CN101984053B

CN101984053B - 一种发酵生产脂肪酶的方法

Info

Publication number: CN101984053B
Application number: CN2010105810331A
Authority: CN
Inventors: 徐岩; 喻晓蔚; 谢甲有
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: JIANGSU YIMING BIOLOGICAL Co.,Ltd.
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2010-12-09
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-12-09
Also published as: CN101984053A

Abstract

本发明公开了一种发酵生产脂肪酶的方法，属于发酵工程领域。本发明以含有华根霉（Rhizopuschinensis）CCTCCNo.M201021脂肪酶基因的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL为生产菌株，通过甲醇诱导的分阶段控制，显著提高了脂肪酶的产量。该方法简单易行，适合产业化生产。

Description

一种发酵生产脂肪酶的方法

技术领域

一种发酵生产脂肪酶的方法，尤其是一种控制诱导工艺发酵生产脂肪酶的方法，属于发酵工程领域。

背景技术

脂肪酶(Lipase E.C.3.1.1.3)全称Triacylglycerol acylhydrolase，能够水解三酰甘油酯为脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯，特点是在油水界面起催化作用。因此，脂肪酶可以说是专门在异相系统或者非水介质中油(或酯)与水的界面上催化的酶。通过控制反应体系中水的含量，改变反应条件可以使水解反应向合成方向进行，这些反应通常具有高度的区域或立体选择性。自然界中的脂肪酶广泛地存在于各种生物体中，包括人类和植物。人体和其它动物体中，脂肪酶主要功能是对油脂进行消化、吸收和修饰。在植物中，脂肪酶在茉莉酸防疫体系和病原体诱导的水杨酸生成过程中起重要作用。在微生物中，脂肪酶则是用于对油脂的水解而生成脂肪酸，脂肪酸再进入β-氧化途径提供能量，并且在微生物油脂的储存中也起到一定的作用。

微生物脂肪酶种类多，具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度，并适合于工业化大生产，所以微生物是脂肪酶的一个重要来源，其中根霉属(Rhizopussp.)微生物是脂肪酶的重要生产菌（Jaeger K E and Eggert T. Curr Opin Biotech, 2002, 13: 390-397）。在过去的十多年里，从根霉菌中分离到超过30种脂肪酶，多种根霉脂肪酶已被制成商品化酶制剂。各种各样的微生物，包括细菌、酵母和霉菌都能用于脂肪酶的生产，并且这些脂肪酶都广泛用于清洁剂、食品、香料、手性医药中间体、生物材料和一些化学品的生产中（Hasan F, et al. Enzyme and Microbial Technol, 2006, 39:235-251）。

然而在脂肪酶生物催化的工业生产过程中，催化剂脂肪酶是一个很大的限制因素，自然条件下，菌株产脂肪酶量较低，利用常规育种方法难以满足工业化生产的需要。因此研究人员把注意力集中到克隆和表达脂肪酶基因上，通过基因表达调控来提高脂肪酶的活力。

甲醇营养型毕赤酵母（Pichia pastoris）作为能够实现外源蛋白高效表达的优秀宿主菌，在学术和工业技术上的应用越来越广泛。它具有许多真核表达系统所特有的特点，如蛋白酶加工，折叠，二硫键形成和糖基化作用等（Cereghino J L，Cregg J M.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24:45–66.）。在以AOX酶启动子控制的基因工程菌表达外源蛋白培养过程中，甲醇补料策略是一个非常重要的影响因素。为了避免甲醇积累对细胞的毒害作用和对细胞生长的不利影响获得目蛋白的高效表达，不同甲醇补料策略得到应用。Stephan（Stephan Hellwig，Frank Emde，Nicole P G.Analysis of Single-Chain Antibody Production in Pichia pastoris Using On-Line Methanol Control in Fed-Batch and Mixed-Feed Fermentations[J].Biotechnology and Bioengineering.2001，74:344-352.）等在已建立的毕氏酵母发酵过程结构模型基础上，进行了甲醇流加阶段恒定比生长速率。研究发现在比生长速率均值相等的情况下，恒定比生长速率进料策略较之恒速进料策略蛋白产量高25%。Cunha（Cunha A E，Clemente J J，Gomes R，et al. Methanol Induction Optimization for scFv Antibody Fragment Production inPichia pastoris[J]. J Ferm Bioeng.2003，82: 82-87.）等通过对恒定补料速率和变速补料比较发现恒速补料策略（1.0）更适合外源蛋白表达。Yu（Xiao-Wei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu.Rhizopus chinensis lipase: gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57:304-311）等通过甲醇电极恒定控制甲醇浓度来表达华根霉脂肪酶，但未能采取其他甲醇流加策略进行研究比较。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种发酵生产脂肪酶的方法。

本发明以含有华根霉（Rhizopus chinensis） CCTCC No.M201021脂肪酶基因的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL为生产菌株，通过甲醇浓度的分阶段控制，以提高脂肪酶的产量。

甲醇浓度的控制方法：在初始的0-5h内控制培养液中甲醇浓度为质量百分数3-12%，然后控制体系中甲醇浓度在质量百分数0.05%-3%，继续培养2-5天，温度控制在20-28℃。

生产菌株GS115/pPIC9K-proRCL已在Xiao-Wei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu. Rhizopus chinensis lipase: gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57:304-311中公开。

发酵生产脂肪酶的具体步骤为：

1)重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL种子培养，然后按5%-10%接种量接种于含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM₁溶液的基础盐培养基BSM中；

2)通气搅拌培养，在整个培养过程中氧饱和度控制在20%-60%；

3)菌种经过一段适应期后进入指数生长期，自动流加质量浓度25%的工业氨水控制pH 5-7，当发酵培养基中的底物甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加含12mL/L的PTM₁的500g/L的甘油补料生长培养液；温度控制在28℃；

4)当细胞光密度OD₆₀₀达到60-120后，停止补加甘油，维持饥饿状态约30min，彻底耗尽甘油，然后补入甲醇诱导培养液，在初始的0-5h内控制培养液中甲醇浓度为3-12%（质量百分比），然后控制体系中甲醇浓度在0.05%-3%(质量百分比)，继续培养2-5天，温度控制在20-28℃。

涉及的培养基为：

(1) 种子培养基

BMGY培养基：蛋白胨 20g/L，酵母提取物 10g/L，YNB 13.4g/L，甘油 20 g/L，500×生物素2mL/L, pH 6.0磷酸缓冲液100mL/L；用500 mL的三角瓶培养，装液量10%；

(2) 发酵培养基

基础盐培养基BSM：85% H₃PO₄26.7mL/L，CaSO₄0.93g /L，K₂SO₄18.2g /L，MgSO₄·7H₂0 14.9g/L，KOH 4.13 g/L；用BSM基础盐配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM₁溶液；

(3) PTM₁

PTM₁：CuS0₄·5H₂0 6g/L, KI 0.08g/L, MnSO₄·H₂O 3g/L, Na₂MoO₄·2H₂0 0.2g/L, H₃BO₃0.02g/L, ZnSO₄·7H₂O 20g/L, FeSO₄·7H₂0 65g/L, CoC1₂·6H₂0 0.5g/L, 生物素 0.2 g/L, H₂SO₄5 mL/L；

(4) 补料生长培养液

含12mL/L的PTM₁的500g/L甘油补料液；

(5) 诱导培养液

100%甲醇中加入含12mL/L的PTM₁

脂肪酶测定方法为：橄榄油滴定法（国家标准GBT 23535-2009 脂肪酶制剂）

本发明提供了一种发酵生产脂肪酶的方法，采用甲醇诱导浓度的分阶段控制方案，先使用较高甲醇浓度，后降低甲醇浓度的方法，显著提高了脂肪酶的产量。

具体实施方式

实施例 1

生产菌株GS115/pPIC9K-proRCL，已在Xiao-Wei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu. Rhizopus chinensis lipase: gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009) Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 57:304-311中公开。

培养方法：

配制2.5L发酵培养基置于7L罐内，插入pH电极与DO电极(己标定)，接好空气过滤器，包扎好后在蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。消好后接上循环水冷却到28℃，并通入空气，闭环控制，用25%的氨水调节pH。培养过程中通过调节通气量或混合通纯氧与转速来维持菌体生长所需的（溶氧）DO>20%。火焰接种，接种量为10%，并加入4mL/L己过滤除菌的PTM₁溶液，调节转速、温度、空气流量、罐压等进行分批发酵。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加25%的工业氨水将pH控制在5。当底物甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加500g/L甘油(含12mL/L的PTM₁)，调节流加速率控制DO维持在20%-60%。当细胞光密度达到90(OD₆₀₀=90)左右后,停止补甘油，维持饥饿状态约30min，让甘油彻底耗尽，然后补入甲醇。甲醇诱导相温度控制为28℃，流加诱导培养液，在初始1h内控制甲醇浓度在5%，然后控制甲醇浓度在0.5%。甲醇电极(华东理工大学研制)在线显示和控制甲醇浓度。

通过此发酵工艺，75 h发酵上清中脂肪酶酶活达到15000 U/mL，相比甲醇诱导相恒定控制甲醇浓度为0.5%的工艺（其他控制条件相同）提高了5000 U/mL。

种子培养基为：

蛋白胨 20g/L，酵母提取物 10g/L，YNB 13.4g/L，甘油 20 g/L，500×生物素2mL/L, pH 6.0磷酸缓冲液100mL/L；用500 mL的三角瓶培养，装液量10%。

发酵培养基为：

85%H₃PO₄26.7mL/L，CaSO₄0.93g /L，K₂SO₄18.2g /L，MgSO₄·7H₂0 14.9g/L，KOH 4.13 g/L；用BSM基础盐配制成含40g/L甘油和4mL/L微量元素PTM₁的溶液。

PTM₁培养基为：

CuS0₄·5H₂0 6g/L, KI 0.08g/L, MnSO₄·H₂O 3g/L, Na₂MoO₄·2H₂0 0.2g/L, H₃BO₃0.02g/L, ZnSO₄·7H₂O 20g/L, FeSO₄·7H₂0 65g/L, CoC1₂·6H₂0 0.5g/L, 生物素 0.2 g/L, H₂SO₄5 mL/L。

诱导培养液为：

100%甲醇(含12mL/L的PTM₁)诱导液。

实施例 2

培养基同实施例1

培养方法

配制2.5L发酵培养基置于7L罐内，插入pH电极与DO电极(己标定)，接好空气过滤器，包扎好后在蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。消好后接上循环水冷却到28℃，并通入空气，闭环控制，用25%的氨水调节pH。培养过程中通过调节通气量或混合通纯氧与转速来维持菌体生长所需的DO>20%。火焰接种，接种量为10%，并加入4mL/L己过滤除菌的PTM₁溶液，调节转速、温度、空气流量、罐压等进行分批发酵。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加25%的工业氨水将pH控制在6.0。当甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加500g/L的甘油(含12mL/L的PTM₁)，调节流加速率控制DO维持在20%-60%。当细胞光密度达到60(OD₆₀₀=60)左右后,停止补甘油，维持饥饿状态约30min，让甘油彻底耗尽，然后补入甲醇。甲醇诱导相温度控制为25℃，流加诱导培养液，在初始2 h内控制甲醇浓度在8%，然后控制甲醇浓度在0.3%。甲醇电极(华东理工大学研制)在线显示和控制甲醇浓度。

通过此发酵工艺，80 h发酵上清中脂肪酶酶活达到8500 U/mL，相比甲醇诱导相恒定控制甲醇浓度为0.3%的工艺（其他控制条件相同）提高了2000 U/mL。

实施例 3

培养基同实施例1

培养方法

配制2.5L发酵培养基置于7L罐内，插入pH电极与DO电极(己标定)，接好空气过滤器，包扎好后在蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。消好后接上循环水冷却到28℃，并通入空气，闭环控制，用25%的氨水调节pH。培养过程中通过调节通气量或混合通纯氧与转速来维持菌体生长所需的DO>20%。火焰接种，接种量为10%，并加入4mL/L己过滤除菌的PTM₁溶液，调节转速、温度、空气流量、罐压等进行分批发酵。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加25%的工业氨水将pH控制在5.5。当甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加500g/L的甘油(含12mL/L的PTM₁)，调节流加速率控制DO维持在20%-60%。当细胞光密度达到120(OD₆₀₀=120)左右后,停止补甘油，维持饥饿状态约30min，让甘油彻底耗尽，然后补入甲醇。甲醇诱导相温度控制为28℃，流加诱导培养液，在初始3h内，控制甲醇浓度在10%，然后控制甲醇浓度在2 %。甲醇电极(华东理工大学研制)在线显示和控制甲醇浓度。

通过此发酵工艺，85 h发酵上清中脂肪酶酶活达到11000 U/mL，相比甲醇诱导相恒定控制甲醇浓度为2 %的工艺（其他控制条件相同）提高了3000 U/mL。

实施例 4

培养基同实施例1

培养方法

配制2.5L发酵培养基置于7L罐内，插入pH电极与DO电极(己标定)，接好空气过滤器，包扎好后在蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。消好后接上循环水冷却到28℃，并通入空气，闭环控制，用25%的氨水调节pH。培养过程中通过调节通气量或混合通纯氧与转速来维持菌体生长所需的DO>20%。火焰接种，接种量为10%，并加入4mL/L己过滤除菌的PTM₁溶液，调节转速、温度、空气流量、罐压等进行分批发酵。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加25%的工业氨水将pH控制在7。当甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加500g/L的甘油(含12mL/L的PTM₁)，调节流加速率控制DO维持在20%-60%。当细胞光密度达到120(OD₆₀₀=120)左右后,停止补甘油，维持饥饿状态约30min，让甘油彻底耗尽，然后补入甲醇。甲醇诱导相温度控制为28℃，流加诱导培养液，在初始1h内，控制甲醇浓度在12%，然后控制甲醇浓度在3 %。甲醇电极(华东理工大学研制)在线显示和控制甲醇浓度。

通过此发酵工艺，80 h发酵上清中脂肪酶酶活达到13000 U/mL，相比甲醇诱导相恒定控制甲醇浓度为3 %的工艺（其他控制条件相同）提高了2500 U/mL。

实施例 5

培养基同实施例1

培养方法

配制2.5L发酵培养基置于7L罐内，插入pH电极与DO电极(己标定)，接好空气过滤器，包扎好后在蒸汽灭菌锅内121℃灭菌20min。消好后接上循环水冷却到28℃，并通入空气，闭环控制，用25%的氨水调节pH。培养过程中通过调节通气量或混合通纯氧与转速来维持菌体生长所需的DO>20%。火焰接种，接种量为10%，并加入4mL/L己过滤除菌的PTM₁溶液，调节转速、温度、空气流量、罐压等进行分批发酵。菌种经过一段适应期后进入指数生长期，此时pH受到闭环控制，自动流加25%的工业氨水将pH控制在5。当甘油耗尽后，此时DO陡然上升，开始流加500g/L的甘油(含12mL/L的PTM₁)，调节流加速率控制DO维持在20%-60%。当细胞光密度达到120(OD₆₀₀=120)左右后,停止补甘油，维持饥饿状态约30min，让甘油彻底耗尽，然后补入甲醇。甲醇诱导相温度控制为28℃，流加诱导培养液，在初始5h内，控制甲醇浓度在3%，然后控制甲醇浓度在0.05 %。甲醇电极(华东理工大学研制)在线显示和控制甲醇浓度。

通过此发酵工艺，85 h发酵上清中脂肪酶酶活达到5000 U/mL，相比甲醇诱导相恒定控制甲醇浓度为0.05 %的工艺（其他控制条件相同）提高了3000 U/mL。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种发酵生产脂肪酶的方法，其特征在于以含有华根霉(Rhizopuschinensis)CCTCC No.M201021脂肪酶基因的重组酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL为生产菌株，通过甲醇诱导的二阶段控制，其中第一阶段甲醇浓度为质量百分数5％-12％，诱导时间为1-5小时，第二阶段甲醇浓度为质量百分数0.05％-3％。

2.权利要求1所述的的方法，其特征在于所述第一阶段诱导时间为1h。

3.权利要求1-2任一所述的的方法，其特征在于所述第一阶段甲醇浓度为10％。

4.权利要求1-2任一所述的的方法，其特征在于所述第二阶段甲醇浓度为0.5％。