CN103184145B - 一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用 - Google Patents
一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用。本发明提供的装置包括光合生物反应器（1）、浓缩瓶（2）、除氮器（3）和发酵罐（4）；光合生物反应器设有进气口、出气口和出液口；浓缩瓶设有进液口、出液口和可以开关的进样口；除氮器装有除氮材料，设有进液口和出液口；发酵罐设有进样口、出样口、进气口、补料口和出气口；光合生物反应器的出液口与浓缩瓶的进液口连通；浓缩瓶的出液口与除氮器的进液口连通；除氮器的出液口与发酵罐的进样口连通，发酵罐的出气口与光合生物反应器的进气口连通。本发明提供的装置以及应用该装置培养微藻的方法能够提高微藻的油脂产量，降低藻油生产成本，生产更为环保的生物燃料。
Description
技术领域
本发明涉及一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用。
背景技术
微藻具有生长速度快，光合效率高的特点，且可以用生物反应器自动化培养。微藻细胞内合成的油脂被认为是理想的制备生物燃料的油脂原料。通常，生长速率快的藻类细胞油脂含量低，而油脂含量高的藻类生长速率非常缓慢，这大大影响了藻类油脂的生产效率，很难以满足生物燃料生产的需求。
专利CN200810100871.5（发明人吴庆余等）的内容显示，小球藻Chlorellaprotothecoides0710不仅能够像大多数藻类一样在富氮环境中进行光合自养生长，还能够在限氮的环境中利用有机碳进行高密度异养生长并积累大量油脂，其油产量比光合自养培养时高出50倍以上。
发明内容
本发明的目的是提供一种光合-发酵混合培养装置及其在培养含油微藻中的应用。
本发明提供的光合-发酵混合培养装置的结构示意图见图1，包括光合生物反应器1、浓缩瓶2、除氮器3和发酵罐4；
所述光合生物反应器为透明密闭的容器，设有进气口、出气口和出液口；
所述浓缩瓶为密闭容器，设有进液口、出液口和可以开关的进样口；
所述除氮器为装有除氮材料的密闭容器，设有进液口和出液口；
所述发酵罐设有进样口、出样口、进气口、补料口和出气口；
所述光合生物反应器的出液口与所述浓缩瓶的进液口通过管道Ⅰ连通，所述管道Ⅰ上设有三通阀门；所述浓缩瓶的出液口与所述除氮器的进液口通过管道Ⅱ连通；所述除氮器的出液口与所述发酵罐的进样口通过管道Ⅲ连通，所述发酵罐的出气口与所述光合生物反应器的进气口通过管道Ⅳ连通。
所述除氮材料为可以通过离子交换去除硝态氮、亚硝态氮或氨态氮的物质，具体为可以通过离子交换去除以NH4 +离子形式存在的氮的物质。所述除氮器的功能为使得液相体系通过所述除氮器后的含氮量为40mg/L以下。所述含氮量具体可为以NH4 +离子形式存在的氮的含量。所述除氮材料可为阳离子交换树脂，具体可为大孔强酸性阳离子交换树脂。
所述管道Ⅰ、所述管道Ⅱ、所述管道Ⅲ和所述管道Ⅳ上均可设有泵。
所述光合生物反应器的出气口可通过管道与大气连通。所述发酵罐的进气口可通过管道与供气装置连通。所述发酵罐的补料口可通过管道与补料装置连通。
以上任一所述光合-发酵混合培养装置可用于培养微藻。
以上任一所述光合-发酵混合培养装置可用于生产油脂。
以上任一所述光合-发酵混合培养装置可用于生产生物柴油。
本发明还保护应用所述光合-发酵混合培养装置培养微藻的方法，包括至少两个循环；每个循环依次包括如下步骤：
（1）在所述光合生物反应器中，用富氮光合培养基培养微藻至最大细胞密度；所述培养过程中，来自发酵罐的气体通过所述管道Ⅳ进入所述光合生物反应器以促使培养体系搅动；所述富氮光合培养基为含有3-10g/L氮源的培养基；
（2）将培养体系浓缩后使其通过所述管道Ⅰ进入所述浓缩瓶；
（3）使所述浓缩瓶中的液体通过所述管道Ⅱ进入所述除氮器；
（4）使所述除氮器中的液体通过所述管道Ⅲ进入所述发酵罐，在限氮发酵培养基中进行发酵，发酵产生的气体通过所述管道Ⅳ进入所述光合生物反应器；所述限氮发酵培养基为氮源浓度为3g/L以下、有机碳浓度为10-50g/L的培养基。
所述富氮光合培养基可由氮源和基础培养基组成，氮源的浓度为3-10g/L。所述氮源可为有机氮源和/或无机氮源。所述有机氮源可为氨基酸、尿素、玉米浆、酵母提取物、酵母浸膏、酵母浸粉等中的一种或几种的组合。所述无机氮源可为硝基氮、氨氮、铵等中的一种或几种的组合。所述氨氮具体可为氯化铵。所述富氮光合培养基具体可由氯化铵和基础培养基组成，氯化铵的浓度为8g/L。
所述限氮发酵培养基可由氮源、有机碳和基础培养基组成，氮源的浓度为3g/L以下，有机碳的浓度为10-50g/L。所述氮源可为有机氮源和/或无机氮源。所述有机氮源可为氨基酸、尿素、玉米浆、酵母提取物、酵母浸膏、酵母浸粉等中的一种或几种的组合。所述无机氮源可为硝基氮、氨氮、铵等中的一种或几种的组合。所述有机碳可为多种碳水化合物，可为单糖也可为多糖的水解液。所述有机碳具体可为葡萄糖、果糖、乙酸纳、乙酸钾、淀粉水解液、甘蔗汁水解液、甜高粱汁水解液、糖蜜水解液、纤维素水解液等。所述限氮发酵培养基具体可由酵母提取物、葡萄糖和基础培养基组成，酵母提取物的浓度为2g/L以下，葡萄糖的浓度为10-35g/L。
基础培养基的制备方法：将0.7g KH2PO4、0.3g K2HPO4、0.3g MgSO4·7H2O、3mgFeSO4·7H2O、0.01mg维生素B1、2.86mg H3BO3、0.222mg ZnSO4·7H2O、1.81mg MnCl2·4H2O、0.074mg CuSO4·5H2O和0.039mg Na2MoO4·2H2O用水定容至1L。
所述步骤（1）中的培养时间具体可为6-8天。
所述步骤（2）中，所述“将培养体系浓缩”的方法如下：使所述光合生物反应器中的培养体系静置（具体可静置1天），然后通过所述三通阀门抽取并弃除光合生物反应器中的培养上清。所述浓缩之前和之后的体积比可为（66-132）:1。
所述步骤（3）中，所述浓缩瓶中的液体通过所述管道Ⅱ进入所述除氮器的流速具体可为3ml/分钟。
所述步骤（4）中的发酵时间具体可为6-8天。所述发酵的具体方法如下：发酵温度为28±0.5℃，pH值为6.2±0.1，空气流速为2L/min，搅拌速度为200rpm，溶氧量为20-50%；发酵过程中，即时监测发酵体系中的还原糖浓度，当还原糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖并使还原糖浓度达到30±5g/L，每累计加入12g葡萄糖时加入0.4-0.8g酵母提取物。
以上任一所述微藻具体可为小球藻，更具体可为Chlorella protothecoides0710。
异养培养会消耗大量的有机碳，并释放二氧化碳。为克服这些缺点，进一步降低微藻油脂的生产成本，发明人建立了先光合后发酵两步法培养小球藻的方法，让小球藻先利用光能和二氧化碳生长，通过离心浓缩提高细胞密度并更换培养基，降低培养基中的氮浓度，再进行异养发酵进一步提高细胞密度和油脂含量。此方法比单纯的自养培养和异养发酵更为高效、经济和环保。但该方法是在两套装置系统中分别进行操作，两步操作中间还需要通过离心或过滤步骤来更换培养基，才能到将光合自养藻转化为下阶段的异养发酵。
本发明对用于光合培养的装置和用于异养发酵的装置进行了一体化设计，可以有效避免浓缩自养细胞和降低氮浓度过程中细菌污染的问题，同时使该方法具备进一步放大应用的可行性。本发明中将光合生物反应器、浓缩瓶、除氮器和发酵罐按顺序连接成一个密闭的系统。先在光合生物反应器中利用光能、二氧化碳和富氮光合培养基生产尽可能多的微藻细胞，然后通过去除上清进一步提高细胞的密度，通过除氮器除去富氮光合培养基中的残留氮，再在发酵罐中进行异养转化培养，供给细胞有机碳以提高细胞密度和油脂含量，同时将发酵尾气再次通入之前的光合生物反应器，同步进行新一轮的光合培养。
本发明的创新之处：（1）一体化的装置结合了微藻光合作用效率高，能够利用发酵放出二氧化碳、富氮水源和有机碳的优点，简化了微藻细胞先光合自养、接着更换培养基，再进行异养发酵的繁琐过程，使藻细胞的油脂的产量大大高于纯光合和纯发酵培养；（2）除氮器的使用避免了利用离心或过滤技术工艺进行培养基更换时产生细菌的污染问题，同时发酵尾气的回收再利用供给光合反应器中微藻自养生长所需的氧气、二氧化碳和搅拌动力，大大降低了生产过程中的气泵能耗和二氧化碳排放；（3）大体积的光合生物反应器与细胞浓缩收集后直接通过除氮器流入小体积的发酵罐，增加了光合作用和二氧化碳对最终油脂合成的贡献率，此混合培养系统能够不断循环使用，连续输出大量含油微藻，这种高度整合的混合培养方法不仅能有效降低藻类生物燃料生产成本，而且对环境的影响更小，更利于工业化放大应用。
本发明提供的光合-发酵混合培养装置以及应用该装置培养微藻的方法不仅能够提高微藻的油脂产量，降低藻油生产成本，还能够有效利用富氮水源、二氧化碳和有机碳，生产更为环保的生物燃料。
附图说明
图1为光合-发酵混合培养装置的结构示意图。
图2为光合-发酵混合培养装置的工作流程示意图。
图3为某次气相色谱的谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。正癸酸即CH3(CH2)8COOH。
细胞干重的测定方法：取培养体系，8000rpm离心3分钟，收集沉淀（细胞）；洗涤沉淀3-4次（每次洗涤的方法均为：用少量蒸馏水并震荡以悬浮细胞，8000rpm离心3分钟，收集沉淀）；–20℃冷冻细胞24小时，再放入真空冷冻抽干机48小时，之后每隔1小时称量一次，如果相邻的两次称重结果一致，该重量即为细胞干重。
细胞的油脂含量的测定方法：取20mg冻干得到的细胞干粉，在密封的酯化管中与2ml酯化反应液（由97体积份CH3OH、3体积份浓H2SO4和正癸酸组成，正癸酸的浓度为5g/L）100℃反应4小时（转酯化反应，正癸酸形成癸酸甲酯，细胞干粉中的油脂形成脂肪酸甲酯），然后静置至室温，然后加入1ml蒸馏水充分震荡后静置分层，用取样针取下层溶液1μl，上样于气相色谱仪（安捷伦7890A,柱型号HP-1，载气为氮气，进样口温度为100℃；升温程序：从80℃开始，以每分钟20℃升温到120℃，然后以每分钟40℃的速度升温到300℃）进行检测，得到色谱图；根据色谱图中出峰位置晚于癸酸甲酯的所有峰的总峰面积（代表细胞干粉中的所有油脂）与癸酸甲酯对应的峰（保留时间约为3min）的峰面积的比值，以及已知的癸酸的浓度计算和加入的细胞干粉质量计算细胞干粉中的油脂含量。某次气相色谱的谱图见图3。
采用哈希水质监测仪监测液相体系中以NH4 +离子形式存在的氮含量。
采用DNS分光光度法方法测定液相体系中的还原糖浓度。
实施例中所用的小球藻为Chlorella protothecoides0710（即文献中的“C.protothecoides strain0710”）：参考文献：Wei Xiong,Chunfang Gao,Dong Yan,Chao Wu,Qingyu Wu*，Double CO2fixation in photosynthesis–fermentation modelenhances algal lipid synthesis for biodiesel production，BioresourceTechnology101(2010)2287–2293。
实施例1、光合-发酵混合培养装置
本发明提供的光合-发酵混合培养装置的结构示意图见图1，包括光合生物反应器1、浓缩瓶2、除氮器3和发酵罐4。所述光合生物反应器为透明密闭的容器，设有进气口、出气口和出液口。所述浓缩瓶为密闭容器，设有进液口、出液口和可以开关的进样口。所述除氮器为装有除氮材料的密闭容器，设有进液口和出液口。所述发酵罐设有进样口、出样口、进气口、补料口和出气口。所述光合生物反应器的出液口与浓缩瓶的进液口通过管道Ⅰ连通，所述管道Ⅰ上设有三通阀门。所述浓缩瓶的出液口与所述除氮器的进液口通过管道Ⅱ连通。所述除氮器的出液口与所述发酵罐的进样口通过管道Ⅲ连通。所述发酵罐的出气口与所述光合生物反应器的进气口通过管道Ⅳ连通。所述管道Ⅰ、所述管道Ⅱ、所述管道Ⅲ和所述管道Ⅳ上均设有泵。所述光合生物反应器的出气口通过管道与大气连通。所述发酵罐的进气口通过管道与供气装置连通。所述发酵罐的补料口通过管道与补料装置连通。
本实施例中所用的光合生物反应器为玻璃材质，容量为15L。本实施例中所用的浓缩瓶为玻璃材质，容量为500ml。本实施例中所用的离子交换除氮器，用于填充除氮材料的容器为不锈钢材质，容量为1L，填充由500ml除氮材料。本实施例中所用的管道Ⅰ、管道Ⅱ、管道Ⅲ和管道Ⅳ的本体均为硅胶材质，各管道和各容器连接处为不锈钢材质。本实施例中所用的除氮材料为大孔强酸性阳离子交换树脂（北京争光创业科技有限公司，产品目录号C151）。本实施例中所用的发酵罐为瑞士伊孚森生物技术(中国)有限公司的multifors1L发酵罐。
本发明提供的光合-发酵混合培养装置的工作流程图见图2。每一轮循环中，先在光合生物反应器中利用光能和来自发酵罐的尾气和富氮光合培养基培养光合自养微藻，待藻细胞生长到最大细胞密度后，沉降藻细胞，去除上层培养液，将浓缩后的光合自养细胞转入到浓缩瓶中，再泵入除氮器除去培养基中的残留氮，这些光合培养获得的绿色浓缩细胞随后直接进入到发酵罐中，通过补加有机碳进行异养转化发酵培养，发酵尾气再通入前面的光合反应器中，进行新一轮光合自养微藻的培养。发酵罐中的黄色藻细胞在发酵终止后收获下来提取油脂，用于制备微藻生物柴油。
实施例2、培养基的制备
富氮光合培养基由氯化铵和基础培养基组成，氯化铵的浓度为8g/L。
基础培养基的制备方法：将0.7g KH2PO4、0.3g K2HPO4、0.3g MgSO4·7H2O、3mgFeSO4·7H2O、0.01mg维生素B1、2.86mg H3BO3、0.222mg ZnSO4·7H2O、1.81mg MnCl2·4H2O、0.074mg CuSO4·5H2O和0.039mg Na2MoO4·2H2O用水定容至1L。
实施例3、应用实施例1制备的光合-发酵混合培养装置和实施例2制备的培养基培养小球藻
一、第一个循环
1、打开浓缩瓶的进样口，加入200ml小球藻细胞悬液后关闭进样口。本步骤发生于实验第1天。
2、通过三通阀门从外界向光合生物反应器中加入13L富氮光合培养基，然后在泵的压力下使浓缩瓶中的小球藻细胞悬液通过管道Ⅰ进入光合反应器，初始体系中小球藻的初始细胞密度为0.38±0.09g/L；在100μmol photon/m2/s光照强度和28±0.5℃培养温度下培养8天。培养过程中，发酵罐通过管道Ⅳ向光合生物反应器通气，以促进培养体系搅动。从外界给发酵罐供气，空气流速为2L/min。本步骤发生于实验第1天至第8天。完成本步骤后，检测细胞密度，细胞密度为1.03±0.07g/L（以细胞干重计）。
实际应用中本步骤培养6-8天均可，通常培养8天后小球藻达到最大细胞密度。
3、完成步骤2后，停止通气并静置1天，通过三通阀门从光合生物反应器中抽取并弃除上清液，剩余约200ml的液体[即浓缩体积比为（13000+200）：200=66:1]，在泵的作用下剩余的约200ml的液体通过管道Ⅰ进入浓缩瓶。本步骤发生于实验第9天。
实际应用中，剩余约100ml的液体也可，即浓缩体积比为132：1。
4、在泵的作用下，浓缩瓶中的液体以3ml/分钟的速率通过管道Ⅱ进入除氮器，经过除氮材料后又通过管道Ⅲ进入发酵罐（除氮材料的功能为使得液相体系中以NH4+离子形式存在的氮含量为40mg/L以下），通过发酵罐的补料口加入200ml含30g/L葡萄糖的基础培养基，发酵8天。发酵温度为28±0.5℃，pH值为6.2±0.1，空气流速为2L/min，搅拌速度为200rpm，溶氧量为20-50%。发酵过程中，即时监测发酵体系中的还原糖浓度，当还原糖浓度低于10g/L时补加葡萄糖并使还原糖浓度达到30±5g/L，每累计加入12g葡萄糖时加入0.8g酵母提取物。发酵尾气通过管道Ⅳ进入光合反应器。本步骤发生于实验第10天至第17天。
完成本步骤后，检测细胞密度并检测细胞干粉中的油脂含量。以细胞干重计，细胞密度为100.51±2.03g/L。细胞干粉中的油脂含量为60.05±1.38%(质量比)。通过细胞密度和细胞中的油脂含量计算发酵体系中的油脂产量，为60.36±2.63g/L。
发酵结束后收获细胞即可用于提取油脂。也可以将一部分细胞加入光合反应器进行新一轮培养，剩余的细胞用于提取油脂。
实际应用中，发酵过程中，每累计加入12g葡萄糖时加入0.4g酵母提取物也可。
二、第二个循环
1、同步骤一的1。
本步骤发生于实验第10天。
2、同步骤一的2。
本步骤发生于实验第10天至第17天。
3、同步骤一的3。
本步骤发生于实验第18天。
4、同该步骤一的4。
本步骤发生于实验第19天至第26天。
完成步骤4后，取样检测细胞密度并检测细胞干粉中的油脂含量。以细胞干重计，细胞密度为92.01±2.44g/L。细胞干粉中的油脂含量为64.64±3.09%。通过细胞密度和细胞中的油脂含量计算发酵体系中的油脂产量，为59.48±4.49g/L。
三、第三个循环
1、同步骤一的1。
本步骤发生于实验第19天。
2、同步骤一的2。
本步骤发生于实验第19天至第26天。
3、同步骤一的3。
本步骤发生于实验第27天。
4、同该步骤一的4。
本步骤发生于实验第28天至第35天。
完成步骤4后，取样检测细胞密度并检测细胞干粉中的油脂含量。以细胞干重计，细胞密度为95.98±3.28g/L。细胞干粉中的油脂含量为55.15±1.57%。通过细胞密度和细胞中的油脂含量计算发酵体系中的油脂产量，为52.93±3.37/L。
后续步骤依次类推。
每个循环中，在发酵罐的进样口取样，检测其中的氮浓度，如果氮浓度超过40mg/L，需要用1M HCL冲洗除氮材料8小时，再用去离子水冲洗至pH6.0。
Claims (3)
1.应用光合-发酵混合培养装置培养微藻的方法，包括至少两个循环；
所述光合-发酵混合培养装置，包括光合生物反应器(1)、浓缩瓶(2)、除氮器(3)和发酵罐(4)；
所述光合生物反应器为透明密闭的容器，设有进气口、出气口和出液口；
所述浓缩瓶为密闭容器，设有进液口、出液口和可以开关的进样口；
所述除氮器为装有除氮材料的密闭容器，设有进液口和出液口；
所述发酵罐设有进样口、出样口、进气口、补料口和出气口；
所述光合生物反应器的出液口与所述浓缩瓶的进液口通过管道Ⅰ连通，所述管道Ⅰ上设有三通阀门；所述浓缩瓶的出液口与所述除氮器的进液口通过管道Ⅱ连通；所述除氮器的出液口与所述发酵罐的进样口通过管道Ⅲ连通；所述发酵罐的出气口与所述光合生物反应器的进气口通过管道Ⅳ连通；
所述除氮材料为阳离子交换树脂；
每个循环依次包括如下步骤：
(1)在所述光合生物反应器中，用富氮光合培养基培养微藻至最大细胞密度；所述培养过程中，来自发酵罐的气体通过所述管道Ⅳ进入所述光合生物反应器以促使培养体系搅动；所述富氮光合培养基为含有3-10g/L氮源的培养基；
(2)将培养体系浓缩后使其通过所述管道Ⅰ进入所述浓缩瓶；
(3)使所述浓缩瓶中的液体通过所述管道Ⅱ进入所述除氮器；
(4)使所述除氮器中的液体通过所述管道Ⅲ进入所述发酵罐，在限氮发酵培养基中进行发酵，发酵产生的气体通过所述管道Ⅳ进入所述光合生物反应器；所述限氮发酵培养基为氮源浓度为3g/L以下、有机碳浓度为10-50g/L的培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述管道Ⅰ、所述管道Ⅱ、所述管道Ⅲ和所述管道Ⅳ上均设有泵。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述将培养体系浓缩的方法如下：使所述光合生物反应器中的培养体系静置，然后通过所述三通阀门抽取并弃除光合生物反应器中的培养上清。
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