CN107164297B - 一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法。本技术是利用牛樟树的幼茎和/或幼叶细胞经液体悬浮培养后所得到的培养液或培养液干粉作为牛樟芝的液态发酵的添加物，继续培养至发酵结束。本发明可大幅提高牛樟芝的液体发酵水平，对菌丝体生长和活性产物的合成具有明显的促进作用。本发明技术不受季节、环境、病虫害影响，同时不占用耕地，生产周期较短、成本较低，且对已有的牛樟树资源不构成危害。该技术的应用为牛樟芝高活性物质的液体发酵制备提供了有力的保证。

Description

一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法。
背景技术
牛樟芝(Antrodia Camphorat)是20世纪90年代在台湾发现的药用多孔菌，为台湾特有的珍贵真菌，亦名牛樟菇、樟芝，有“台湾森林红宝石”之美称。牛樟芝寄生于台湾特有的保护树种牛樟树上，生长极为缓慢，自然产量稀少。作为传统中药材，牛樟芝的子实体和菌丝体具有安神、怯风行气、化疲活血、温和消积，解毒消肿及镇静止痛之效，为上好的防腐解毒剂；现代药理学研究表明，牛樟芝对肝病有疗效，具有抗肿瘤、抗病毒、抗过敏、降血脂、降血糖等作用，是上等的食(药)用真菌。牛樟芝的成分复杂，其中主要的活性成分包括三萜、多糖和腺苷等，三萜类化合物是牛樟芝最重要的化学成份之一，也是牛樟芝的萃取物中苦味成份的来源。
目前，自然界中牛樟树存量不多，适合牛樟树生长的地区有限，导致牛樟木资源稀缺；而野生牛樟芝生长缓慢，子实体产量极少，但市场需求在不断增大，野生牛樟芝市场价格一直居高不下。鉴于牛樟树资源的稀缺和牛樟芝的神奇功效，科学家将牛樟芝的获取聚焦到了人工培养上，包括椴木培养、固态培养和液体发酵。椴木培养利用樟芝原有宿主牛樟树或其他椴木(树龄都在80年以上的椴木)为培养基栽培牛樟芝，培养时间大约2年。固态培养虽然能够培养出和野生牛樟芝类似的子实体，但其生产周期较长(3个月)、成本也比较高，同时，无论椴木培养还是固体培养基中也需要牛樟木，进而导致牛樟树盗阀，滥采。牛樟芝的液体发酵技术已经有了较多的研究，相比与椴木和固态培养，液体发酵周期较短(少于20天)，可大量生产出牛樟芝菌丝体，利于工业化、规模化生产。但总体上菌丝体的产量还处于较低水平，同时，生物活性物质的含量不但低而且同野生子实体中的物质活性有较大差异，有文献报道在牛樟芝的液体发酵中添加牛樟树的茎、叶、果实等部位的干粉或其提取物均能有效促进菌丝体的生产和提高重要代谢产物的含量和活性，但该方法在工艺和生产成本等方面受到了极大的限制，同时对牛樟树也具有巨大的破坏作用。
因此，如何在保护牛樟树这一珍贵资源的前提下，开发一种具有牛樟树特定作用、低成本，同时对牛樟芝的菌丝体生产、活性产物积累具有明显促进作用的培养方法是亟待解决的关键问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法，是以牛樟树的幼茎和/或幼叶细胞的愈伤组织作为接种物进行液体悬浮培养，所获液体悬浮培养物和/或经处理后得到的液体悬浮培养物干粉添加至牛樟芝的液态发酵液中，继续培养至发酵结束，从而大大提高牛樟芝的菌丝体生物量和生物活性物质的产量。
优选的，愈伤组织选自牛樟树幼茎和/或幼叶诱导的在固体培养基上呈淡白色、生长状态良好、质地疏松的愈伤组织。本发明优选愈伤组织以30-50g/L的接种量接种到MS培养基(pH为6.0-6.5)中进行培养16-24d，得到培养液(包括其中的有效成分)，即为本发明的液体悬浮培养物。
优选的，液体悬浮培养物按照30-350ml/L的添加量(干物质为0.5-30g/L)添加到牛樟芝的液态发酵液中。
优选的，液体悬浮培养物按照60ml/L的添加量(干物质为0.5-30g/L)添加到牛樟芝的液态发酵液中，可获得较大的菌丝体生物量以及多糖含量和三萜含量。
优选的，液体悬浮培养物经过浓缩、过滤、干燥、粉碎得到液体悬浮培养物干粉。
优选的，液体悬浮培养物干粉按照0.5-30g/L的添加量添加到牛樟芝的液态发酵液中。
优选的，液体悬浮培养物按照20g/L的添加量添加到牛樟芝的液态发酵液中，可获得较大的菌丝体生物量。
优选的，液体悬浮培养物按照10g/L的添加量添加到牛樟芝的液态发酵液中，可获得较大的多糖含量和三萜含量。
优选的，所获液体悬浮培养物和/或其干粉添加到牛樟芝的液态发酵液中的时间为牛樟芝液态发酵12天以内(12天不包括种子发酵时间)。一般来说，为了节约成本，在种子发酵时无需加入添加物，再扩大培养时添加本发明的添加物。
本发明通过实验，发现液体悬浮培养物在牛樟芝液态发酵第2天添加，可获得较大的菌丝体生物量；在牛樟芝液态发酵第8天添加，可获得较大的多糖含量和三萜含量。液体悬浮培养物干粉在牛樟芝液态发酵第2天添加，可获得较大的菌丝体生物量；在牛樟芝液态发酵第8天添加，可获得较大的多糖含量和三萜含量。
一种牛樟芝液态发酵的添加物，所述添加物为牛樟树的幼茎和/或幼叶细胞的液体悬浮培养物和/或其干粉。
优选的，牛樟树幼茎和/或幼叶细胞以其愈伤组织为接种物进行液体悬浮培养得到液体悬浮培养物。
优选的，液体悬浮培养物经过浓缩、过滤、干燥、粉碎得到液体悬浮培养物干粉。
优选的，所述添加物为牛樟树的幼茎细胞的液体悬浮培养物和/或其干粉。本发明研究发现牛樟树的幼茎细胞的效果好于幼叶细胞的效果。
一种牛樟芝液态发酵用培养基，所述液态发酵培养基中添加有上述添加物。
牛樟树幼茎和/或幼叶细胞的液体悬浮培养物和/或其干粉作为添加物在牛樟芝液态发酵中的应用。
优选的，牛樟树幼茎和/或幼叶细胞在进行液体悬浮培养前，先接种到固体培养基上获得愈伤组织，以愈伤组织为接种物进行液体悬浮培养。
优选的，愈伤组织为淡白色、生长状态良好、质地疏松的愈伤组织。
优选的，液体悬浮培养物经过浓缩、过滤、干燥、粉碎得到液体悬浮培养物干粉。
如专利所使用术语，具有下述含义。
悬浮培养，指的是一种在受到不断搅动或摇动的液体培养基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系统，是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。增加悬浮培养规模需要相应增加体积。深度超过5mm，需要搅动培养基，超过10cm，还需要深层通入CO2和空气，以保证足够的气体交换。通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～120r/min的速度进行。由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
愈伤组织(callus)原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。
本发明优选牛樟树幼茎和/或幼叶诱导的愈伤组织，也即，本技术一开始仅需要少量的牛樟树幼茎和/或幼叶样本，繁殖得到大量的愈伤组织，而愈伤组织可以不断接种培养，提供源源不断的接种物。
液态发酵，是相对于固态发酵而言，液态发酵中干物质含量在10％以内。通常包括种子和进一步的发酵培养。
本发明的有益效果是：
本发明方法可以克服现有技术中需要较多牛樟树资源的缺陷，仅需要少量的牛樟树的幼茎和幼叶样本，便可以进行组织培养，获得大量的愈伤组织作为接种物。进一步液体悬浮培养，所获液体悬浮培养物或经处理后得到的液体悬浮培养物干粉添加至牛樟芝的液态发酵液中，继续培养至发酵结束。本发明方法可有效降低牛樟芝液体成本，并对牛樟树资源的保护起到了积极作用。
本发明将牛樟树的幼茎和幼叶细胞的愈伤组织接种到液体培养基中进行悬浮培养，所获得的液体悬浮培养物或其干粉作为牛樟芝的液态发酵的添加物。所述添加物能够促进牛樟芝产活性成分，可以实现细胞的快速增殖和代谢产物积累，该技术不受季节、环境、病虫害影响，同时不占用耕地，生产周期较短、成本较低，且对已有的牛樟树资源不构成危害。该技术的应用为牛樟芝高活性物质的液体发酵制备提供了有力的保证。
本发明可大幅提高牛樟芝的液体发酵水平，对菌丝体生长和活性产物的合成具有明显的促进作用，差异极显著。实施例1中添加茎细胞悬浮培养物，菌丝体干重(即菌丝体生物量)比对照组1提高了32％，比对照组2提高了26％；多糖含量比对照组1提高了58％，比对照组2提高了56％；三萜含量比对照组1提高了106％，比对照组2提高了98％。
本发明的技术可以与现有技术进行联用，在现有技术(包括培养基和培养方法)的基础上添加本发明的添加物，可以显著提高活性物质的相关产量。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1
牛樟树茎和叶细胞悬浮培养技术为本领域常用技术，首先诱导牛樟树茎和叶产生愈伤组织，然后利用愈伤组织进行细胞悬浮培养，获得液体悬浮培养物。本实施例中采用下述培养基。
牛樟树幼茎和/或幼叶愈伤组织培养基：MS基本培养基，卡拉胶7g/L，pH为6.2。
牛樟树细胞悬浮培养基：MS基本培养基，pH为6.2。
具体方法包括下列步骤：
牛樟树幼茎和/或幼叶愈伤组织培养：取牛樟树组培无菌瓶苗的幼茎和幼叶，接种于牛樟树幼茎和幼叶愈伤组织固体培养基中，温度25℃，黑暗培养30d，得牛樟树幼茎和幼叶愈伤组织。
牛樟树茎和/或幼叶细胞悬浮培养：选取愈伤组织固体培养基上淡白色、生长状态良好、质地疏松的牛樟树幼茎和/或幼叶诱导而来的愈伤组织，以40g/L鲜重的接种量装入盛有80ml牛樟树细胞悬浮培养基的250ml三角瓶中，120r/min，遮光培养20d，得到液体悬浮培养物(包括培养液及其中的有效成分)。
本发明将上述得到的液体悬浮培养物作为牛樟芝的液态发酵的添加物。牛樟芝的液态发酵技术为本领域常用技术。本实施例中采用下述培养基。
牛樟芝斜面培养基：综合PDA培养基。
牛樟芝种子培养基：PDA液体培养基，自然pH。
牛樟芝发酵培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，KH2PO4 3g/L，VB1 0.1g/L，自然pH。
牛樟芝的液态发酵方法具体包括下列步骤：
牛樟芝种子斜面：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，接种于PDA斜面培养基上，28℃培养20天。
牛樟芝种子液体发酵：将4℃下保存的牛樟芝菌种活化，取1cm2的小方块接种到液体种子培养基中。种子培养基摇瓶(250mL)每瓶装液量80mL，接种后于28℃、110rpm条件下培养10天。
牛樟芝摇瓶液体发酵：将生长好的一级种子液混合，均匀接种到500mL摇瓶，每瓶装液量150mL，接种量为10mL，接种后于28℃、110rpm条件下培养15天。
发酵接种前，分别在牛樟芝发酵培养基中添加牛樟树茎(组1)和叶(组2)的细胞悬浮液体培养物20ml以及两者混合液体培养物(组3)各10ml，对照组1为添加20ml空白牛樟芝液体发酵培养液，对照组2为添加20ml空白细胞悬浮培养液。
发酵结束后收集菌丝体，测定干重以及菌丝体中多糖和三萜含量。结果显示：所获牛樟芝菌丝体生物量、多糖和三萜含量均比对照组1和2有提高，添加茎细胞悬浮培养物的提高幅度较大。其中添加茎细胞悬浮培养物，菌丝体干重(即菌丝体生物量)比对照组1提高了32％，比对照组2提高了26％；多糖含量比对照组1提高了58％，比对照组2提高了56％；三萜含量比对照组1提高了106％，比对照组2提高了98％。
实施例2
牛樟芝的培养基与培养方法同实施例1。
将实施例1中的牛樟树茎和叶细胞悬浮液体培养物经过滤、烘干、粉碎后获得干粉。
在牛樟芝发酵接种前，分别在培养基中添加牛樟树茎和叶的培养物干粉5g/L或两者干粉混合物各2.5g/L，对照组为不添加任何其他物质。
发酵结束后收集菌丝体，测定干重以及菌丝体中多糖和三萜含量。结果显示：所获牛樟芝菌丝体生物量、多糖和三萜含量均比对照组有提高。其中添加茎细胞悬浮培养物的提高幅度较大，菌丝体干重比对照组提高了47％；多糖含量比对照组提高了72％；三萜含量比对照组提高了132％。
实施例3
牛樟芝的培养基与培养方法同实施例1。
将实施例1中的牛樟树茎细胞悬浮液体培养物经过滤、烘干、粉碎后获得干粉。
在牛樟芝发酵过程中，分别在发酵第2、4、6、8、10、12天往培养基中分别添加牛樟树茎液体培养物20ml，对照组为不添加任何其他接种物的情况下获得空白细胞悬浮液体培养基20ml；或空白液体培养基获得的干粉5g/L。
发酵结束后收集菌丝体，测定干重以及菌丝体中多糖和三萜含量。结果显示：所获牛樟芝菌丝体生物量、多糖和三萜含量均比对照组均有提高。其中菌丝体干重在发酵第2天提高幅度最大，添加液体培养物比对照组提高了33％，添加干粉提高了45％。而多糖含量和三萜含量均在发酵第8天添加时的提高幅度最大，多糖含量比对照组提高了67％，三萜含量比对照组提高了144％。
实施例4
牛樟芝的培养基与培养方法同实施例1。
在牛樟芝发酵接种前，分别在培养基中添加牛樟树茎液体培养物5、10、20、40、60ml，对照组为添加相应体积的空白细胞悬浮培养液。
发酵结束后收集菌丝体，测定干重以及菌丝体中多糖和三萜含量。结果显示：所获牛樟芝菌丝体生物量、多糖和三萜含量均比对照组高。其中菌丝体生物量分别在液体培养物添加60ml时提高幅度最大，比对照组提高了36％。多糖和三萜含量均在添加液体培养物60ml提高幅度最大，其中多糖含量比对照组70％，三萜含量比对照组提高了109％。
实施例5
牛樟芝的培养基与培养方法同实施例1。
将实施例1中的牛樟树茎细胞悬浮液体培养物经过滤、烘干、粉碎后获得干粉。
在牛樟芝发酵接种前，分别在培养基中添加牛樟树茎液体培养物干粉0.5、1、2、5、10、20g/L，对照组为不添加任何其他物质。
发酵结束后收集菌丝体，测定干重以及菌丝体中多糖和三萜含量。结果显示：所获牛樟芝菌丝体生物量、多糖和三萜含量均比对照组高。其中菌丝体生物量在干粉添加20g/L时提高幅度最大，比对照组提高了58％。多糖和三萜含量均在添加干粉10g/L时提高幅度最大，其中多糖含量比对照组提高了79％，三萜含量比对照组提高了159％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种促进牛樟芝菌丝体生长和活性产物合成的方法，其特征在于：是以牛樟树的幼茎和/或幼叶细胞的愈伤组织作为接种物进行液体悬浮培养，所获液体悬浮培养物和/或经处理后得到的液体悬浮培养物干粉添加至牛樟芝的液态发酵液中，继续培养至发酵结束；
其中，所述愈伤组织选自牛樟树幼茎和/或幼叶诱导的在固体培养基上呈淡白色、生长状态良好、质地疏松的愈伤组织；所述液体悬浮培养物按照30-350ml/L的添加量添加到牛樟芝的液态发酵液中；所述液体悬浮培养物经过浓缩、过滤、干燥、粉碎得到所述液体悬浮培养物干粉；所述液体悬浮培养物干粉按照0.5-30g/L的添加量添加到牛樟芝的液态发酵液中。
2.牛樟树幼茎和/或幼叶细胞的液体悬浮培养物和/或其干粉作为添加物在牛樟芝液态发酵中的应用，牛樟树幼茎和/或幼叶细胞在进行液体悬浮培养前，先接种到固体培养基上获得愈伤组织，以其愈伤组织为接种物进行液体悬浮培养，获得牛樟树幼茎和/或幼叶细胞的液体悬浮培养物，所述干粉为所述液体悬浮培养物经处理后的液体悬浮培养物干粉。
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