CN104099254A - 一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的菌株及其筛选方法，所述菌株分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏编号为：CGMCC No.8361；所述筛选方法包括以下步骤：(1)低温初筛；(2)苏丹黑染色复筛；(3)液体发酵培养和(4)气相色谱检测菌株胞内脂肪酸含量。本发明得到的菌株可高产多不饱和脂肪酸；利用本发明的筛选方法能够快速、重复获得该菌株，具有成本低廉、可应用于产业化生产等优点。

Description

一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株菌株及其筛选方法，尤其涉及一株产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法。 

背景技术

多不饱和脂肪酸(PUFAs)是指含有两个或两个以上碳-碳双键且碳原子数为16-22的直链脂肪酸。根据第一个双键在碳链中所处的位置，PUFAs可分为ω-3、ω-6和ω-9等系列，但具有重要生物学意义的是ω-3和ω-6PUFAs。ω-3PUFAs主要包括α-亚麻酸(ALA)，十八碳四烯酸，二十碳四烯酸，二十碳五烯酸(EPA)，二十二碳五烯酸(DPA)以及二十二碳六烯酸(DHA)。ω-6PUFAs主要包括亚油酸(LA)，γ－亚麻酸(GLA)，双高γ－亚麻酸(DGLA)以及花生四烯酸(AA)。 

研究表明PUFAs对人体有众多保健功能：PUFAs能够显著改变脂蛋白代谢，从而降低心血管疾病的发病率；具有抗炎症、抗肿瘤及治疗精神分裂等功能；PUFAs通过改变脂类代谢而降低动脉粥样硬化的发病率，还具有免疫调节和美容等功能。 

人和动物能自行合成所需的饱和脂肪酸及部分单不饱和脂肪酸，但无法合成PUFAs。所以必须从膳食中摄入LA、GLA，然后在体内转化为其他长链PUFAs。但随着年龄的增加，这种转化能力急剧衰弱，因此成年人需要从膳食中补充几乎所有的PUFAs。目前LA、GLA主要来源于植物种子，但受气候和地域的限制，并且植物资源易受农药污染的威胁，20碳以上的长链PUFAs主要来自深海鱼油，但是这种PUFAs风味较差，而且海洋污染、鱼类资源枯竭等问题的加重也导致鱼油来源的功能油脂无法满足市场要求。因此，成本低廉，易规 模化、产业化生产的微生物发酵法生产PUFAs有着广阔的市场前景。获得具有自主知识产权的功能油脂生产用菌有着重要的应用价值和经济效益。 

国内外研究者对产PUFAs的菌种筛选研究表明，来自高纬度土样中的霉菌，尤其是被孢霉属的一些丝状真菌，合成长链多不饱和脂肪酸的应用潜力比较大。 

许本波等人，以深黄被孢霉(Mortierella isabellina As3.3410)为出发菌株，经微波诱变和紫外诱变，乙酰水杨酸与低温(15℃)相结合的筛选方法，获得1株高产多不饱和脂肪酸菌株A35-4(高产PUFAs深黄被孢霉菌株的筛选，许本波等，遗传，2011，30(10)：1147-1152)。李三暑采用二联吡啶作为诱变剂，诱导被孢霉属菌株L8突变，筛选高产不饱和脂肪酸的突变株L83，经过培养基和培养条件的调整，进一步提高碘值到102.3，提高了27.56％(被孢霉菌株L8诱变及其发酵条件的研究，江西农业大学学报，2000,22(3)：434-438)。吕晴等采用气相色谱-质谱对采自云南白马雪山土壤中并经分离和发酵培养的被孢霉菌株SM96的菌丝体油脂中脂肪酸组成进行了定性分析和峰面积相对含量测定，共检测出30种脂肪酸，其中多不饱和脂肪酸含量为62.4％(被孢霉菌丝体脂肪酸组成的气相色谱-质谱分析，吕晴等，2003，22(2)：22-24)。 

除了利用被孢菌属的菌株外，还有利用工程化的含油酵母解脂耶氏酵母菌株生产多不饱和脂肪酸，例如CN101437952A、CN101437951A和CN102803289A。 

CN101591617A公开了一种二十二碳六烯酸生产菌株及其诱变筛选方法和应用，其利用紫外化学诱变筛选方法得到的菌株分类命名为隐甲藻(Cypthecodinium cohnii)。 

目前现有技术中通常采用诱变筛选而获得产多不饱和脂肪酸的菌株，存在变异大，无法实现产业化生产的缺陷。 

发明内容

本发明的目的在于提供一株菌株及其筛选方法，特别是一株高产多不饱和脂肪酸的菌株及其筛选方法。 

为达到此发明的目的，本发明采用以下技术方案： 

在第一方面，本发明提供了一株产不饱和脂肪酸的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学微生物研究所，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CGMCC No.8361。 

本发明所提供的产不饱和脂肪酸(PUFAs)菌株(Mucor circinelloides)的菌落形态为：培养初期(1-2天)菌落呈白色，气生菌丝生长旺盛并较长，培养2天后有黑色孢子附着在气生菌丝上，培养3-5天菌株菌落青黑色，蔓延至整个斜面，疏松平展。 

在第二方面，本发明提供了如第一方面所述的产不饱和脂肪酸菌株的筛选方法，所述方法包括以下步骤： 

(1)低温初筛：将土壤样品的稀释液涂布于平板上，低温下培养； 

(2)苏丹黑染色复筛：将低温培养平板上长出的菌落挑出，用苏丹黑染液进行染色制片，镜检； 

(3)液体发酵培养：将复筛得到的菌株进行种子培养和发酵培养，收集并干燥菌体； 

(4)气相色谱检测：提取上述干燥菌体中的胞内脂肪酸，气相色谱检测其含量。 

步骤(1)所述平板培养基为PDA培养基；所述PDA培养基含有如下组分：马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；琼脂17g/L；将培养基pH值调至5.8，115℃灭 菌20min。 

优选地，所述的低温培养在3-10℃下进行，培养5-9天。 

本发明采用5℃低温条件下培养，微生物生长很慢，而且其中大多是湿润的细菌菌落，少数的丝状真菌菌落；采用该低温条件培养抑制了很多微生物的生长，而能合成较高PUFAs的菌株则生存下来。 

步骤(2)所述的筛选方法中苏丹黑染液由苏丹黑B保存液40mL加碳酸磷酸缓冲液20mL混合过滤而成。 

优选地，所述苏丹黑B保存液的配制为：苏丹黑B0.15g加50mL无水乙醇混匀，放置2天，时常摇动，使苏丹黑B完全溶解。 

优选地，所述的碳酸磷酸缓冲液由a、b两种溶液混合而成；a溶液的配制为：石碳酸结晶8g加无水乙醇15mL，混匀；b溶液的配制为：十二水合磷酸氢二钠0.15g加蒸馏水50mL，混匀。 

步骤(2)所述的筛选方法中，选用光学显微镜进行镜检，物镜为40×，目镜为10×。 

步骤(3)所述的液体发酵培养条件为：温度30℃，转速150rpm，培养5天。 

所述的种子培养为：将筛选得到的菌株接种到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养3天，作为发酵用菌种。 

所述的发酵培养为：利用分散剂打散发酵用菌体后，按10％的接种量接种到装有1L带挡板的锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养120h。 

优选地，所述的种子培养基组成为：葡萄糖30g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵3.3g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜 0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0.0001g/L；并用氢氧化钾调pH至6.2，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌20min。 

优选地，所述的发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵2.0g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0.0001g/L，并用氢氧化钾调pH至6.2，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌20min。 

步骤(4)所述的气相色谱条件为：采用GC-2010(Shimadzu Co.，Japan)色谱仪，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32mm，0.22μm)；氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃；分流方式为进样1L，分流比10:1，载气为氮气；程序升温为初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。 

与已有技术方案相比，本发明具有以下有益效果： 

(1)本发明筛选出了一株高产不饱和脂肪酸的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏编号为：CGMCC No.8361。该菌株生长活力旺盛，产脂肪酸量高，尤其高产多不饱和脂肪酸；该菌株的生物量为13.3g/L，总脂肪酸的量达3.0g/L，占菌体生物量的22.3％。与高山被孢霉(Mortierella alpine ATCC 32222)相比，本菌株合成的PUFAs产量比其高出将近3倍；合成的γ－亚麻酸(GLA)是其产量的12倍。该菌株是生产不饱和脂肪酸的优良菌株，适合产业化推广。 

(2)本发明提供了一种全新的筛选方法，通过这种筛选方法，可以实现菌种筛选的高通量，节约筛选成本，提高工作效率，有效避免了诱变筛选的随机性。 

附图说明

图1典型菌株苏丹黑染色镜检结果示意图(40×10倍)。 

图2脂肪颗粒较多的五株备选菌株苏丹黑染色镜检结果示意图(40×10倍)。 

图3五株备选菌株菌落形态，从左到右分别为1C12、2A11、2A12、2B31及2A34。 

图4五株备选菌株液体发酵合成PUFAs总量、GLA及LA的量。 

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。 

实施例1  低温培养进行初筛 

将来自三个地区的九个土样(见表1)分别标记为A1，A2，A3，B1，B2，B3，C1，C2，C3。各称1g土样，加入装有100mL无菌水及玻璃珠的500mL三角瓶中，振荡15min，取150μL悬液(稀释度相当于10^-2)涂布于PDA平板(每个样品涂布三个平板)，分别置于5℃和28℃进行培养。 

表1 采集土壤的基本情况 

培养结果如表2所示，5℃低温条件下培养微生物生长很慢，大约7天后才 长出足够多的菌落，其中大多是湿润的细菌菌落，少数的丝状真菌菌落；28℃常温条件下培养2天平板上就出现较多菌落。经过对比可以看出，5℃低温条件培养抑制了很多微生物的生长，促使能合成较高PUFAs的菌株生存下来。 

表2 5℃低温和28℃常温培养下土样菌落生长情况对比 

a：三次平行试验所得的数据 

实施例2  苏丹黑染色镜检进行复筛 

从低温生长的平板上挑选80株菌落进行苏丹黑染色，镜检观察菌体内油脂颗粒情况。具体的染色方法如下： 

1)活化菌体：将挑选的80株菌落移种到新鲜的PDA培养基斜面上进行纯化分离并编号，28℃培养三天； 

2)涂片：在干净的载玻片中央滴一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作从斜面培养物上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜； 

3)干燥：室温自然干燥； 

4)固定：手持载玻片一端，使涂菌一面朝上，通过酒精火焰2-3次； 

5)染色：将涂片置于水平位置，滴加苏丹黑染液(以刚好覆盖涂片薄膜为宜)，染色15min左右； 

6)脱色：倾去染液，斜置载片，用二甲苯冲洗脱液洗至无色； 

7)复染：滴加沙黄染液，复染2min； 

8)水洗，用滤纸吸干后镜检。 

染色结果如图1所示，初筛挑选的80株菌株大致分为细菌型、酵母型、曲霉型和丝状霉菌型。细菌型菌落几乎没有脂肪粒，酵母型及曲霉型菌落有部分脂肪粒，但含量很少，相比之下，丝状霉菌菌丝中的脂肪颗粒较明显，部分菌株中脂肪粒很多。 

表3 五株备选菌株的菌落形态 

从80株初筛菌株中通过苏丹黑染色镜检筛选出脂肪粒含量较高的五株备选菌株1C12，2A11，2A12，2B31，2A34(见图2)，这五株菌株斜面菌落形态如图3所示，菌落形态描述如表3所示。 

实施例3  液体发酵培养 

种子液培养：将筛选得到的1C12，2A11，2A12，2B31，2A34的五株菌株接种到装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养3天，作为发酵用菌种。 

摇瓶发酵培养：用分散机打散发酵用菌体后，按10％的接种量接种到装有1L带挡板的锥形瓶(装液量为200ml)锥形瓶中，30℃，150r/min摇床培养120h。 

生物量的测定：全发酵液用分散机打散菌体后，经抽滤过滤，蒸馏水洗涤3遍，收集菌体于9cm平皿中，冷冻干燥后称重。 

实施例4  气相色谱检测 

提取干燥菌体中的油脂和胞内脂肪酸，气相色谱检测其含量。 

采用酸热、冷冻的方法提取干菌体中油脂，提取方法如下： 

1)称取30mg-50mg的干菌体，加入2mL的4mol/L盐酸； 

2)80℃水浴保温1h，然后-80℃放置15min，80℃水浴继续保温1h，-80℃放置15min； 

3)冷却至室温，加入1mL甲醇，振荡2min后加入1mL三氯甲烷，振荡10min，3000rpm离心3min，收集三氯甲烷层； 

4)剩余液体中再加入1mL三氯甲烷，振荡10min，3000rpm离心3min，收集三氯甲烷层； 

5)合并三氯甲烷层，加入1mL饱和氯化钠，振荡混匀，3000rpm离心3min，将三氯甲烷层转移到新的提脂瓶； 

6)重复步骤5)，合并三氯甲烷层，氮气吹干； 

7)1mL无水乙醚洗涤，3000rpm离心3min，收集乙醚层至新的提脂瓶； 

8)重复步骤7)，合并乙醚层，氮气吹干，得到粗脂。 

总脂肪酸含量测定及其脂肪酸组分的分析步骤如下： 

1)向上述粗脂中分别加入50L、2.02g内标C15:0和1mL10％的盐酸甲醇，60℃水浴保温3h； 

2)冷却至室温后加入1mL正己烷和1mL饱和氯化钠溶液，振荡混匀，3000rpm离心3min，吸出正己烷层，再加入1mL正己烷，振荡混匀，3000rpm离心3min，吸出并合并正己烷； 

3)氮气吹干后，加入1mL正己烷，振荡混匀，转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液； 

4)气相色谱进行检测，通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，Supelco，USA)的气相保留时间比较来确定各脂肪酸组分，结合加入内标C15:0的质量定量分析样品中总脂肪酸及各脂肪酸组分的质量(脂肪酸甲酯与脂肪酸之间的质量差异可忽略不计)。总脂肪酸含量(％，w/w)用单位菌体中总脂肪酸的质量表示，脂肪酸组成(％，FA/TFA)用脂肪酸占总脂肪酸的百分比表示。 

脂肪酸组成如表4所示，2A11菌株的生物量最高，达到13.3g/L，并且单位生物量中总脂肪酸含量也最高，达到22.3％；合成的PUFAs主要是油酸(OA)、亚油酸(LA)以及γ－亚麻酸(GLA)，占总脂肪酸的比例分别为25.5％、42.6％、20.0％。 

如图4所示，2A11菌株合成GLA的产量为0.59g/L，是对照菌株M.alpina合成GLA产量(0.05mg/L)的12倍；合成的多不饱和脂肪酸总量(1.86g/L)是对照菌株M.alpina多不饱和脂肪酸总量(0.65g/L)的2.9倍。 

提取2A11菌株的18SrRNA，送入上海桑尼生物科技有限公司进行测序，测序结果表明该菌株与卷枝毛霉(Mucor circinelloides)同源性为100％，确认该菌株为卷枝毛霉。 

表4 五株备选菌株脂肪酸组成及生物量 

a：两次平行试验所得的数据；ND：未检测到 

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 

Claims (7)

1.一株产多不饱和脂肪酸(PUFAs)的菌株，其分类学命名为卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2013年10月17日，保藏编号为CGMCC No.8361。

2.根据权利要求1所述菌株的筛选方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)低温初筛：将土壤样品的稀释液涂布于平板上，低温下培养；

(2)苏丹黑染色复筛：将低温培养平板上长出的菌落挑出，用苏丹黑染液进行染色制片，镜检；

(3)液体发酵培养：将复筛得到的菌株进行种子培养和发酵培养，收集并干燥菌体；

(4)气相色谱检测：提取上述干燥菌体中的细胞内脂肪酸，气相色谱检测其含量。

3.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)所述的平板培养基为PDA培养基；

优选地，所述的PDA培养基含有如下组分：马铃薯200g/L；葡萄糖20g/L；琼脂17g/L；将培养基pH值调至5.8，115℃灭菌20min；

优选地，所述的低温培养在3-10℃下进行，培养5-9天。

4.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)所述的苏丹黑染液由苏丹黑B保存液40mL加碳酸磷酸缓冲液20mL混合过滤而成；

优选地，所述苏丹黑B保存液的配制为：苏丹黑B0.15g加50mL无水乙醇混匀，放置2天，时常摇动，使苏丹黑B完全溶解；

优选地，所述碳酸磷酸缓冲液由a溶液和b溶液混合而成；所述a溶液为石碳酸结晶8g加无水乙醇15mL，混匀；所述b溶液为十二水合磷酸氢二钠0.15g加蒸馏水50mL，混匀；

步骤(2)所述的镜检采用光学显微镜进行，物镜为40×，目镜为10×。

5.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(3)所述液体发酵培养条件为：温度30℃，转速150rpm，培养5天；

所述的种子培养基组成为：葡萄糖30g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵3.3g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0.0001g/L；并用氢氧化钾将pH值调至6.2，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌20min；

所述的发酵培养基组成为：葡萄糖50g/L；酵母粉1.5g/L；L-酒石酸铵2.0g/L；磷酸二氢钾7.0g/L；磷酸氢二钠2.0g/L；七水硫酸镁1.5g/L；二水氯化钙0.1g/L；六水合三氯化铁0.008g/L；七水硫酸锌0.001g/L；五水硫酸铜0.0001g/L；六水硝酸钴0.0001g/L；五水硫酸锰0.0001g/L；并用氢氧化钾将pH值调至6.2，葡萄糖分开灭菌，115℃灭菌20min。

6.根据权利要求2所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)所述的气相色谱条件为：采用GC-2010色谱仪，色谱柱为DB-Waxetr；用氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和260℃；分流方式为进样1L，分流比10:1，载气为氮气；程序升温为初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。

7.根据权利要求2-6任一项所述的筛选方法，其特征在于，步骤(4)最终得到的高产不饱和脂肪酸的菌株，根据18SrRNA测序结果确定该菌株为Mucor circinelloides。