MXPA01002579A - Proceso para fabricar acidos policarboxilicos. - Google Patents

Abstract

Acidos policarboxilicos alifaticos se hacen por un proceso que comprende las etapas de: (1) fermentar una celula C. tropicalis con beta-oxidacion bloqueada en donde ambas copias del gen POX5 cromosomico y los genes POX4A y POX4B cromosomicos se separan en un medio de cultivo comprendiendo una fuente de nitrogeno, un sustrato organico y un co-sustrato en donde el sustrato es un compuesto alifatico no saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable en un grupo carboxilo por bioxidacion; (2) hacer reaccionar el producto de la etapa (1) con un agente oxidante para producir uno o mas acidos policarboxilicos.

Description

PROCESO PARA FABRICAR CIDOS POLICARBOXILICOS ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. Campo de la Invención Esta invención se refiere a un proceso para fabricar un ácido policarboxílico alifático por el desdoblamiento oxidativo de uno o más dobles enlaces carbono-carbono interno en un compuesto alifático no saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carooxilo por bioxidación. 2. Descripción de la Técnica Relacionada Los ácidos policarboxílicos alifáticos son intermedios químicos versátiles útiles como materias primas para la preparación de perfumes, polímeros, adhesivos y antibióticos macrolid. Los ácidos dicarboxílicos alifáticos son una subclase especialmente importante de ácidos policarboxílicos los cuales incluyen ácidos comercialmente importantes tales como ácido adípico, ácido maleico, ácido sebácico, ácido azelaico, ácido dodecandioico y ácido dímero. Estos ácidos dicarboxílicos se hacen normalmente de materiales iniciales basados en petróleo, excepto ácido azelaico (ácido nonandioico) y ácido sebácico (ácido decandioico) , los cuales se producen de grasas y aceites naturales en cantidades multimillonarias de kilogramos . El ácido azelaico se usa en la fabricación de elastómeros de uretano, películas y adhesivos de poliéster, plastificantes , y lubricantes sintéticos. El ácido azelaico es el único ácido dicarboxílico alifático que tiene un número impar de átomos de carbono que está disponible en grandes cantidades . El ácido azelaico se produce comercialmente por azonólisis del ácido oleico como se describe en la Patente Norteamericana 2,813,113, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. En general, el proceso involucra la ozonización del ácido oleico para formar una mezcla de ozónidos y la elaboración oxidativa subsecuente para formar ácido azelaico y ácido pelargónico en una cantidad aproximadamente equimolar. Una desventaja principal de este proceso es que cada mol de ácido oleico produce un mol de ácido azelaico y ácido pelargónico, un subproducto menos deseable del proceso. Una forma de limitar o eliminar la producción del ácido pelargónico es usar el ácido ?-dicarboxílico derivado del ácido oleico, ácido 9-octadecendioico en lugar de ácido oleico. Puesto que el doble enlace carbono-carbono en el ácido 9-octadecendioico es simétrico con respecto a los grupos ácido carboxílico terminales, el producto de ozonólisis de cada mol de ácido 9-octadecendioico produciría 2 moles de ácido azelaico y sin ácido pelargónico. Mientras que diversas rutas químicas para la síntesis de ácidos a, ?-dicarboxílicos de cadena larga tales como el ácido 9-octadecendioico están disponibles, tales métodos son complejos y normalmente resultan en mezclas que contienen longitudes de cadena más cortas. Como resultado, son necesarias etapas de purificación extensivas. Como una alternativa a la síntesis química, los ácidos a, ODdicarboxílicos de cadena larga tales como el ácido 9-octadecendioico pueden hacerse por medio de métodos de fermentación tales como transformación microbiana de los hidrocarburos correspondientes tales como alcanos o alquenos, ácidos grasos o esteres de los mismos. Un método para producir ácidos a, ?-dicarboxílicos sustancialmente puros con rendimiento sustancialmente cuantitativo se describe en la Patente Norteamericana 5,254,466, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. Este método comprende cultivar una cepa de C. tropicalis en donde ambas copias del cromosoma POX5 y cada uno de los genes POX4A y POX4B se separan en un medio de cultivo que contiene una fuente de nitrógeno, un sustrato orgánico y un co-sustrato. Puesto que la fabricación de ácidos policarboxílicos tales como ácido azelaico con alto rendimiento por medio de métodos químicos es difícil, sería deseable tener un método que resulte en ácidos policarboxílicos alifáticos con alto rendimiento con un mínimo de subproductos no deseados. Es por lo tanto, un objeto de la presente invención proporcionar ácidos policarboxílicos alifáticos con alto rendimiento con un mínimo de subproductos indeseados. Es también un objeto de la presente invención proporcionar un tipo específico de ácidos policarboxílicos, ácidos a,?-dicarboxílicos, por medio de una combinación de métodos bioquímicos y químicos. Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar ácido azelaico con rendimientos incrementados relativos al proceso comercial existente por ozonólisis del ácido 9-octadecendioico producido por fermentación de C. tropicalis genéticamente modificada.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En su aspecto más amplio, la presente invención se refiere a un proceso para hacer un ácido policarboxílico alifático por un proceso que combina etapas de procesamiento bioquímicas y químicas. La primera etapa del proceso es una etapa de biooxidación que comprende fermentar células de C . tropicalis con beta-oxidación bloqueada en donde ambas copias del gen P0X5 cromosómicos y los genes POX4A y POX4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo que está comprendido de una fuente de nitrógeno, un sustrato orgánico y un co-sustrato. El sustrato orgánico es un compuesto alifático no saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carboxilo por bioxidación. Durante la fermentación cada grupo metilo terminal y/o grupo funcional terminal que es susceptible a biooxidación se oxida a un grupo carboxilo. El compuesto así producido es un compuesto alifático que tiene al menos un grupo carboxilo y al menos un doble enlace carbono-carbono. La segunda etapa de proceso es una etapa de oxidación química la cual involucra la reacción del producto de la primera etapa del proceso con un agente oxidante para desdoblar oxidativamente los dobles enlaces carbono-carbono a grupos carboxilos para formar uno o más ácidos policarboxílicos. Una modalidad preferida de la presente invención es Un proceso para hacer ácido azelaico que comprende las etapas de: (1) fermentar células de C. tropicalis con beta-oxidación bloqueada en donde ambas copias del gen POX5 cromosómico y los genes POX4A y POX4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo que comprende una fuente de nitrógeno, ácido oleico y un co-sustrato para producir ácido 9-octadecendioico; (2) hace reaccionar ácido 9-octadecendioico con un agente oxidante para producir ácido azelaico.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una representación gráfica de la velocidad de producción del ácido 9-octadecendioico como se estableció en los Ejemplos 3, 5 y 6. La Figura 2 es una representación gráfica de la velocidad de producción del ácido 9-octadecendioico como se indica en los Ejemplos 7, 8 y 9.

DESCRIPCIÓN DE LAS MODALID.ADES PREFERIDAS Para los propósitos de la presente invención, un ácido policarboxílico es cualquier compuesto que tiene dos o más grupos carboxilo. Un doble enlace carbono-carbono interno es uno en el cual cada átomo de carbono de doble enlace se une al menos a otro átomo de carbono. El ejemplo más simple de un compuesto que tiene un doble enlace carbono-carbono interno es 2-buteno. La primera etapa del proceso de acuerdo con la invención comprende fermentar células de C. tropicalis de beta-oxidación bloqueada en donde ambas copias el gen P0X5 cromosómicos y los genes POX4A y POX4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo el cual está comprendido de una fuente de nitrógeno, un sustrato orgánico, y un co-sustrato. El sustrato orgánico puede ser cualquier compuesto alifático no saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carboxilo por biooxidación. La célula C. tropicalis con beta-oxidación bloqueada es una cepa C. tropicalis genéticamente modificada en donde los genes P0X4A, P0X4B y P0X5 cromosómicos han sido separados. El flujo de sustrato en esta cepa se redirige a la ruta omega-oxidación como el resultado de la inactivación funcional de competencia para la separación de la trayectoria de ß-oxidación del gen POX. La cepa también puede tener uno o más genes más citocromos P450 (P450ALK) y/o genes reductasa (P450RED) amplificados lo cual resulta en incremento en la cantidad de omega-hidroxilasa que limita la velocidad a través de la amplificación del gen P450 y un incremento en la velocidad del flujo del sustrato a través de la ruta ?-oxidación. Las cepas preferidas son H5343, AR40 y R24. La cepa H5343 tiene el número de acceso ATCC ATCC 20962 y se describe en la patente Norteamericana 5,254,466, el contenido completo de los cuales se incorpora en la presente para referencia. La cepa AR40 son células de C. tropicalis que son una cepa H 5343 amplificada en donde todos los cuatro genes P0X4 y ambas copias de los genes P0X5 cromosómicos se separan por un marcador seleccionable URA3 y el cual también contiene 3 copias adicionales del gen citocroma P450 y 2 copias adicionales del gen de reductasa, el gen P450RED. La cepa AR40 tiene número de acceso ATCC ATCC 20987. La cepa R24 es una cepa H 5343 amplificada en la cual todos los cuatro genes P0X4 y ambas copias de los genes P0X5 cromosómicos se separan por un marcador seleccionable URA3 y el cual contiene también copias múltiples del gen reductasa. Las cepas AR40 y R24 se describen en número de serie de solicitud copendiente 07/975,154, presentada el 11/12/92, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. El sustrato orgánico es cualquier compuesto alifático no saturado que tiene un doble enlace carbono-carbono y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carboxilo por biooxidación. Un grupo funcional terminal el cual es un derivado de un grupo carboxilo puede estar presente en la molécula sustrato y puede convertirse a un grupo carboxilo por una reacción distinta a la biooxidación. Por ejemplo, si el grupo terminal es un éster ni la C. tropicalis del tipo nativo o las modificaciones genéticas descritas en la presente hidrolizarán la funcionalidad éster en un grupo carboxilo. En tal caso, puede agregarse una lipasa durante la etapa de fermentación para liberar los ácidos grasos libres . Ejemplos de sustratos orgánicos que pueden usarse en el proceso de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a olefinas internas tales como 2-penteno, 2-hexeno, 3-hexeno, 9-octadeceno y similares; ácidos carboxílicos no saturados tales como ácido 2-hexenoico y esteres del mismo, ácido oleico y esteres de los mismos que incluyen triglicerilésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido oleico, ácido erúcico y esteres de los mismos que incluye triglicerilésteres que tienen un contenido de ácido erúcico relativamente alto, ácido ricinoleico y esteres del mismo que incluyen triglicerilésteres que tienen un contenido de ácido ricinoleico relativamente alto, ácido linoelico y esteres del mismo que incluyen triglicerilésteres que tienen un contenido relativamente alto de ácido oleico; alcoholes no saturados tales como 3-hexen-l-ol, 9-octadecen-l-ol y similares; aldehidos no saturados tales como 3-hexen-l-al, 9-octadecen-1-al y similares. En adición a lo anterior, el sustrato orgánico el cual puede usarse en el proceso de acuerdo con la invención incluye compuestos alicíclicos que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carboxilo por biooxidación. Los ejemplos de tales compuestos incluyen, pero no se limitan a 3, 6-dimetil-l, 4-ciclohexandieno; 3-metilciclohexeno; 3-metil-l, 4-ciclohexadieno y los similares. La etapa de fermentación se llevó a cabo preferiblemente en dos etapas. En la primera etapa, un medio de cultivo se inocula con un cultivo activo de cepa C^ tropicalis con beta-oxidación bloqueada en donde un periodo de crecimiento exponencial rápido ocurre. En la segunda etapa, la cual ocurre como el crecimiento de la célula de la primera etapa entra a la fase estacionaria, el sustrato se agrega en donde toma la bioxidación descrita en la presente. Puesto que no más energía puede producirse desde el sustrato en las cepas con beta-oxidación bloqueada, es necesario agregar un co-sustrato. El co-sustrato es un carbohidrato fermentable tal como glucosa, fructosa, maltosa, glicerol y acetato de sodio. El co-sustrato preferido es glucosa, preferiblemente un jarabe de glucosa líquido, por ejemplo, jarabe equivalente a 95% de dextrosa, o aún jarabes equivalentes a dextrosa inferior. Tales materiales contienen pequeñas cantidades de disacáridos, trisacáridos , y polisacáridos que pueden hidrolizarse durante la fermentación por la adición de una enzima amilasa tal como a-amilasa, glucoamilasa y celulosa. Esta glucosa puede proporcionarse in situ en una reacción simultánea con la biooxidación. Las condiciones de fermentación y los procedimientos son aproximadamente los mismos como aquellos descritos en la patente Norteamericana 5,254,466. La etapa de fermentación puede modificarse al utilizar una grasa o aceite triglicérido como la fuente del sustrato o co-sustrato orgánico. Una lipasa formulada con el caldo de fermentación, hidroliza y divide una grasa o aceite en ácidos grasos y glicerina. El consumo de glicerina por el organismo sirve para impulsar la reacción de división por completo mientras que proporciona la energía necesaria para convertir los ácidos grasos libres en sus ácidos dibásicos correspondientes. Se prefieren particularmente las lipasas que son oleo-específicas . Las lipasas oleo-específicas exhiben una alta selectividad para un triglicérido que tiene un contenido -alto de ácido oleico y catalizar selectivamente la hidrólisis del grupos éster oleato. Ejemplos de tales lipasas oleo-específicas incluyen, pero no se limitan a las lipasas producidas por Pseudomonas sp, Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum, y Pseudomonas (Burkholderia) . Una lipasa particularmente preferida es UNLipase de Geotrichum candidum ATCC No. 74179 descrita en la Patente Norteamericana 5,470,741, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. La segunda etapa del proceso implica la reacción del producto de la primera etapa del proceso con un agente de oxidación para desdoblar oxidativamente los dobles enlaces carbono-carbono en grupos carboxilo para formar un ácido policarboxílico . El desdoblamiento oxidativo de los dobles enlaces carbono-carbono puede lograrse con cualquier agente de oxidación conocido en la técnica el cual oxidativamente desdoblará un doble enlace carbono-carbono para formar dos grupos carboxilo. Tales métodos incluyen pero no se limitan a la reacción con ozono y subsecuente a la reacción oxidativa de los ozonidos como se describe en la patente 2,813,113, el contenido completo del cual se incorpora en la presente para referencia; la reacción con ácido túngstico en la presencia de peróxido ácido, preferiblemente peróxido ácido al 60% como se describe en WO 94/101122, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. La reacción con ácido crómico como se describe en la Patente Norteamericana 2,450,858, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia; la reacción con hipoclorito en presencia de óxido rutenio como se describe en J. Am. Oil Chem. Soc., 54, 870A (1977) el contenido completo del cual se incorpora en la presente para referencia; oxidación con permanganato como se describe en J. Am. Oil Chem. Soc., 54, 858A (1977), el contenido completo del cual se incorpora en la presente para referencia; oxidación con ácido peroxifórmico como se describe en la Patente Norteamericana 5,380,928, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia; oxidación catalizada por peróxido con bromuro de cobalto como se describe en la Patente Norteamericana 4,606,863, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia; oxidación con ácido fosfotúgnstico catalizada con cloruro de cetilpiridinio como se describe en la JP 0183639, el contenido' completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. Una modalidad preferida de la presente invención es un proceso para uno o más ácidos dicarboxílicos saturados desde un sustrato de ácido dicarboxílico no saturado sencillo, que contiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono que están presentes en una cadena de carbono terminada en al menos uno de los grupos carboxilo. El número total de átomos de carbono en el producto de ácido dicarboxílico saturado es igual al' número de átomos de carbono en el ácido dicarboxílico no saturado. Por ejemplo, 2 moléculas de ácido azelaico (ácido de Cg) se hacen por la oxidación del doble enlace carbono-carbono de una molécula de ácido 9-octadecendioico (ácido de Cíe) . En otro ejemplo, se hace una molécula de ácido azelaico (ácido de Cg) , ácido malónico (ácido de C3) , y ácido 1, 6-hexandioico (ácido de Ce) se hace al oxidar los dos dobles enlaces carbono-carbono de una molécula de ácido linoleico (ácido 9,12-octadecadiendioico un ácido de Cis) . Otra modalidad preferida de la invención es la preparación de ácido azelaico por la biooxidación de ácido oleico para formar ácido 9-octadecendioico seguido por la oxidación del ácido 9-octadecendioico a ácido azelaico. Mientras que cualquier grado de ácido oleico puede usarse como sustrato, un ácido oleico grado técnico típico consiste de los siguientes ácidos carboxílicos: 0.42% de Ci2; 2.7% de C?4; 0.86% de C?4:?; 6.3% de d6; 4.6% de Cien; 0.93% de C?7; 2.8 de C?8; 71.8% de C?8:?; 8.3% de C?8:2; 0.58% de C?8:3. El ácido oleico también pueden ser un ácido oleico de alto grado obtenido de un ácido graso de una especie de Helianthus annuus (aceite de semilla de girasol) descrita, por ejemplo, en la Paítente Norteamericana No. 4,627,192, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. Tales aceites son muy ricos en ácido oleico y contienen al menos 80% en peso de oleico. Después de que ha sido obtenido el ácido 9-octadecendioico por el método de biooxidación descrito en la presente, se hace reaccionar con ozono y se trata adicionalmente bajo condiciones de oxidación para producir ácido azelaico. Los productos mezclados de oxidación se oxidan después adicionalmente a ácido azelaico como, por ejemplo, en el método descrito en la patente Norteamericana 5,420,316, el contenido completo de la cual se incorpora en la presente para referencia. Se contempla un número de variaciones de la preparación de ácido azelaico anterior en la presente invención. Por ejemplo, esteres simples de ácido oleico tales como oleato de metilo, oleato de etilo y similares pueden usarse en lugar de ácido oleico en la producción de ácido 9-octadecendioico así como grasas de aceites naturales que tienen un contenido relativamente alto de ácido oleico.

Los siguientes ejemplos tienden a ilustrar pero no limitar la invención.

EJEMPLO 1 MÉTODO MEJORADO PARA PREPAJ?AR ÁCIDOS DICARBOXILICOS Se cargó un termentador con un medio de crecimiento semisintético que tiene la composición de 75 g/1 de glucosa (anhidra), 6.7 g/1 de Base Nitrogenada de Levadura (Difco Laboratories), 3 g/1 de extracto de levadura, 3 g/1 de sulfato de amonio, 2 g/1 de fosfato de monopotasio, 0.5 g/1 de cloruro de sodio. Los componentes se hicieron como soluciones concentradas para la autoclave y después se agregaron al termentador al enfriarse: el pH final fue aproximadamente 5.2. Esta carga se inoculó con 5-10% de un cultivo durante la noche de C^ tropicalis H5343 preparado en un medio YM (Difco Laboratories) como se describe en los métodos de los Ejemplos 17 y 20 de la Patente Norteamericana 5,254,466. Las células se cultivaron después hasta aproximadamente 15 g de peso seco/1 limitado por el nitrógeno disponible en el medio. Hubo un ligero exceso de la cantidad estequiométrica de glucosa en la carga anterior que permaneció durante aproximadamente 4-5 horas después del agotamiento de las fuentes de nitrógeno. Se suministró aire y agitación para mantener el oxígeno disuelto a más de aproximadamente 40% de saturación versus aire. Menos oxígeno disuelto resultó en la acumulación in situ sustancial en productos catabólicos de glucosa parciales, principalmente etanol. El pH se mantuvo a aproximadamente 5 por la adición de sosa cáustica 5N para control de pH . Se agregó un ácido oleico grado técnico que tiene la siguiente composición: 0.30% de C?2; 2.4% de C?4; 0.60% de C?4:?; 4.7% de C16 r 4.6% de Ci6:i; 0.20% de C? , 0.80 de C?8; 69.9% de C?8:?, 10.50% de C?8:2; 0.30% de Ci8:3 (100 g/1) en forma de lote y la alimentación del co-sustrato de glucosa (1.6 g/l/hora) se empieza cerca del tiempo en que el cultivo entra a la fase estacionaria para iniciar la omega oxidación. Una pequeña cantidad de cáustica se agregó para control de pH durante la transformación para mantener el pH a 5.0. No se formó espuma en ningún momento durante la transformación. Después de 140 horas del tiempo de transformación, el análisis GLC de extracto de fermentación indicó que 45% de las cuentas de área C18:l totales aparecieron como el diácido correspondiente, la mayoría del cual se acumularon durante las últimas 70 horas de transformación. Otros componentes alimentados con ozono siguieron un patrón similar. Poco diácido, sin embargo, se acumuló durante las primeras 60 horas de transformación.

EJEMPLO 2 MÉTODO MEJORADO PARA PREPARAR ÁCIDOS DICARBOXILICOS El siguiente método es una mejoría sobre el método del Ejemplo 1 porque sustancialmente corta en periodo de inducción aparente para saponificar parcialmente el ácido oleico para formar un jabón metálico antes de la adición al termentador . Así una fermentación conducida como en el Ejemplo 1 se modificó al agregar primero 0.0098 g de KOH y 0.04 g de agua por gramo de ácido oleico para saponificar parcialmente el ácido oleico. Esta mezcla se agregó a la fermentación para dar 50 g/1 de ácido oleico en el caldo de fermentación. La reacción de saponificación se integra convenientemente con una esterilización térmica de la alimentación, si así se desea, para impulsar la reacción de saponificación hasta consumación. En contraste a los resultados del Ejemplo 1, la acumulación de ácido dibásico comenzó dentro de las 24 horas después de la adición de los ácidos grasos parcialmente saponificados. Después de 115 horas de tiempo de transformación, 66.7% de las cuentas de área C18:l totales aparecieron como ácido dibásico. Ocurrió algo de espumado temprano durante la transformación lo cual se manejó fácilmente por medios químicos o mecánicos.

EJEMPLO 3 PROCEDIMIENTO PARA HACER ACIDO AZELAICO DE ACIDO 9- OCTADECENDIOICO El ácido dibásico del Ejemplo 2 se trató con un gas que contiene 5 v/o de ozono con el balance de 02 a una velocidad de suministro de 0.00644 mmoles de 03 por minuto de ácido oleico presente en la mezcla de ácido por minuto durante 2.5-3.0 horas a 23-25°C. El gas es suministrado a través de una barrera convencional con un tamaño de poro de 147-174 µm. Posteriormente, el gas nitrógeno se pegó a una mezcla de reacción posterior durante 15 minutos, para liberar la mezcla sustancialmente de ya sea la forma de oxígeno gaseoso . Una cantidad de 23 gramos de una mezcla preparada como se describió anterior se colocó junto con 0.30 g de un catalizador de Na-X Zeolita se colocó en un reactor. El reactor se colocó en una temperatura controlada en un baño de agua de temperatura controlada y se pegó con nitrógeno mientras la temperatura se mantenía 10° bajo la temperatura de reacción deseado de 60°C. El controlador de temperatura para el oaño de agua se fijo entonces para incrementar la temperatura hasta la temperatura de reacción deseada. Cuando la temperatura de reacción deseada es alcanzada en un baño de agua, el flujo de gas es cambiado de nitrógeno a oxígeno a una velocidad de 350 ml/minutos. La reacción se continuó hasta que el contenido de peróxido alcanzó aproximadamente 0.25 mmoles 0-0/gramo por el método descrito en el Ejemplo 10 de la Patente Norteamericana 5,420,316. El producto debe contener ácido azelaico sustancialmente libre de ácido pelargónico.

EJEMPLO 4 PROCEDIMIENTO PARA HACER ACIDO 9-OCTADECENDIOICO UTILIZANDO UNA GRASA DE TRIGLICERIDO O ACEITE COMO LA FUENTE DE CARBOHIDRATO Y EL SUSTRATO ORGÁNICO Un medio de fermentación está comprendido de: (1) nutrientes de crecimiento y sales minerales, (2) un triglicérido más alto de ácido oleico, y (3) uno o más lipasas capaces de hidrolizar el aceite triglicérido (tal como ácido oleico alto de girasol o aceite de cánola) , se preparó e inoculó con C. tropicalis H5343. Los nutrientes de crecimiento y sales minerales se seleccionan para soportar el crecimiento de C. tropicalis y mantener la actividad de la lipasa y catalizadores C . tropicalis . Por lo menos una lipasa es capaz de hidrolizar efectivamente ácidos grasos en todas las tres posiciones incluso, sin embargo, lipasas 1,3-específicas, pueden también ser usadas en combinación con la lipasa ro selectiva si así se desea. Las cantidades suplementarias de carbohidrato, además de aquel estequiométricamente disponible de la reacción de división del aceite, puede también ser agregado si así se desea. La fermentación resultante, junto con la división del aceite in situ, producirá un producto que tiene un alto contenido de ácido 9-octadecendioico .

EJEMPLO 5 PREPARACIÓN DEL INOCULO FERMENTADOR DE CANDIDA TROPICALIS H5343 Candida tropical is H5343 se almacena en ampolletas de 2ml con glicerol crioprotector a -60 a -70°C para uso como inoculo termentador. Las células se revivieron por descontrolado rápido de una ampolla de 1 mi de reserva en 20 mi de caldo YM estéril (Difco Laboratories) . El caldo YM es un medio complejo adecuado para cultivar un rango amplio de levaduras y moldes. Este pre-cultivo se incubó en un agitador orbital a 300 rpm a 30°C durante 15 horas. Tres mi de este pre-cultivo se usó después para inocular 500-550 mi de caldo YM estéril. Estos se incubaron subsecuentemente durante 14- 18 horas sobre un agitador orbital a 300 rpm a 30°C para uso como inoculo de termentador.

EJEMPLO 6 CRECIMIENTO DE CANDIDA TROPICALIS H5343 PARA FERMENTACIONES Un medio de crecimiento semisintético se seleccionó para crecer células de levadura el cual fue similar al descrito previamente por Picataggio et al. (Bio/technology, 10, 1992, pp 894-898) . El medio de crecimiento contiene (g/1 a menos qae se indique lo contrario) : Grupo 1 Glucosa 70 Grupo 2 Base Nitrogenada de Levadura 6.7 Grupo 3 Extracto de Levadura 3 Grupo 4 Sulfato de .Amonio 3 Fosfato monopotásico 2 Cloruro de sodio 0.5 Grupo 5 Sulfato de magnesio 0.5 Grupo 6 Cloruro de calcio 0.1 Grupo 7 Sulfato ferroso 0.04 Grupo 8 Antiespumante 2 mi La Base Nitrógeno de Levadura y Extracto de Levadura son productos de Difco Laboratories. El antiespumante fue SAG 471, un producto de Union Carbide. En algunos casos, los componentes hidratados se usaron con - ? ^-^ - ---"-- -^^ - -**^ corrección apropiada para agua de hidratación. Los componentes del grupo 4 se esterilizaron y se fermentaron. Otros componentes se esterilizaron separadamente y se agregaron al termentador después de enfriamiento. El grupo 7 se acidificó con ácido sulfúrico y después se filtró por esterilización. El pH final de la mezcla fue aproximadamente 5.2. Las concentraciones de los componentes se ajustaron, como se anotó, en algunos ejemplos de oxidación de ácido graso. El fermentaron fue un termentador Chemap de 20 litros equipado con una flecha agitadora impulsada desde el fondo por la cual se montaron tres turbinas Rushton y se cargó típicamente con 10 litros de medio de crecimiento. El termentador se inoculó con inoculo preparado en el Ejemplo 5. La temperatura se mantuvo a 30-35°C y el oxígeno disuelto se mantuvo a 30% o mayor para prevenir la formación de etanol en la presencia de exceso de glucosa usando una combinación de aereación, agitación y contrapresión de recipiente. Manteniendo un nivel de oxígeno disuelto de 30% cerca del final de la fase de crecimiento cuando la población celular se vuelve bastante densa fue difícil, y el nivel de oxígeno disuelto caería por debajo de 30% durante un corto periodo de tiempo antes de que ocurriera la fase estacionaria. El pH se controla a 5.0 usando hidróxido de sodio 5N o hidróxido de potasio 5N. Las células se cultivaron después en crecimiento exponencial. Una fermentación típica consume aproximadamente 300 mi de base durante el crecimiento para el control de pH. La entrada dentro de la fase estacionaria comenzó cuando el medio de cultivó se agotó de nitrógeno y fue fácilmente detectado por un rápido aumento en el oxígeno disuelto y un aumento algo menor en el pH . No se hicieron ajustes al pH para neutralizar los incrementos naturales de pH . La población de la fase estacionaria final fue de 4 x 10E9 CFU/ml o aproximadamente 38 gramos de peso por litro. Una alimentación del co-sustrato de glucosa (50% de glucosa en agua) se suministró al cultivo de la fase estacionaria para el mantenimiento celular y para suministrar las necesidades de energía asociadas con la producción de ácidos dicarboxílicos .

EJEMPLO 7 OXIDACIÓN DE ACIDO OLEICO EN ÁCIDOS DICARBOXILICOS Un ácido oleico de grado técnico que tiene la composición aproximada 0.3% de C12, 2.4% de C14, 0.6% de C14:l, 4.7% de C16, 4.6% de C16:l, 0.2% de C17, 0.8% de C18, 69.9% de C18:l, 10.5% de C18:2, 0.3% de C18:3 es como se define E267. Un .cultivo de fase estacionaria se preparó utilizando el método del Ejemplo 2 excepto usando glucosa 75 g/1 y omitiendo los grupos componentes 5, 6, y 7. El pH fue controlado a pH 5 por adición automática de Hidróxido de sodio 5N . La solución alimentada con glucosa se suministró a 32 g/hr y 1000 g de E267 se agregó por lotes a medida que el cultivo entró a la fase estacionaria para comenzar la oxidación de E267 a los ácidos dicarboxílicos. La oxidación de E267 procedió a pH 5 como se muestra en la Figura 1. 180 mi adicional de Hidróxido de sodio 5N y 2057 g de solución de glucosa se consumió durante la oxidación del ácido graso. Sorprendentemente no se requirió antiespumante durante la fase de oxidación y no se vieron problemas de viscosidades con el caldo de fermentación. El análisis cromatográfico de gases mostró que el análisis 9-octadecendioico se acumuló hasta 20 g/kg. Ese análisis también mostró que otros componentes de ácido graso de E267 se convirtieron de la misma forma en su correspondiente ácido dicarboxílico dando un total de ácidos dicarboxílicos acumulados en el caldo de fermentación de 29 g/kg. Este ejemplo proporciona un método para preparar ácidos dicarboxílicos a un pH ácido. Las ventajas sobre los métodos previos en los cuales la oxidación se hace a un pH alcalino es que se necesita poco antiespumante caro para el control de espuma y se necesita menos base para mantener el pH . Mientras que la base es relativamente barata, puede ocupar un volumen sustancial del termentador, diluyendo el producto, requiriendo un recipiente termentador más grande a ser construido. Los problemas de viscosidad se han anticipado pero no se observaron durante la fermentación.

EJEMPLO 8 PREPARACIÓN DE UNA ALIMENTACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS PARCIALMENTE SAPONIFICADA Se ha encontrado que la producción de ácidos dicarboxílicos puede hacerse iniciar mucho más temprano en 1 fermentación si los ácidos grasos se neutralizan parcialmente primero en sus jabones de ácido graso. En general, el grado en el cual se neutraliza parcialmente una alimentación de ácidos grasos a la fermentación será 5% menos para causar la inducción rápida de la producción de ácido dicarboxílico y la acumulación rápida de ácido dicarboxílico. También, se ha observado, sin embargo, que una alimentación parcialmente saponificada también puede ser efectiva para alterar las propiedades reológicas del caldo de fermentación. Los reactivos de saponificación adecuados incluyen hidróxidos, carbonatos u óxidos metálicos. También pueden usarse cloruros, sulfatos o fosfatos metálicos con o sin un catalizador de saponificación. Estos se agregan al sustrato de fermentación de ácidos grasos para obtener la neutralización parcial. La reacción de saponificación está auxiliada por calentamiento y se integra convenientemente por un procedimiento de esterilización por calor si se desea. Una pequeña cantidad de agua también puede agregarse para auxiliar la esterilización y la reacción de saponificación. Alternativamente, los jabones de ácidos grasos pueden hacerse o comprarse en los cuales los ácidos grasos estén completamente neutralizados en un jabón metálico. Esto puede combinarse con un sustrato de fermentación deseado para obtener a composición de inducción deseada.

EJEMPLO 9 FERMENTACIÓN USANDO ACIDO OLEICO PARCIALMENTE SAPONIFICADO CON POTASIO Se proporcionó un cultivo en fase estacionaria de Candida tropicalis H5343 conforme el Ejemplo 7 excepto que se incluyó C.01 g/1 de sulfato ferroso en el medio de cultivo. La solución de co-sustrato de glucosa se suministró a 36 g/horas durante la oxidación de ácido graso y el cultivo se mantuvo a pH 5 usando NaOH 5N. Se preparó un sustrato E267 parcialmente saponificado al agregar 4.9 gramos de hidróxido de potasio y 20 gramos de agua a 500 gramos de E267. Esta mezcla se esterilizó en una autoclave de laboratorio durante 25 minutos para esterilizar la mezcla y completar la reacción de saporificación . Esta se agregó al cultivo de fase estacionaria para comenzar la oxidación. El pH se incrementó a 5.7, pero disminuyó de regreso a 5.0 conforme progresó la fermentación. La acumulación de ácido 9-octadecendioico se muestra en la Figura 1. 140 gramos adicionales de solución de hidróxidc de sodio 5N se consumió al mantener el pH 5 y 15 mi de antiespumante se consumió para el control de espuma. La adición de 166 gramos de E267 (no saponificado) durante la parte temprana de la fermentación no fue efectiva para controlar la espuma. El caldo de fermentación final de nuevo contuvo aproximadamente 20 g/kg de ácido 9-octadecendioico o aproximadamente 29 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales.

EJEMPLO 10 FERMENTACIÓN USANDO ACIDO OLEICO PARCIALMENTE SAPONIFICADO EN JABONES DE SODIO Un cultivo de fase estacionaria de Candida tropical i s H5343 se proporcionó conforme el Ejemplo 9, excepto que el medio de crecimiento contiene 70 g/1 de glucosa. La solución de co-sustrato de glucosa se suministró a 36 g/hora y el pH se mantuvo a pH 5 utilizando hidróxido de sodio 5N . Un sustrato E267 parcialmente saponificado se preparó al agregar 3.5 gramos de hidróxido de sodio y 30 gramos de agua a 500 gramos de E267. Esta mezcla se esterilizó en una autoclave de laboratorio durante 25 minutos para esterilizar la mezcla y completar la reacción de saponificación. La mezcla enfriada más 500 gramos adicionales de E267 (no saponificado) se agregó al cultivo de fase estacionaria para empezar la oxidación. El pH se incrementó a 6.0, pero disminuyó de regreso a 5 conforme progresó la fermentación. La acumulación de ácido 9-octadecendioico se muestra en la Figura 1. 100 gramos adicionales de solución de hidróxido de sodio 5N se consumieron para mantener el pH a 5, pero en contraste a la saponificación parcial de la alimentación a jabón de potasio, no se requirió antiespumante para control de espuma. El caldo de fermentación final contiene 40g/kg de ácido 9-octadecendioico o aproximadamente 57 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales. Este método tiene la ventaja de inducción y acumulación rápida de ácidos dicarboxílicos sin espuma y excelentes características reológicas de caldo.

EJEMPLO 11 FERMENTACIONES COMPARATIVAS USANDO ACIDO OLEICO PARCIALMENTE SAPONIFICADO CON SODIO Las fermentaciones adicionales usando un sustrato E267 parcialmente saponificado para jabones de sodio reveló un retraso del tiempo que ocurrió frecuentemente entre la adición de este sustrato y el surgimiento de la producción de ácido dicarboxílico. El retraso duró típicamente 6-10 horas y fue seguido después por la acumulación rápida de ácido dicarboxílico en el medio. La Figura 2 muestra un ejemplo representativo de este retraso en donde la fermentación finalmente produce 30 g/kg de ácido 9-octadecendioico .

EJEMPLO 12 FERMENTACIÓN USANDO ACIDO OLEICO PARCIALMENTE SAPONIFICADO EN JABONES DE CALCIO Un cultivo de fase estacionaria de Candida tropicalis H5343 se proporción como en el Ejemplo 3, excepto que el medio de cultivo contuvo 70 g/1 de glucosa y 0.2 g/1 de sulfato ferroso. La solución co-sustrato de glucosa se suministró a 37 g/horas y el cultivo se mantuvo a pH 5 a 5.5 usando Noah 5N . Se preparó un sustrato E267 parcialmente saponificado al agregar 3.26 g de hidróxido de calcio y 30 g de agua a 500 gramos de E267. Esta mezcla se esterilizó en una autoclave de laboratorio durante 25 minutos para completar la reacción de saponificación. Esta mezcla se agregó al cultivo de fase estacionaria para comenzar la oxidación. La adición de esta mezcla causó que el pH se incrementará a pH 5.7 pero el pH regresó a 5 conforme progresó la fermentación. Una segunda carga de E267 parcialmente saponificado con calcio, similar a la primera carga, se agregó a la fermentación después de que la primera carga se había oxidado a ácido 9-octadecendio?co a aproximadamente 65 horas del tiempo de fermentación. La velocidad de alimentación de la solución de glucosa también se redujo a 7 g/hora a las 110 horas. La acumulación de ácido 9-octadecendioico se muestra en la Figura 2. Se consumió una solución adicional de 190 gramos de hidróxido de sodio 5N para control de pH . No ocurrió espumado durante la oxidación y el caldo permaneció fluido. La fermentación produjo un máximo de 42 g/kg de ácido 9-octadecendioico o aproximadamente 60 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales. Este método tiene la ventaja de la inducción inmediata y rápida acumulación de ácido 9-octadecendio?co sin problemas de espuma o reológicos.

EJEMPLO 13 FERMENTACIÓN UTILIZANDO ACIDO OLEICO PARCIALMENTE SAPONIFICADO EN JABONES DE MAGNESIO Un cultivo en fase estacionaria de Candida tropicalis H5343 se preparó utilizando el método del Ejemplo 2. La solución de co-sustrato de glucosa se suministró a 36 g/hora durante la oxidación de ácidos grasos y el cultivo se mantuvo a ph 5 utilizando Noah 5N . Se preparó un sustrato E267 parcialmente saponificado al agregaron 2.56 gramos de hidróxido de magnesio y 30 g de agua a 500 gramos de E267. Esta mezcla se esterilizó en una autoclave de laboratorio para completar la reacción de saponificación. Esta se agregó al cultivo en fase estacionaria para comenzar la oxidación. El pH se incrementó a 5.7, pero disminuyó de regreso a 5.0 conforme progresó la fermentación. Una segunda carga de 500 gramos de alimentación saponificación similarmente se agregó a aproximadamente 40 horas de tiempo de fermentación. La acumulación del ácido 9-octadecendioico en el caldo de fermentación se muestra en la Figura 2. 100 gramos adicionales de solución de hidróxido de sodio 5N para mantener el pH 5 se consumió durante la oxidación. No ocurrió espumado y el caldo permaneció fluido. Esta fermentación produjo un máximo de 28 g/kg de ácido 9-octadecendioico o aproximadamente 40 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales.

EJEMPLO 14 PROCESO ALTERNATIVO PARA HACER ÁCIDOS DICARBOXILICOS Un cultivo en fase estacionaria de Candida tropical is H5343 se preparó usando el método del Ejemplo 8, excepto que se omitió el cloruro de sodio y se agregó 0.04 g/1 de sulfato ferroso. La solución co-sustrato de glucosa se suministró a 31 g/hora al cultivo en fase estacionaria y el ph se mantuvo a 5.0 usando hidróxido de potasio 5N . Un sustrato de E267 parcialmente saponificado se preparó al agregar 0.65 g de hidróxido de calcio y 12 g de agua a 200 g de E267. Esta mezcla se esterilizó durante 25 minutos en una autoclave de laboratorio para completar la reacción de saponificación. Esta se agregó al cultivo en fase estacionaria para comenzar la oxidación. Se observaron cambios de pH similares como en los ejemplos previos. Alícuotas adicionales (250 a 290 gramos cada una) de E267 (sin saponificar) se agregaron a la fermentación diariamente para dar una adición de E267 total final de 1800 gramos. El pH del caldo se incrementó entre 5.75 y 6.0 en el segundo día de la fermentación. Una solución adicional de 522 gramos de hidróxido de potasio 5N se consumió durante la fermentación. No se necesitó antiespumante. Esta fermentación produjo un máximo de 65 g/kg de ácido 9-octadecendioico o aproximadamente 93 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales durante 180 horas de tiempo de fermentación. El caldo de fermentación se volvió viscoso conforme progresó la fermentación haciendo difícil la agitación y transferencia de oxígeno .

EJEMPLO 15 CONTROL DE VISCOSIDAD USANDO SUSTRATOS DE ACIDO GRASO PRE- SAPONIFICADO Un cultivo en fase estacionaria de Candida tropicalis H5343 se preparó conforme el ejemplo 10. La solución de co-sustrato de glucosa se suministró a 40 g/hora, pero se redujo a 25 g/hora a 84 horas de tiempo de fermentación. El pH se mantuvo a pH 5 hasta las 36 horas del tiempo de fermentación cuando se incrementó a pH 5.7-5.9 utilizando solución de hidróxido de potasio 5N. Un sustrato E267 parcialmente saponificado se preparó al agregar 1.3 gramos de hidróxido de calcio y 12 gramos de agua a 200 g de E267. Esto se esterilizó para completar la reacción de saponificación después se agregó al cultivo en fase estacionaria para iniciar la producción de ácidos dicarboxílicos. Adiciones de sustrato subsecuentes, siendo cada una alícuotas de 250 g de E267, se saponificaron 5 parcialmente con 2.5 g de hidróxido de potasio o 1.6 g de hidróxido de calcio en 15 gramos en agua. Estos se agregaron diariamente a la fermentación para dar una adición de E267 total final a la fermentación de 1200 g. Se consumieron 526 g adicionales de solución de hidróxido de potasio para control 10 del pH . Usando este método de fermentación produjo un máximo de 59.1 g/kg de ácido 9-octadecendioico u 85 g/kg de ácidos dicarboxílicos totales durante un total de 150 horas de tiempo de fermentación. El caldo de fermentación no produjo espumación y fluido restante utilizando la combinación de 15 alimentaciones parcialmente saponificadas mientras producía una alta concentración de ácidos dicarboxílicos.

EJEMPLO 16 MÉTODO PARA CONVERTIR ACIDO PELARGONICO EN ACIDO AZELAICO 20 Se preparó un cultivo usando el método del Ejemplo 11, excepto a las 134 horas de tiempo de fermentación, se agregó una alícuota de 25 g de ácido pelargónico diluido con 225 g de solvente E267 a la fermentación sin saponificación parcial. El análisis por GLC del caldo mostró que casi todo 25 el ácido pelargónico se oxidó en ácido azelaico. Apareció poca acumulación de adición de ácido 9-octadecendioico durante el tiempo en que estaba siendo oxidado el ácido azelaico .

EJEMPLO 17 FENÓMENO DE SEPARACIÓN DE FASES Una muestra de fermentación generada esencialmente usando el método del Ejemplo 11, y conteniendo 0.9 g/kg de ácido oleico sin reaccionar y 37.4 g/kg de ácido 9-octadecendioico se observó separar espontáneamente ba o la gravedad, en dos fases líquidas y una fase sólida densa comprendida de las células de levadura a pH 6.0 y 70°C. El análisis de la fase líquida ligera clara mostró contener solamente 0.2 g/kg de ácido oleico y 0.3 g/kg de ácido 9-octadecendioico. La fase líquida oleosa inferior contuvo 0.9 g/kg de ácido oleico y 92.1 g/kg de ácido 9-octadecendioico .

EJEMPLO 18 UTILIZACIÓN DEL FENÓMENO DE SEPARACIÓN DE FASES Una muestra de fermentación generada utilizando el método del Ejemplo 11 se ajustó a pH 6.15 utilizando solución de hidróxido de potasio 5N y recolectando en un cilindro graduado de 100 mi. La muestra completa contenía 0.8 g/kg de ácido oleico sin reaccionar y 58.1 g/kg de ácido 9-octadecendioico. El cilindro se colocó en una estufa a 70°C ...Aa-AL-, .. , ~ 3i.Í*2Stl durante varias horas para observar la separación de fase subsecuente. Finalmente, la muestra produjo 30 mi de la fase líquida ligera de color ámbar, 22 mi de una fase oleosa ámbar, y 50 mi de la misma fase oleosa pero ocluida con 5 células. Para determinar el efecto de la centrifugación sobre la separación de fases, la misma muestra (40 mi) se colocó en un tubo cié centrífuga cónico a pH 6.15, se calentó a 70°C, después se procesó durante un minuto en una centrífuga clínica. La muestra produjo 20 mi de la fase líquida ligera, 10 15 mi de la fase líquida oleosa, y aproximadamente 5 mi de pella celular. El método de este Ejemplo da una separación primaria inmediata de producto de la masa celular. La fase líquida ligera, la cual es baja en sustrato sin reaccionar y producto de ácido dicarboxílico, puede reciclarse en 15 fermentaciones subsecuentes para reusar componentes valiosos en esta fase. La fase líquida densa oleosa está ahora enriquecida en ácidos dicarboxílicos y es adecuada para etapas adicionales de recuperación corriente abajo. Las células se remueven fácilmente y opcionalmente pueden lavarse 20 para recuperar cualquier fase oleosa densa residual ocluida en los esoacios intersticiales entre las células.

DEPOSITO DE MICROORGANISMOS Se han depositado cultivos vivos de C. tropicalis 25 R40 designados ATCC 20987 y cepa C. tropicalis 5343 (ATCC ="*-*"to¿g ' Í * - * -* ** * .. . -a^a. , a. a-,,»ata a..aStaA-l , .„ -a , >..&»-. «a. M. a . „..*--... .».*» 20962) en American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 bajo el Tratado de Budapest sobre Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos de procedimiento de patente.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1. Un proceso para hacer un ácido policarboxílico alifático que comprende las etapas de: (i) fermentar unas 5 células de C_^ tropicalis con beta-oxidación bloqueada en donde ambas copias del gen P0X5 cromosómico y los genes P0X4A y P0X4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo que comprende una fuente nitrogenada, un sustrato orgánico y un co-sustrato en donde el sustrato es un compuesto alifático no 10 saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable a un grupo carboxilo por biooxidación; (ii) hacer reaccionar el producto de la etapa (i) con un agente de 15 oxidación para producir uno o más ácidos policarboxílicos. 2. El proceso de la reivindicación 1, en donde la célula de C. trop.icalis es H5343. 3. El proceso de la reivindicación 1, en donde uno o más genes P450ALK, genes P450RED o una combinación de los 20 mismos, se amplifica en la célula C^ tropicalis . 4. El proceso de la reivindicación 2, en donde uno o más genes P450RED se amplifican en la célula C^ tropicalis . 5. El proceso de la reivindicación 4, en donde la célula de C^ tropicalis son la cepa AR40 o R24. 25 6. El proceso de la reivindicación 1, en donde el ^^^ '"*" * -' •»"*"» <-agente de oxidación se selecciona del grupo que consiste de ozono; ácido túngstico-peróxido ácido; ácido crómico; óxido de rutenio-hipoclorito; permanganato; ácido peroxifórmico; bromuro de cobalto-peróxido ácido. 7. El proceso de la reivindicación 6, en donde el agente oxidante es ozono. 8. El proceso de la reivindicación 1, en donde el sustrato orgánico es ácido oleico. 9. El proceso de la reivindicación 1, en donde el sustrato se deriva de un triglicérido que tiene un alto contenido de ácido oleico. 10. El proceso de la reivindicación 9, en donde el medio de cultivo comprende adicionalmente de una lipasa capaz de hidrolizar efectivamente el triglicérido en ácidos grasos y glicerina. 11. El proceso de la reivindicación 10, en donde la lipasa es una lipasa oleo-específica . 12. El proceso de la reivindicación 11, en donde la lipasa oleo-específica se selecciona del grupo que consiste de la lipasa de Pseudomonas sp, Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum, Pseudomonas (Burkholderia) y UNLipase a partir de Geotrichum candidum ATCC No. 74170. 13. El proceso de la reivindicación 12, en donde la lipasa es UNLipase de Geotrichum candidum ATCC No. 74170. 14. Un proceso para hacer ácido azelaico que comprende las etapas de: (i) fermentar una célula de C . tropicalis con beta-oxidación bloqueada en donde ambas copias del gen P0X5 cromosómico y los genes P0X4A y P0X4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo comprendido en una fuente de nitrógeno, ácido oleico y un co-sustrato para producir ácido 9-octadecendioico; (ii) hacer reaccionar ácido 9-octadecendioico con un agente oxidante para producir ácido azelaico . 15. El proceso de la reivindicación 14, en donde la célula C^ tropicalis es H5343. 16. El proceso de la reivindicación 14, en donde uno o más genes P450ALK, genes P450RED, o una combinaciones de los mismos se amplifica en las células de C^ tropicalis . 17. El proceso de la reivindicación 15, en donde uno o más genes P450RED se amplifican en la célula C . tropicalis . 18. El proceso de la reivindicación 17, en donde la célula de C_^ tropicalis es la cepa AR40 o R24. 19. El proceso de la reivindicación 14, en donde el agente de oxidación se selecciona del grupo que consiste ozono; ácido túngstico-peróxido ácido; ácido crómico; hipoclorito-óxido de rutenio; permanganato; ácido peroxifórmico; bromuro de cobalto-peróxido ácido. 20. El proceso de la reivindicación 19, en donde el agente de oxidación es ozono. 21. El proceso de la reivindicación 14, en donde el ácido oleico se deriva de un triglicérido que tiene un alto contenido de ácido oleico. 22. Un proceso para hacer un ácido dicarboxílico saturado que comprende las etapas de: (i) fermentar una célula de C_^ tropicalis con beta-oxidación bloqueada donde ambas copias del gen POX5 cromosómico y los genes P0X4A y POX4B cromosómicos se separan en un medio de cultivo comprendido de una fuente de nitrógeno, un sustrato orgánico y un co-sustrato en donde el sustrato es un compuesto alifático no saturado que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono interno y al menos un grupo metilo terminal, un grupo carboxilo terminal y/o un grupo funcional terminal el cual es oxidable en un grupo carboxilo por biooxidación para formar un ácido dicarboxílico no saturado que tiene uno o más dobles enlaces carbono-carbono en una cadena de carbono terminada en al menos uno de los grupos carboxilo del ácido dicarboxílico no saturado; (ii) hacer reaccionar el ácido dicarboxílico no saturado con un agente de oxidación para producir uno o más ácidos dicarboxílicos saturados. 23. El proceso de la reivindicación 22, en donde el compuesto alifático no saturado es ácido oleico. 24. El proceso de la reivindicación 22 en donde la célula de C_^ tropicalis es H5343. 25. El proceso de la reivindicación 22, en donde uno o más genes P450ALK, genes P450RED, o una combinación de los mismos se amplifican en las células de C. tropicalis . 26. El proceso de la reivindicación 24, en donde uno o más genes P450RED se amplifican en la célula de C^ tropicalis . 27. El proceso de la reivindicación 28, en donde la célula de C^ tropicalis es la cepa Ar40 o R24. 28. El proceso de la reivindicación 22, en donde el agente de oxidación se selecciona del grupo que consiste de ozono; ácido túngstico-peróxido ácido; ácido crómico; óxido de rutenio-hipoclorito; permanganato; ácido peroxifórmico; bromuro de cobalto-peróxido ácido. 29. El proceso de la reivindicación 28, en donde el agente oxidante es ozono. 30. El proceso de la reivindicación 23, en donde el ácido oleico se deriva de un triglicérido que tiene un contenido elevado de ácido oleico. 31. El proceso de la reivindicación 30, en donde el sustrato es un triglicérido que tiene un alto contenido de ácido oleico. 32. El proceso de la reivindicación 22, en donde el medio de cultivo está comprendido adicionalmente de una lipasa capaz de hidrolizar efectivamente un triglicérido que tiene un alto contenido de ácido oleico en ácidos grasos y glicerina. 33. El proceso de la reivindicación 32, en donde la lipasa es una lipasa oleo-específica . 34. El proceso de la reivindicación 33, en donde la lipasa oleo-específica se selecciona del grupo que consiste de la lipasa de Pseudomonas sp, Humicola lanuginosa, Candida rugosa, Geotrichum candidum, Pseudomonas (Burkholderia) y UNLipase a partir de Geotrichum candidum ATCC No. 74170. 35. El proceso de la reivindicación 34, en donde la lipasa es UNLipase de Geotrichum candidum ATCC No. 74170. 36. Un proceso para hacer ácido azelaico que comprende las etapas de: (i) fermentar C^ tropicalis H5343 en un medio de cultivo comprendido de una fuente de nitrógeno, ácido oleico y un co-sustrato para producir ácido 9-octadecendioico; (ii) hacer reaccionar ácido 9-octadecendioico con un agente de oxidación para producir ácido azelaico. 37. El proceso de la reivindicación 36, en donde uno o más genes de P450ALK, genes P450RED o una combinación de los mismos se amplifica. 38. El proceso de la reivindicación 36, en donde uno o más genes P450RED se amplifican. 39. El proceso de la reivindicación 37, en donde la célula de C^ tropicalis es la cepa AR40 o R24. 40. El proceso de la reivindicación 39, en donde la cepa es AR40. 41. El proceso de la reivindicación 36, en donde el agente oxidante es ozono. )