为种子培养基体积的5～15%，将所述的活化菌种液接入装有种子培养基的带挡板三角瓶中，在摇床中在温度25～35℃与转速100～200rpm的条件下恒温培养16～30h，得到一种种子培养液；
C、发酵培养
在无菌的条件下，按照在步骤B得到的种子培养液体积为发酵培养基体积的5～15%，将所述的种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，在通气流量1～3L/min、pH为5.0～7.0、温度25～35℃与转速500～1000rpm的条件下恒温培养80～120h，得到一种发酵培养液；
D、烘干
将步骤C得到的发酵培养液经过滤，然后在烘箱中在温度60～105℃下烘干至恒重，得到含有γ-亚麻酸的卷枝毛霉CBS108.16菌体。
7.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述的活化培养基与种子培养基组成如下：30g/L葡萄糖、3.3g/L酒石酸铵、7.0g/LKH2PO4、2.0g/LNa2HPO4、1.5g/LMgSO4·7H2O、1.5g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
8.根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于所述的发酵培养基组成如下：50～120g/L葡萄糖、以N元素计0.3～3g/L酪氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸、5～10g/LKH2PO4、1～5g/LNa2HPO4、1～5g/LMgSO4·7H2O、0～2g/L酵母粉、0.1g/LCaC12·2H2O、0.008g/LFeCl3·6H2O、0.001g/LZnSO4·7H2O、0.0001g/LCuSO4·5H2O、0.0001g/LCo(NO3)2·6H2O与0.0001g/LMnSO4·5H2O。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的卷枝毛霉CBS108.16发酵液含有810～1300mg/Lγ-亚麻酸。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述的卷枝毛霉CBS108.16菌体含有以该菌体总重量计24～35%脂肪酸。
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