CN1377422A - 改进的发酵方法 - Google Patents

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Abstract

一种发酵培养基,其含有:(a)一种可代谢的碳源和能源;(b)一种无机氮源;(c)一种磷酸盐;(d)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物的金属元素;和(e)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源。

Description

改进的发酵方法
本发明的技术背景
本发明涉及一种改进的发酵培养基以及利用该培养基制备脂族多羧酸的方法。
长链-α、ω-二羧酸，即那些具有9个或9个以上碳原子的二羧酸，被用作合成多种化学产物和聚合物的原料。
碳原子数大于4的二羧酸目前几乎仅仅是通过非生物学转化的方法来生产。这类型生产二羧酸的化学方法具有一定的局限性和缺点。每种方法只限于生产以所用起始物为基础的特定碳链长度的二羧酸。例如，十二烷二酸方法起始于丁二烯，因此该反应方法的产物只限于链长为4的倍数的酸。另外，该方法基于非再生的石化产品原料，并且多步反应转化方法产生不需要的副产物、重金属废料和氧化氮，其中所述副产物导致产率下降，所述氧化氮肯定会在还原加热炉中被破坏。
生物转化生产二羧酸的方法与现有非生物转化方法相比具有许多潜在的优点。其中主要优点是可再生原料作为起始物的用途以及能够在不产生有害化学副产物的情况下生产二羧酸，所述副产物增大了废物处理的成本。
通过利用一种生物学方法所获得的另一个显著优点是可以比较容易地对方法进行修改以便能够利用相同的生物催化剂和相同的设备生产出更多种类的二羧酸。由于目前的有机化学合成方法仅适合于单一二羧酸的生产，几种不同二羧酸的合成需要针对每种二羧酸建立一种新的合成路线。另一方面，利用相同的设备、培养基和方案，仅仅通过给酵母菌提供不同的底物就可以使用一种酵母生物催化剂来生产不同长度的二羧酸。
其全部内容被引入作为参考的美国专利US6,004,784记载了一种半合成发酵培养基，该培养基利用玉米浆和啤酒酵母抽提物来降低传统发酵培养基的成本，所述传统培养基含有昂贵的、标准化程度高的酵母抽提物和酵母氮基质。
利用廉价替代物带来的问题是多方面的。结果使得发酵液在被空气雾化时产生强烈的气味。含在玉米浆和酵母粗提物中的微粒物质，尤其是结合了高浓度细菌的微粒物质给灭菌带来了很大的困难并且给培养基灭菌设备带来了生物负荷。这些替代物还含有许多带来颜色稳定性问题的不可代谢组分，从而需要采用附加的纯化步骤，结果导致现有产物的损失。为了降低培养基成本而对这些替代物进行的选择增加附加的工艺成本。因此，仍然需要一种低成本的生物发酵培养基，该培养基为作为生物催化剂的酵母提供维持生长的营养成分以便高度特异性地产生多羧酸、多元醇和多羟基酸。
本发明概述
本发明涉及一种发酵培养基以及利用该培养基制备多羧酸、多元醇和多羟基酸的方法。该发酵培养基包括：(a)一种可代谢的碳源和能源；(b)一种无机氮源；(c)一种磷酸盐源；(d)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物的金属元素；和(e)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源。
本发明还涉及一种制备多羧酸、多元醇和多羟基酸的方法，该方法包括：(a)提供一种能够产生多羧酸、多元醇和多羟基酸的微生物；(b)提供一种能被所述微生物转化为一种多羧酸、多元醇或多羟基酸的底物；(c)提供一种含有下列成分的培养基：(i)一种可代谢的碳源和能源；(ii)一种无机氯源；(iii)一种磷酸盐源；(iv)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物的金属元素；和(v)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源；和(d)在所述培养基中对所述微生物进行发酵培养。
本发明的描述
在所有实例中，表示成分和/或反应条件的数字应该被理解为通过“大约”而被修改。
通过对维持物生物生长的选择营养成分的精确选择，本发明提供了一种利用一种生物转化方法能够大量商业化生产多功能重要物质的培养基。本发明提供了一种低成本的取代现有技术培养基的替代物及其使用方法，该培养基的制备和灭菌简单，气味不重，在后续的下游工艺过程中产生的杂质较少，结果使得产物的产量至少与现有技术的常规方法的产率一样高。
令人惊奇地是，包括玉米浆和酵母抽提物的多种未知成分能被较少的几种成分所代替而没有降低微生物的生长和多功能化合物的产率。
因此，本发明一方面提供了一种经济的发酵培养基，该培养基能够方便地对多种类型的有机底物进行生物转化。该发酵培养基含有下列必需成分：(i)一种可代谢的碳源和能源；(ii)一种无机氮源；(iii)一种磷酸盐源；(iv)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素及其混合物的金属元素；和(v)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源。这些物质单独满足了微生物生长的基本营养要求因而产生的生物物质的量和质量足以进行生物转化。
合适的可代谢的碳源和能源包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油、醋酸钠、甲醇、短链醇类物质及其混合物。优选的可代谢的碳源和能源是葡萄糖，优选地是一种液体葡萄糖浆，例如95％的葡萄糖浆等同物，或者浓度较低的葡萄糖浆等同物。这种物质含有少量的在发酵过程中能被补加的淀粉酶类如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶水解的二糖、三糖和多糖。因此，葡萄糖可以通过与生物氧化反应同时进行的反应本身来提供。
无机氮源包括但不限于碱金属硝酸盐如硝酸钠或硝酸钾，铵盐如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和醋酸铵。优选的无机氮源是氨或氢氧化铵。
本发明发酵培养基的另一种必需成分是一种磷酸盐源，该磷酸盐包括含有任何磷酸盐的化合物。其实例包括但不限于磷酸钾、磷酸钠和磷酸铵。一种用于本发明的特别优选的磷酸盐是磷酸钾。
在本发明培养基中使用的合适金属元素包括碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物。特别优选的金属元素包括混合的钾、钙和镁。
所述发酵培养基的最后一个关键组分是基本上不含微粒物质和细菌的生物素。
任何培养基成分可以作为初始灭菌培养基装料的一部分来加入，作为用于以后加入到培养基中的浓缩水溶液来进行灭菌，或者以过量的形式包含在用于转移到生产发酵罐中的种子培养液中。
为了避免有关的气味散发、颜色不稳定性和污染问题，所述生物素必须不含微粒物质和细菌，因为所述微粒物质和细菌促使这类问题的出现并且需要附加的纯化步骤。生物素的需要量要比它在现有技术培养基中取代的有机氮源低几个数量级。
本发明的发酵培养基水溶液含有：(a)约10g/l至约60g/l，优选地约20g/l至约40g/l的可代谢的碳源和能量，优选地是葡萄糖；(b)约50ppm至约2000ppm，优选地约50ppm至约250ppm，和最优选地约100ppm至约250ppm的由无机氮源提供的氮；(c)约1g/l至约10g/l，优选地约1g/l至约7g/l的一种磷酸盐，优选地是磷酸钾；(d)约0.01g/l至约2g/l，优选地约0.01g/l至约1g/l的至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素及其混合物的金属元素，优选地是钙和镁的混合物；和(e)约1μg/l至约2000μg/l，优选地约4μg/l至约200μg/l，和最优选地约4μg/l至约20μg/l的生物素，其中所述生物素基本不含有害的微粒物质和细菌。
发酵培养基中的水可以是通过蒸馏纯化、去离子或软化处理得到的纯水。优选地水包括那些来源于分配系统的城市用水、一种加工再循环蒸汽或井水，其中无机物含量的调节应该考虑到这些水源中已有的无机物含量。例如，含有其它所需成分的水可能已经含有足以提供所述微生物生长所需的全部或基本上全部的无机物成分。
本发明的发酵培养基满足了所述微生物生长的基本营养需求，从而有机和无机成分的加入量降低到最低程度，所述成分需要从作为废物处理的产物中分离并且产生气味。与本技术领域中已知的发酵培养基组合物相反，本发明的培养基不含微粒物质，特别是能够在自动培养基分离过程中进行连续灭菌并且价格便宜。尽管本发明提供的是贫营养培养基，但在培养基配制过程中具有广泛的适用性从而获得高产率的多羧酸、多元醇和多羟基羧。
各种辅助成分也可以被用于本发明的发酵培养基以便进一步促进生物发酵过程。其实施例包括但不限于各种类型的痕量金属、螯合剂、抗泡剂等。
本发明的发酵培养基可与任何产生多羧酸、产生多元醇、产生多羟基酸的酵母菌以及多种底物一起使用。例如，在所需产物是一种多羧酸如二酸的情况下，可以使用任何类型的脂肪酸、脂肪酸酯或链烷烃底物。用于生产二酸的合适底物包括，但不限于月桂酸、豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、棕榈油酸及其甲酯，及其混合物。链烷烃的实例包括十二烷、十二碳烯、十三烷、十四烷、十八烷等。
因此，本发明另一方面提供了一种制备多羧酸、多元酸或多羟基酸的方法。仅仅为了举例说明的目的，本发明的方法将通过参考制备作为所需终产物的多羧酸，尤其是二酸的方法来进行描述。
所述方法可以在任何所述微生物能生长并能催化所需转化反应的pH范围内进行操作。优选的和特别有利的pH范围是酸性的情况，即pH大约为7或低于7。而低pH能被用于任何发酵过程，尤其有利地是被用于生产多羧酸的发酵过程。合适的pH调节剂是氨、氢氧化铵溶液，浓缩的氢氧化钾或氢氧化钠。
所述有机底物可以是任何可生物氧化成单-或多羧酸的有机化合物。这种化合物可以是饱和的或非饱和的脂族化合物或任何具有至少一个末端甲基、一个末端羧基和/或一个通过生物氧化可被氧化成羧基的末端功能基团的碳环或杂环芳香化合物。一个为羧基衍生物的末端功能基团可以存在于底物分子中并且可以通过非生物氧化反应被转化成一种羧基。例如，一种脂酶，例如可以在发酵步骤中被加入以便从另一种不可代谢的酯中释放出游离脂肪酸来。
链烷烃是一种在本发明方法操作过程中使用的饱和形式的有机底物。所述链烷烃可以是线性的或环状的，支链的或直链的，取代的或未被取代。特别优选的链烷烃是那些具有约4至约25个碳原子的链烷烃，其实例包括但不限于丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十八烷等。
可以用于本发明方法中的非饱和有机底物的实例包括但不限于内烯烃如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；非饱和的羧酸如2-己烯酸及其酯、包括油酸相对含量高的甘油三酯在内的油酸及其酯，包括芥酸相对含量高的甘油三酯在内的芥酸及其酯，包括蓖麻油酸相对含量高的甘油三酯在内的蓖麻油酸及其酯，包括亚油酸相对含量高的甘油三酯在内的亚油酸及其酯；非饱和醇如3-己烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；非饱和的醛如3-己烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。除了上述底物外，可以用于本发明的底物还包括具有至少一个内碳-碳双键和至少一个末端甲基，一个末端羧基和/或一个通过生物氧化可被氧化成羧基的末端功能基团的脂环化合物。这种化合物的实例包括但不限于3，6-二甲基-1，4-环己二烯；3-甲基环己烯；3-甲基-1，4环己二烯等。
可以被用于本发明方法中的芳香化合物实例包括但不限于芳烃如邻-、间-、对-二甲苯；邻-、间-、对-甲基苯甲酸；二甲基吡啶等。所述有机底物还可含有其它的可被生物氧化为羧基的功能基团如醛基或醇基。所述有机底物还含有其它的不能被生物氧化成羧基和不受生物氧化干扰的功能基团如卤素、醚等。
在发酵阶段当所述培养物处于将底物氧化成产物的活跃期时可以向培养物中提供一种辅助底物。尤其是当由底物反应本身不能得到最终可利用的碳源和能源时，那么这种碳源和能源可以由辅助底物来提供。
所述辅助底物是一种可发酵的碳水化合物如葡萄糖、果糖或麦芽糖；或其它可发酵的有机化合物，例如甘油、醋酸钠、甲醇或短链醇类化合物；或其混合物。优选的辅助底物是葡萄糖，优选地是一种液体葡萄糖浆，例如，96％葡萄糖浆等同物，甚至浓度较低的葡萄糖浆等同物。这种物质含有少量的二糖、三糖和多糖，所述多糖在发酵过程中能被加入的淀粉酶如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶所水解。这种葡萄糖可以由与上述氧化反应同时进行的反应本身来提供。
如果用来培养生物物质的碳源和能源与被用来促进氧化转化反应的辅助底物相同，那么它是合适的，但并不是绝对必要。实际的好处是只有较少的原料需要进行处理并且可以对各种发酵步骤进行合理的组合。因此，一种单一辅助底物的灭菌和传输系统可以被用来传输用来培养生物物质的碳源和能源和用促进氧化反应的辅助底物。
可以用于本发明的微生物是任何能生物氧化本文所定义的底物的微生物。所微生物可以是任何其中β氧化反应通过裂解、钝化或缺失一个或多个酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的微生物；任何其中β氧化反应通过裂解、钝化或缺失一个或多个酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的酵母菌；任何其中β氧化反应通过裂解、钝化或缺失一个或多个酰基CoA氧化酶基因而被部分或完全抑制的念珠菌属菌株。如发酵过程涉及底物转化为羧酸的生物氧化，所述微生物通常是一种酵母菌。这样一种微生物以下列方式氧化底物：所形成的单-和/或二羧酸不再通过导致链缩短的降解反应而被进一步氧化。然而，本发明的方法涉及任何微生物的使用。
美国专利US5,254,466中列出了在作为碳源的链烷烃或脂肪酸上被培养时分泌作为副产物的α、ω二羧酸的已知酵母菌菌株，其全部内容被本文引用作为参考。这些菌株是部分或完全氧化阻断的菌株；即，它们被进行了遗传修饰因而其染色体基因POX4A，POX4B和POX5基因已被裂解。由于竞争性β-氧化途径由于POX基因被裂解而在功能上被钝化，所以该菌株中的底物流取向于ω-氧化途径。一种氧化完全阻断的菌株是一种美国专利U.S.5,254,466中记载的热带假丝酵母菌株，菌株H5343(ATCC 20962)。
另一种合适的菌株是一种其中一种或多种还原酶基因被扩增了的菌株，结果由于P450基因扩增而增加了限速ω-羟化酶的量以及流经ω-氧化途径的底物速率。选择性地增加已知对脂肪酸氧化是非常重要的酶的量的菌株也是优选的。这种菌株含有拷贝数增加的CYP和CPR基因。这些基因已被鉴定为是与ω-羟化酶复合物产生有关的那些基因，所述ω-羟化酶复合物催化氧化途径中的第一个步骤。菌株HDC1是一种含有多拷贝数的CYP 52A2A基因的菌株实例，所述基因已被整合到菌株H5343的基因组中。该菌株及其类似菌株被记载在1998年1月5日申请的悬而未决专利申请60/083,798中，其全部内容被引入本文作为参考。可以用于本发明方法的其它菌株是如PCT/US99/20797中所记载的热带假丝酵母菌株HDC1，HDC5，HDC10，HDC15，HDC20，HDC23，HDC23-1，HDC23-2和HDC23-3，其全部内容被引入本文作为参考。
合适的无机氮源包括任何含铵化合物。其实例包括但不限于碱金属硝酸盐或铵盐如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和醋酸铵。优选的氮源是铵盐或通过微生物的代谢作用而产生氨的化合物如脲。一种用于本发明的特别优选的氮源是氨。
所述发酵方法可以通过利用甘油酸酯脂肪或油作为有机氮源和辅助底物来进行修改。与发酵液一起配制的一种脂酶将所述脂肪或油水解或裂解成脂肪酸和甘油。如果提供将游离脂肪酸转化为其相应二酸所必需的能源，微生物通过消耗甘油来促进裂解反应的完成。尤其优选的是油特异性脂酶。油特异性脂酶对油酸含量高的甘油三酯具有高度的选择性并且选择性地催化油酸酯基团的水解。这种油特异性脂酶的实例包括但不限于由假单胞菌属、胎毛腐质菌(Humicolalanuginosa)、皱摺假丝酵母、白地霉和假单胞菌(Burkholderia)。一种特别优选的脂酶是美国专利US5,470,741中记载的来源于白地霉ATCC 74170的UNLipase，该专利的全部内容被引入本文中作为参考。
所述发酵步骤优选地分为三个阶段进行，生长期、诱导期和转化期。每一阶段可以在相同或不同的温度、pH、通气等发酵罐条件下进行。当细胞培养物被接种到发酵罐中时则开始了生长期继而引发快速生长期。取决于所用培养基的组成，生长可以呈指数生长形式或呈接近指数生长的形式。这种生长一直持续到培养物达到线性生长阶段，该线性生长阶段通过测定氧消耗减少来确定。当生长受到培养基的关键营养成分添加速率的限制时就开始了线性生长阶段；因此生长变得与限制性营养成份的补加速率成比例。通常，在本发明的方法中，关键性的营养成分是辅助底物。第二阶段是诱导期。在诱导期中主要代谢活性被启动从而开始了底物向所需产物的转化。诱导培养物前所述培养物可以被维持一段时间的线性生长期。诱导剂通常是底物本身，但对于不能启动其本身转化的化合物来说，可以使用另一种与底物协同作用的诱导剂。所述诱导期可以被用来将快速生长期过渡到转化期。所述发酵进入下一期，即转化期，此时所述底物被转化成产物。
在转化期中，所述发酵液处于pH为2至7的酸性范围。优选的操作pH范围从约3.5至7.0，更优选的范围是约5.0至约6.5。可以通过自动滴加强碱来调控pH，所述强碱的实例是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化铵溶液或氨气。解释一下，通过在该状态下进行的发酵与现有技术中的方法相比，因为氨反应后形成非挥发性的水性铵离子，所以可以使用氨来调控pH。如果在碱性pH条件下操作，现有技术中制备多羧酸的方法不能有效地形成水性铵离子因而引起排除气体中含有不希望有的氨气和发酵液中毒性氨的积累。所述发酵可以在26℃至40℃的温度下进行。
在第一个阶段中，培养基被接种上β-氧化阻断型微生物如β-氧化阻断型热带假丝酵母菌菌株的活化培养物从而开始了快速指数生长。所述培养基的pH通过添加碱，例如包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠或氨气来进行调控。加入发酵罐中的辅助底物优选地是在转化期以补料的形式添加。指数生长期的结束是通过葡萄糖的耗尽、溶氧的快速增加，以及最灵敏地是通过排放气体中的氧的快速增加和CO2的减少来作为标志。在没有诱导底物存在的情况下，生物物质将以与葡萄糖补加速率成比例的速率(即，线性生长)继续积累。理想的是在指数生长结束时或在达到所需生物物质的浓度时启动转化期。如果生产罐的氧传递特性使得所需生物物质浓度通过将培养物维持在指数生长期来达到，那么指数生长期与随后的线性葡萄糖-限制生长期(诱导期)的结合可以被用来获得指定的生物物质浓度。
在向受葡萄糖限制的线性生长期过渡的过程中，为了维持培养物的良好生长状态，可能需要在生长过程中补加葡萄糖以使培养物始终能够获得葡萄糖。初始培养基装料中的葡萄糖浓度根据所使用微生物生长所需的葡萄糖总量减去生长过程中将要补加的葡萄糖量来进行选择。可以在生长开始后的任何时间点开始补加葡萄糖。然而，由于在接种质量和生产罐接种后产生的滞后期方面存在某些差异，优选地是在指数生长期过程中的某一预定生物物质浓度下开始补加葡萄糖，所述生物物质浓度通过直接的生物物质的测定或间接的方法如光密度、二氧化碳排放速率或氧吸收值来确定。所述葡萄糖可以是一种精制玉米浆或非精制玉米浆。葡萄糖可以从罐的顶部通过气体空间以连续流或以持续脉冲或脉动形式补加。所述葡萄糖可以从底部补加到罐中特别是补加到接近搅拌器的高剪切区域以便实现在整个罐内的快速分布。对于大罐来说，可以在同一罐内有多个葡萄糖补加点。
其中底物被氧化的转化期是通过添加一种诱导物和含有一种可氧化甲基的底物来启动。对于链烷烃、脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸盐这种情况，这些底物及其混合物诱导它们自身氧化来生成二羧酸并且可以被用于其它物质的氧化。所述底物可以以间歇形式加入或以连续形式来补加或以一系列脉冲或脉动的形式来补加。所述底物可以从罐顶部通过蒸汽空间加入或从底部加入特别是加到高剪切区域。对于大罐来说可以有多个底物补加点。所述氧化反应在pH小于7的酸性范围内进行并且优选地是在接近氧化形成羧基的pKa或在低于pKa下进行，或者存在于底物中。
当进行转化时，优选地是逐渐减小向发酵罐补加葡萄糖的速率以此防止生物物质和三酰甘油酯的积累。随着商用油酸的转化，胞内贮存空泡的积累是一种非常有用的表示葡萄糖补加速率需要调节的指示指标。通过在转化期内每24小时将补加速率降低约5％至25％而且通常降低约10％来进行调节。还可以使用其它的指示指标如碱的利用率、CO2排放速率或呼吸系数。
发酵过程中经常遇到的问题是在常规碱性pH范围内进行操作的结果是形成了羧酸皂(carboxylic acid soaps)和泡沫。在碱性环境中，羧酸能形成导致发酵液产生多余泡沫的皂。皂的形成导致发酵液pH的降低，结果需要向发酵液中添加碱如苛性碱来将发酵液的pH维持在所需值。而且向碱性环境添加葡萄糖导致影响发酵液pH的碳酸盐的形成。为了补偿对皂的pH和碳酸盐形成的影响，必须向发酵液中添加大量的碱来将发酵液的pH维持在所需值。
已惊奇地发现，通过在2至7，优选地3至7，甚至更优选地5至6.5的酸性pH范围内进行发酵，而不是在苛性碱pH范围内进行发酵，泡沫基本被降低并且降低了由葡萄糖代谢过程中产生的二氧化碳向碳酸盐的转化，因而大大地减少了调控发酵液pH的进料需用量。通过在酸性pH下进行发酵，基本上克服了这些问题从而减少了发酵过程中的碱需用量。在生长反应过程中阳离子的净消耗量超过了阴离子的净消耗量结果降低了培养基的pH。理想地的是在生长过程中通过添加控制pH的碱，将培养基的pH控制在2-7的范围内，优选地约3-6.5的范围内。用于这一目的的碱是氢氧化铵、氨、氢氧化钠和氢氧化钾。理想地是选择一种能够提供一种或多种在生长过程中能被消耗的主要营养成分的碱组分如氢氧化铵、氨和氢氧化钾。生长培养基组分的调节需要考虑pH调控试剂的添加。通过将pH调控试剂和氮源组合到发酵罐的添加原料中，利用NH4OH或氨气来调控pH可以减少培养微生物所需的原料种数。
如果使用诸如氨或氢氧化铵这类氮源，在培养基中仅需要含有250ppm或更少的氮源来启动生长以及这些pH调控试剂的消耗。所述氨浓度在培养物生长过程中仍需要维持稳定。因此诱导时培养基中需要的氨浓度可以通过向初始培养基装料中添加氨或铵盐来进行方便的预选。初始发酵罐装料中使用的含氨氮源包括磷酸铵、硫酸铵、硝酸铵、氨、尿素和氢氧化铵。
本发明的另一方面涉及用于繁殖热带假丝酵母的发酵培养基的配制并且使得含有可氧化甲基的底物被转化为羧酸的产率非常高。通过调节向发酵液补加物质的速率，可以调控所述微生物的生长。在利用葡萄糖的微生物的生长过程中消耗的主要营养成分是含氨氮源、钾、镁、磷酸盐和硫酸盐。虽然钠和钙没有被消耗，但需要的钙浓度为约5-50ppm或更高以便获得取决于接种培养基组分的正常生长。微量无机物和生物素也包含在培养基中。所述生物素可以是纯度较高的或者是以较粗纯度级别的形式如生物素酵母、酵母抽提物或玉米浆液来提供。
使用的磷酸盐来源是磷酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸三钠和磷酸。所用的钾源是硫酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸三钾和苛性钾碱。
一种发酵辅助成分可以被用于链烷烃的氧化和/或脂肪酸的氧化。优选的发酵辅助成分是一种脂肪酸酯，特别优选的发酵辅助成分是一种甲酯。使用这种发酵调控试剂的一个主要益处在于泡沫的控制和发酵液流体特性的调节。如果产物链长分布对于产物基本性能是重要的，由于甲酯也被转化为产物所以理想的是选择类似于链烷烃或脂肪酸链长的甲酯。该酯可以分批添加或混入原料中来添加。如果混入原料，该酯应含有约10％或低于10％，优选地约1％或低于1％的原料。某些商用脂肪酸天然含有一些甲酯并且可以被直接用作生产二羧酸的底物。例如，EMERSOL267(Cognis Corporation)是一种含有约1％或低于1％甲酯的商用油酸并且已被发现是本发明的一种有利底物。一种用于本法发明方法中的常规技术等级的油酸EMERSOL267的组成大约为0.3％C12，2.4％C14，0.6％C14：1，4.7％C16，4.6％C16：1，0.2％C17，0.8％C18，69.9％C18：1，10.5％C18：2，0.3％C18：3。
对于链烷烃被氧化为二羧酸的情况，进一步发现以脂肪酸或脂肪酸盐作为辅助成分是有利的。这导致链烷烃在发酵液中的良好分布。所述脂肪酸可以分批加入或可以被配制到链烷烃原料中。如果被配制到原料中，脂肪酸或脂肪酸盐通常含有约10％或低于10％，优选地5％或低于5％的原料。因此，如果产物链长分布对于产物基本性能是重要的，由于脂肪酸也被转化为产物所以理想的是选择类似于链烷烃的链长分布的脂肪酸。
已惊奇地发现通过将相对于空气饱和度的溶氧浓度值维持在低于约25％，优选地低于20％，则减少了转化期辅助底物的需用量，当溶解氧浓度低于这些值时，能更有效地利用葡萄糖来提供氧化的能量。添加太多葡萄糖的结果造成生物物质和三酰甘油酯的进一步积累，同时减少转化期过程中的羧酸产生。
通过调节初始培养基装料中的镁浓度或镁与磷酸盐的比例可以部分调控或降低产油酵母中三酰甘油酯的形成。发酵接种物中优选的镁浓度是约0.1至约1.0gm/L，更优选地是约0.2至约0.8g/L。优选的磷酸盐∶镁比例是20∶1至约2∶1，优选地15∶1至约3∶1。
已惊奇地发现转化期的发酵液积累具有消耗H2O2的活性的热不稳定性过氧化氢酶类。这可能干扰葡萄糖浓度的分析，该分析测定由葡萄糖氧化产生的H2O2。
本发明方法的优选技术方案是通过油酸的生物氧化来制备9-十八烯二酸。当任何等级的油酸被用作底物时，一种常规技术等级的油酸由下列羧酸组成：0.42％C12；2.7％C14；0.86％C14：1；6.3％C16；4.6％C16：1；0.93％C17；2.8C18；71.8％C18：1；8.3％C18：2；0.58％C18：3。所述油酸还可以是一种来源于Helianthus annuus(向日葵籽油)品种的脂肪油的高等级油酸，所述Helianthus annuus被记载在例如美国专利US4,627,192中，其全部内容被引入本文作为参考。本方法也可以使用其它高油酸品种的油籽。这种油富含油酸并且含有至少70-80％重量的油酸。
通过下列实施例能更好地理解本发明，所有实施例只是用来进行说明的，并不是用来对本发明进行任何不适当的限制。在所有的实施例中，组分浓度以它们的无水形式来表示。如果所述浓度被适当调节到包括水合物的水份，可以使用所列出的通过商业途径获得的组分的水合物。
                         实施例1
制备本发明的培养基，该培养基的组分被列于下面的表1和2中。
                          表1合成的生产培养基                           浓度(g/L)组分葡萄糖                                       27.0硫酸铵                                       7.0磷酸二氢钾                                   5.1硫酸镁                                       0.5氯化钙                                       0.1柠檬酸                                       0.06三氯化铁                                     0.023生物素                                       0.0002痕量金属：
 硼酸                                    0.0009
 硫酸铜                                  0.00007
 碘化钾                                  0.00018
 三氯化铁                                0.00036
 硫酸锰                                  0.00072
 钼酸钠                                  0.00036
 硫酸锌                                  0.00072水                                           余量SAG 471抗泡剂                              0.8ml
表1的培养基组分以适当的方式进行加热灭菌以便避免发生沉淀反应，冷却后被加到灭菌的发酵罐中。未接种的完全培养基被发现非常清澄且是浅稻草色，没有强烈的气味。加入抗泡剂后产生轻微的浑浊。在无菌条件下利用表1所列的培养基，通过对初始液体体积为12L的发酵罐进行搅拌、通气来培养热带假丝酵母H5343 ALK 2-1。所述无菌培养基被接种上5％的热带假丝酵母H5343 ALK 2-1的接种物并在35℃，pH 5.8和通气速率足以使溶氧保持在20％以上的条件下搅拌培养大约10小时。当所述培养物终止指数生长时，溶氧开始上升，转化期通过以下方式来启动：以0.7g/L/小时的速率开始连续补加ExxonDevelopmental Fluid 137的原料流(一种含有约94.4％十三烷的碳氢化合物、其余主要是十二烷)，该原料流与发酵辅助成分1.25％Emersol267(一种技术等级的油酸)和1.25％Emery2203(一种技术等级的甲基油脂(tallowate))混合。与此同时，发酵罐中的温度由35℃降至30℃，通气速率降至0.4vvm，以及对罐施加了0.4巴的反压力。在生长期和转化期利用6N的KOH将PH维持在5.8-5.9之间。当生物物质浓度达到约10g/L时，开始以1.58g葡萄糖/L/小时的速率向发酵罐连续补加葡萄糖。根据每天显微镜的观察结果和对酵母细胞内积累的贮存泡的评估，将转化期中所述葡萄糖的补加速率降低到0-15％。在转化期中向发酵罐加入7ml的PPG(聚丙二醇)抗泡剂来控制轻微的泡沫。转化期进行50小时后，发酵罐中的全部发酵液中含有41.5g/Kg的1，13-十三烷二酸(1，13-tridecanedioic acid)。
                     实施例2
                       表2合成的生产培养基                            浓度(g/L)组分葡萄糖                                        27.0磷酸二氢钾                                    4.9硫酸镁                                        0.6氯化钙                                        0.1柠檬酸                                        0.06三氯化铁                                      0.023生物素                                        0.000012微量金属：
  硫酸铜                                  0.00007
  硫酸锰                                  0.00432
  硫酸锌                                  0.00072
  柠檬酸盐                                0.00708水                                            余量SAG 471抗泡剂                               0.6ml
表2的培养基组分以适当的方式进行灭菌以便避免发生任何沉淀反应，然后被加到灭菌的发酵罐中。未接种的完全培养基被发现非常清澄且是浅稻草色，没有强烈的气味。在无菌条件下利用表2所列的培养基，通过对初始液体体积为12L的发酵罐进行搅拌、通气来培养热带假丝酵母H5343 HDC 23-3。所述无菌培养基被接种上3％的热带假丝酵母H5343 HDC 23-3的接种物并在35℃和通气速率足以使溶氧保持在20％以上的条件下搅拌培养大约12小时。通过添加6N的NH4OH将生长期的pH调节和维持在5.8-5.9，所述NH4OH也是培养基中的无机氮源。当所述培养物终止指数生长时，溶氧开始上升，转化期通过添加一种诱导物质启动并且同时开始以2.0g/L/小时的速率连续补加油含量高的向日葵脂肪酸的原料流(含有84.4％油酸，5.2％亚油酸，4.7％硬脂酸，3.9％棕榈酸，以及含有少量的二十烷酸(20∶0)，eicosaenoic acid(20∶1)，十五烷酸，月硅酸，十四烷酸的其余物质)。与此同时，发酵罐中的温度由35℃降至30℃，通气速率降至0.4vvm，以及将pH调控试剂NH4OH换成NaOH。利用6N NaOH将转化期的pH调节和维持在5.8-5.9。当生物物质浓度达到约10g/L时，开始以1.22g葡萄糖/L/小时的速率向发酵罐连续补加葡萄糖。根据每天显微镜的观察结果和对酵母细胞内积累的贮存泡的评估，将转化期中所述葡萄糖的补加速率降低到0-45％。在转化期中不添加抗泡剂。转化期进行50小时后，发酵罐中的全部发酵液中含有71g/Kg的总二羧酸。
                        实施例3
                          表3合成培养基配制培养基组分                                  浓度(g/L)葡萄糖                                         20.0硫酸铵                                         0.5磷酸二氢钾                                     5.1硫酸镁                                         0.9NaCl                                           0.5氯化钙                                         0.1生物素                                         0.0002痕量金属：
 硼酸                                      0.00075
 硫酸铜                                    0.00006
 碘化钾                                    0.00015
 硫酸铁                                    0.04
 三氯化铁                                  0.0003
 硫酸锰                                    0.0006
 钼酸钠                                    0.0003
 硫酸锌                                    0.0006水                                             余量SAG 471抗泡剂                                2滴
表3的培养基组分以适当的方式进行灭菌以便避免发生沉淀反应，冷却后被加到灭菌的发酵罐中。培养基被发现非常清澄且是浅稻草色，没有气味。加入抗泡剂后产生轻微的浑浊。采用6N氢氧化铵溶液将培养基的pH初调到5.8。在一个搅拌和通气的发酵罐中利用所述培养基并且通过接种以含有相似组分的培养基制备的4％接种物来培养热带假丝酵母H5343(ATCC 20962)。主要滞后期之后开始进行指数生长。当通过光密度测量判断所述培养物含有约5g/L干重的生物物质时，根据初始的培养基体积开始以1.25g/L/小时的速率补加葡萄糖。当葡萄糖成为生长的限制因素且整个过程的指数生长速率刚有所下降时，指数生长继续进行约9小时。
当快速生长期结束时，pH调控试剂被换成6N的氢氧化钾溶液并且继续恒定地补加葡萄糖110小时。在此期间，其浓度在整个指数生长期中维持恒定的铵被从所述培养基中耗尽并且磷酸盐的浓度降到很低的值。尽管这些关键性营养成分被消耗了，但是生物物质仍继续以恒定的线性速率在培养基中积累。活细胞数也呈线性增长态势直至培养基中的铵被耗尽，之后活细胞数保持恒定。最后，所述发酵培养生产出71.5g/L干重的生物物质。
                 对比实施例1合成的生产培养基                           浓度(g/L)葡萄糖                                       40.0硫酸铵                                       8.0玉米浆                                       9.0磷酸二氢钾                                   2.0磷酸氢二钾                                   1.0硫酸镁                                       0.5NaCl                                         0.5氯化钙                                       0.1痕量金属：
 硼酸                                    0.00075
 硫酸铜                                  0.00006
 碘化钾                               0.00015
 三氯化铁                             0.0003
 硫酸锰                               0.0006
 钼酸钠                               0.0003
 硫酸锌                               0.0006SAG 471抗泡剂                           2滴
对比实施例1的培养基组分以适当的方式进行灭菌以便避免发生任何沉淀反应，然后被加到灭菌的发酵罐中。未接种的完全培养基被发现颜色非常暗，带有强烈的玉米浆气味。在无菌条件下利用表3所列的培养基，通过对初始液体体积为10L的发酵罐进行搅拌、通气来培养热带假丝酵母H5343(ATCC 20962)。所述无菌培养基被接种上6％的热带假丝酵母H5343(ATCC 20962)的接种物并在35℃和通气速率足以使溶氧保持在20％以上的条件下搅拌培养大约9.5小时。生长过程中添加5ml的SAG 471抗泡剂来控制培养基中的泡沫。通过添加6N的NH4OH将生长期的pH调节和维持在5.8-5.9。当所述培养物终止指数生长时，溶氧开始上升，开始以2.0g/L/小时的速率连续补加Emersol267(含有71.8％油酸，8.3％亚油酸，6.3％棕榈酸，4.6％棕榈油酸，2.8％硬脂酸，2.7％十四烷酸，0.93％C17：0酸，0.86％肉豆蔻脑酸，0.58％亚麻酸和0.42％月硅酸的商用等级的油酸)来启动转化期。与此同时，发酵罐中的温度由35℃降至30℃，通气速率降至1.2vvm，以及将pH调控试剂NH4OH换成KOH。利用6N KOH将转化期的pH调节和维持在5.8或5.8以上。当指数生长期结束而转化期刚开始时，开始以1.8g/L/小时的速率向发酵罐连续补加葡萄糖。整个转化期过程中维持该补加葡萄糖的速率不变。在转化期的前3个小时向发酵罐中添加17ml的SAG 471抗泡剂以便控制严重的泡沫。转化期进行50小时候，发酵罐中的全部发酵液中含有64g/Kg的总二羧酸。

Claims (28)

1.一种发酵培养基，其含有：
(a)一种可代谢的碳源和能源；
(b)一种无机氮源；
(c)一种磷酸盐源；
(d)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物的金属元素；和
(e)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源。
2.如权利要求1所述的培养基，其中所述的可代谢的碳源和能源是葡萄糖。
3.如权利要求1所述的培养基，其中所述的无机氮源是硫酸铵。
4.如权利要求1所述的培养基，其中所述的无机氮源是氨。
5.如权利要求1所述的培养基，其中所述的无机氮源是氢氧化铵。
6.如权利要求1所述的培养基，其中所述的磷酸盐源是磷酸钾。
7.如权利要求1所述的培养基，其中所述的金属元素是钙。
8.如权利要求1所述的培养基，其中所述的金属元素是镁。
9.如权利要求1所述的培养基，其中所述的金属元素是钙和镁。
10.如权利要求1所述的培养基，其还含有一种抗泡剂。
11.如权利要求1所述的培养基，其还含有一种螯合剂。
12.如权利要求1所述的培养基，其还含有至少一种痕量金属。
13.一种发酵培养基，其含有：
(a)葡萄糖；
(b)一种铵盐；
(c)一种磷酸盐；
(d)一种钾盐；
(e)一种硫酸镁；
(f)一种钙盐；
(g)一种铁盐；
(h)一种螯合剂；和
(i)  一种痕量金属。
14.一种制备一种多羧酸、一种多元醇或一种多羟基酸的方法，其包括：
(a)提供一种能够产生一种多羧酸、一种多元醇或一种多羟基酸的微生物；
(b)提供一种能被所述微生物转化为一种多羧酸、一种多元醇和一种多羟基酸的底物；
(c)提供一种含有下列成分的培养基：
(i)一种可代谢的碳源和能源；
(ii)一种无机氮源；
(iii)一种磷酸盐源；
(iv)至少一种选自碱金属元素、碱土金属元素、过渡金属元素及其混合物的金属元素；和
(v)一种基本不含微粒物质和细菌的生物素源；和
(d)在所述发酵培养基中对所述微生物和底物进行发酵。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述微生物是热带假丝酵母。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述底物是一种具有约4至约25个碳原子的链烷烃。
17.如权利要求14所述的方法，其中所述的可代谢的碳源和能源是葡萄糖。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述的无机氮源是硫酸铵。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述的磷酸盐源是磷酸钾。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述的金属元素是钙。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述的金属元素是镁。
22.如权利要求14所述的方法，其中所述的金属元素是钙和镁。
23.如权利要求14所述的方法，其中所述培养基还含有一种螯合剂。
24.如权利要求14所述的方法，其中所述培养基还含有一种抗泡剂。
25.如权利要求14所述的方法，其中所述培养基还含有至少一种痕量金属元素。
26.如权利要求14所述的方法，其中所述步骤(d)是在pH大约至多为7的条件下进行。
27.如权利要求14所述的方法，其在步骤(d)中还包括将溶氧浓度值维持在低于大约25％。
28.如权利要求14所述的方法，其中所述无机氮选自氨、氢氧化铵及其混合物。
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