CN103993046A

CN103993046A - 一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法

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Publication number: CN103993046A
Application number: CN201310053534.6A
Authority: CN
Inventors: 刘建国; 宋萍萍; 刘倩; 龙元薷; 庞通; 林伟; 李凌; 张振; 何梅琳
Original assignee: Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-02-19
Filing date: 2013-02-19
Publication date: 2014-08-20

Abstract

本发明属微藻生物技术领域，涉及一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法。将单细胞红球藻接种于光生物反应器内，在游动细胞阶段培养，获得生物量，而后诱导细胞转化为不动细胞，进而实现快速积累高附加值天然虾青素和生物能源油脂；最后采用沉降、离心分离得到高附加值的虾青素以及微藻能源（生物柴油）原料。本发明通过人工诱导单细胞红球藻在累积高附加值活性物质的同时生产生物能源原料油脂。其开发模式不仅提高了微藻生物资源综合利用效率，也为微藻生物柴油开发经济可行性带来了可能。

Description

一种利用红球藻生产微藻能源(生物柴油)原料的工艺方法

技术领域

本发明属微藻生物技术领域，涉及一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法。

背景技术

能源是经济发展的命脉和社会发展的推动力，决定着现代文明进步程度。伴随着全球经济高速增长和城市化进程加快，能源需求日益增大；同时，传统能源具有不可再生性，终将枯竭。在我国化石能源短缺、储备不足，不能满足高速发展的经济社会需要，能源形势面临十分严峻的局面。目前我国已成为全球石油消耗大国，其消耗量仅次于美国位于全球第二。预计到2030年我国对能源进口的依赖度可能达到80％。同时，传统燃料排放大量CO₂，导致温室效应日趋严重，因而引起系列气候和生态变化问题，CO₂减排已成为亟待解决的全球性问题。寻求可再生能源是社会关注的大问题。

近年来，作为化石能源替代品之一的生物柴油是国际上可再生能源的新生力量，发展迅猛、应用范围不断扩大。在生物能源中，微藻具有光合作用效率高、含油量高、生长周期短、油脂单位面积产率高等独特优势。据理论计算，微藻产油能力是油菜、大豆、玉米等作物产油量的几十倍。发展微藻生物柴油具有独特优势和广阔前景。规模化开发微藻柴油，可充分满足经济、社会长期持续发展和国家安全的战略需求。

尽管如此，迄今为止国际上在该领域工作依然停留在前期研究与中试论证的起步阶段，生产成本过高将一直是限制着该产业发展经济可行性的屏障。为此，寻找并开发兼产高附加值产品的产油微藻，均摊和相对降低生物能源生产将是本领域重点方向之一。

雨生红球藻具有复杂的细胞周期和多种繁殖方式，可简单地分为游动和不动细胞阶段。游动细胞阶段的细胞行无性生殖（孢子）和营养繁殖（2分裂），细胞多呈绿色。不动细胞阶段的细胞行无性生殖（孢子）和营养繁殖（出芽），不动细胞形态为圆球形，无鞭毛，不会游动。细胞大小变化幅度较大，刚形成的不动细胞通常为绿色，随后从中央开始向外逐渐变成红色，直至整个细胞呈鲜红色。该藻在胁迫条件下，如缺乏氮、磷或强光照射下，藻细胞生长趋于缓慢，同时次生代谢产物虾青素大量积累。规模化生产中，虾青素含量一般占细胞干重的1-2％，高的可达3-4％，理论上最高达6％，被公认为自然界中虾青素含量最高的生物，是获取高附加值天然虾青素的理想材料。另外，在虾青素累积过程中，红球藻同时也可累积大量油脂，这些油脂也是生物能源开发的原料。虾青素可广泛应用在水产、化妆品、食品和医药等领域，因此通过开发红球藻虾青素资源，同时生产生物能源原料，可综合利用该生物资源，并在很大程度上均摊和降低生物能源生产成本。

发明内容

本发明目的在于提供一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，将生长至对数生长期的单细胞红球藻于光生物反应器内经过人工培养在游动细胞阶段快速繁殖，获取生物量，而后诱导细胞转化为不动细胞，实现快速积累高附加值天然虾青素和生物能源油脂；最后采用沉降、离心分离得到高附加值的虾青素以及微藻能源（生物柴油）原料。

所述光生物反应器由封闭体系的光生物反应器与开放体系的光生物反应器相结合组成。

所述封闭体系的光生物反应器为柱状光生物反应器或平板光生物反应器或管道式光生物反应器；开放体系的光生物反应器为敞开跑道池光生物反应器。

将红球藻在游动细胞阶段培养到稳定生长期，然后转入到缺氮和/或缺磷的培养基中在胁迫条件下诱导游动细胞向不动细胞转化；不动细胞降低生长速度并开始累积虾青素和油脂，随着上述胁迫时间的延长，在红球藻不动细胞内实现快速积累高附加值的天然虾青素和生物能源油脂。

所述缺氮和/或缺磷的培养基具体指在培养红球藻的相应培养基中未添加氮磷营养元素，或由于前期游动细胞生长已经将藻液中的氮磷营养耗尽，而实际产生的营养亏缺培养基。

将诱导培养后的藻细胞采用自然沉降、板框过滤和离心收集藻泥，所得藻泥经高压均质或高速物理碰撞实现细胞破壁，细胞破碎后利用超临界二氧化碳提取分离得到虾青素和能够转化为生物柴油的微藻能源原料。

所述离心后收集的藻泥需经反复清洗后，直接经高压均质的方式实现细胞破壁；或清洗后的藻泥通过真空冷冻喷雾干燥处理成干藻粉，再利用超高速碰撞的方式实现细胞破壁。

本发明所具有的优点：本发明通过人工诱导单细胞红球藻在累积高附加值活性物质的同时生产生物能源原料油脂。其开发模式的具有以下主要优点：通过微藻培养可生产出更多的产品，提高了生物资源综合利用效率；所生产的高附加值的产品虾青素属于纯天然产品，具有鲜红色泽和很强的抗氧化活性，为特种水产饲料、化妆品、食品和药品开发带来了可能性；高附加值产品虾青素的开发，也均摊降低了油脂生产成本，为微藻生物柴油开发经济可行性带来了可能。

附图说明

图1为本发明实施例提供的雨生红球藻培养的光生物反应器示意图，其中A、平板光生物反应器；B、柱状光生物反应器；C、管道光生物反应器；D、跑道池光生物反应器；代表符号：0、温度控制装置；1、温度检测传感器；2、氧气检测传感器；3、pH检测传感器；4、物料进口；5、物料出口；6、气体出口；7、气体（空气+二氧化碳）入口；8、光生物反应器；9、藻液；10、光源；11、水泵；12、交换塔；13、导流板；14、搅拌水车；15、电机。

图2为本发明实施例提供的利用雨生红球藻生产微藻能源的开发技术与工艺流程。

图3为本发明实施例提供的红球藻油脂脂肪酸的气相色谱图。

具体实施方式

本发明针对微藻能源（生物柴油）开发成本过高的问题，提出具体方案：构建光生物反应器系统（参见图1），选取其中的平板(图1A)、柱状(图1B)、跑道池（图1C）和管道（图1D）等光生物反应器；接种雨生红球藻于上述反应器中，采用MCM、BG11、L1、1/2f、BBM等基础培养基（表1）或优化和改良培养基，首先控制培养条件在游动细胞阶段快速繁殖，获取生物量；然后改变培养条件诱导细胞转化为不动细胞，实现快速积累高附加值天然虾青素和生物能源油脂；而后采用以下工艺进行分离虾青素和油脂：藻细胞沉降、离心技术收获藻泥——高压均质或高速物理碰撞技术进行细胞破壁——超临界提取脂溶性成分，然后先分离出高附加值的虾青素成分，均摊掉生物能源的生产成本，然后将剩余油脂用于生物柴油加工。

具体为：

1.光生物反应器为封闭式的管道光生物反应器、柱状光生物反应器和平板光生物反应器、以及敞开式的跑道池光生物反应器中的一种类型或几种类型的组合。

其中各个光生物反应器（8）内插设有控制培养藻液的温度、溶解氧气和pH值的温度传感器（1）、溶氧传感器(2)和pH电极传感器(3)（参见图1A、B、C和D）。

各个光生物反应器（8）可由透明材质（如玻璃、玻璃等）或不透明材质（不锈钢材、建筑材料等）等构建，其中透明材质构建的光生物反应器可从内部或外部提供光照（10），而不透明材质只能采用内置光源；光源可包括自然光和人工光源，如荧光灯管、碘钨灯和LED等，人工光源光质可进一步分为全色光、红光和蓝光。各个光生物反应器（8）内的温度可通过加热和冷凝装置调节（0），光照强度、光质、光照时间、温度等模式可通过计算机程序控制；物料可通过管道和泵自动上料(4)或卸料（5）。（上述反应器可由现有反应器直接连接进行操作）

2.在光生物反应室内，接种产高附加值虾青素并累积生物油脂的红球藻（Haema tococcus sp.）藻种，通过人工培养在适宜培养基内获得生物量，然后通过施加胁迫让游动细胞转化为不动细胞，累积虾青素和生物油脂。

其中，有利于培养红球藻获得生物量的培养基，主要特点氮磷钾及其它营养盐丰富的培养基，如通常所指的MCM、BG11、L1、1/2f、BBM等（具体参表1），以及以此为基础进一步优化和改良的培养基；而有利于游动细胞向不动细胞转化、诱导虾青素累积和生物油脂生产培养基，主要以MCM、BG11、L1、1/2f、BBM等为基础，通过降低配方中的氮与磷含量，而形成的营养亏缺培养基。

表1.几种用于红球藻培养的常见培养基组成及其配方

3.将诱导培养后的藻细胞采用自然沉降、板框过滤和离心收集藻泥，手机的藻泥需要经过3-5次反复清洗，充分去掉矿物质残留，清洗后的藻泥可直接经过高压均质粉碎工艺，或是清洗后藻泥先经真空冷冻喷雾干燥技术干燥，然后再用超高速碰撞细胞破壁技术实现细胞破壁，破壁后的生物质藻粉或藻泥，直接利用超临界二氧化碳提取，将其中脂溶性油脂和高附加值虾青素充分提取；上述脂溶性物质首先在有效保护其天然虾青素基础上分离，同时将藻渣进行综合利用和提高经济效益，最后将残余的油脂收集，用作生物柴油制备原料。

具体实施方式

实施例1

选择雨生红球藻，利用BG11配方制作培养基（参见表1），在22-25℃条件下，和室内自然漫散光并辅助以50μE·m^2-·s^-1光照强度的灯光光照，按照14:10的光照与黑暗节律培养红球藻藻种。

红球藻藻种培养12天后，细胞处于快速繁殖的对数生长期。将该藻种接种到柱状光生物反应器中，其内含有利用BG11配方制作培养基，然后在20-25℃的培养车间内继续培养，培养采用自然日光光源，光照强度可通过遮阳帘调节控制，强度在1000-2000μE·m^2-·s^-1范围内，继续扩大培养2周。

将扩大培养的红球藻藻株，再通过封闭管道系统转入到开放式跑道池生物反应器中。利用营养亏缺（主要是氮磷亏缺）的培养基（具体配方可见表1，但其中的氮磷营养元素不添加）诱导细胞发生转化，游动细胞大量转化为不动细胞，并进一步诱导虾青素和油脂累积。诱导条件，光源采用自然日光，其光照强度在白天基本维持在1000-3000μE·m^2-·s^-1之间变化，人工培养时间14天，期间的藻液水温和pH值都不进行人工控制，随天气在20-33℃之间自然变化，而pH值从初始的8.5缓慢上升到9.7左右。培养期间，藻液依靠水车搅拌流动并避免下沉，让红球藻不动细胞充分接受阳光，同时大量积累虾青素和生物油脂。收获前，停止藻液搅拌，依靠自然沉降原理使藻体沉积在培养池的底部，放掉上清液，初步获得浓缩的藻液。藻液通过管道放入收集塔中，进一步利用沉降原理排掉上清液，获得进一步浓缩的藻液。然后依靠滤布孔径小于20微米的板框过滤，进一步浓缩；再以连续离心或间歇离心获得藻泥，离心力大于700g，并用净洁的自然水反复清洗藻泥5次，最终从1个600平米的跑道反应池中获得鲜藻72公斤(其中三分之二为水份)，经过喷雾干燥获得干藻粉23公斤，利用超高速碰撞技术细胞破壁加工，然后利用二氧化碳在超临界状态（萃取压力35-40MPa和30-33℃下萃取，压力降低到5-8Mpa和温度升高在35-37℃下分离）提取脂溶性虾青素油，最后获含4.1％虾青素的油剂9.2公斤。其中二氧化碳在超临界状态提取过程，萃取压力35-40MPa和30-33℃下萃取，压力降低到5-8Mpa和温度升高在35-37℃下分离。

实施例2

藻株选择雨生红球藻，利用MCM培养基配方（参表1），温度在20-23℃下，光照采用室内自然漫散光，并辅助70μE·m^2-·s^-1光照强度的LED灯光，光照周期14:10(光照:黑暗)进行藻种培养。

藻种培养10天处于对数生长期，将藻种接种到柱状光生物反应器中，利用MCM改良培养基配方，在20-23℃的培养车间内，采用自然光为光源，光照强度调节控制在1200-2300μE·m^2-·s^-1范围内，继续扩大培养10天。

将扩大培养的红球藻，再通过管道系统转入开放式管道光生物反应器中，利用氮磷营养亏缺的MCM培养基（具体配方可见表1，但其中的氮磷营养元素不添加）先诱导细胞转化，使游动细胞大量转化为不动细胞，然后不动细胞进行虾青素积累和油脂合成，期间采用自然日光为光源，其光照强度（白天）基本维持在1500-3000μE·m^2-·s^-1变化。人工培养12天，期间的藻液水温和pH值都不进行人工控制，随天气在22-33℃之间自然变化，而pH值从初始的8.7缓慢上升到9.8左右。培养期间，藻液依靠水车搅拌流动并避免下沉，让红球藻不动细胞充分接受阳光，同时大量积累虾青素和生物油脂。将藻液收获到收集塔内，依靠自然沉降原理让藻体沉积在底部，放掉上清液，获得浓缩藻液。然后通过板框过滤进一步浓缩后，再经离心获得藻泥，并用净洁的自然水反复清洗藻泥3次，1个管道光生物反应器获得鲜藻20.5公斤(其中三分之二为水份)，经过干燥获得干藻粉6.3公斤，破壁加工和超临界提取获含6.0％虾青素的油剂4.2公斤。

实施例3

选择雨生红球藻利用BBM培养基优化配方，在21-24℃下，室内自然漫散光辅助70μE·m^2-·s^-1光照强度的LED灯光下培养，培养期间的光照周期为14:10(光照:黑暗)。

培养10天后，将处于对数生长期的藻种，接种到平板光生物反应器中，利用BBM改良培养基配方，在培养车间内(藻液温度22-25℃)，采用自然光为光源，光照强度调节控制1200-2000μE·m^2-·s^-1，继续扩大培养12天。

将扩大培养的红球藻，再通过管道系统转入开放室跑道池生物反应器中。利用营养亏缺（主要是氮磷亏缺）的BBM培养基（具体配方可见表1，但其中的氮磷营养元素不添加）诱导其游动细胞转化为不动细胞，进而诱导其虾青素积累和油脂合成，以自然日光为光源，其光照强度在白天基本维持1500-2600μE·m^2-·s^-1变化。室外自然条件，人工培养10天，期间藻液水温随天气在20-31℃之间自然变化，而pH值从初始的8.1缓慢上升到9.5左右。培养过程中依靠水车搅拌保持藻液循环流动，让红球藻不动细胞充分积累虾青素和油脂。收获前，停止搅拌，依靠自然沉降原理使藻体沉积在培养池底部，放掉上清液，初步获得浓缩的藻液。将上述藻液收获到收集塔内，依靠自然沉降原理让藻体沉积在底部，放掉上清液，获得浓缩藻液。然后依靠板框过滤技术和离心技术获得藻泥，并用净洁的自然水反复清洗藻泥4次。最终，1个850平米的跑道反应池获得鲜藻泥112.4公斤，其中约三分之一为红球藻生物质，经过冷冻真空干燥获得干藻粉36.7公斤，同样利用超高速碰撞破壁加工，采用二氧化碳超临界提取富含虾青素的油脂，获虾青素3.5％的油剂15.2公斤。

将上述个实施例中所得含虾青素的油剂，首先获得高附加值虾青素，剩余油脂经过气相色谱分析（参附图3），脂肪酸含量约占总脂的40.0％-45.0％周围变化，其中，最适宜于生物柴油开发的脂肪酸C14-18含量较多，具体不同脂肪酸的比例如下：

C16:0，占12％左右；C18:0，约占3.0％左右；C18:1，约占10％左右；C18:2，约占8.3％；C18:3，占6.5％左右。

同时上述实施例中的具有复杂细胞周期的单细胞绿藻物种红球藻（Haema tococcus pluvialis），可由下述但不局限于如下的红球藻进行替换，具体为中国科学院典型物种种质库中的红球藻FACHB-797株、FACHB-712、FACHB-874，英国原生动物与藻类种质库内的CCCAP-34/12、CCCAP-34/1F株、CCCAP-34/13株、CCCAP-34/14株、CCCAP-34/1D株、CCCAP-34/6株、CCCAP-34/7株等。

Claims

1.一种利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：将生长至对数生长期的单细胞红球藻于光生物反应器内经过人工培养在游动细胞阶段快速繁殖，获取生物量，而后诱导细胞转化为不动细胞，实现快速积累高附加值天然虾青素和生物能源油脂；最后采用沉降、离心分离得到高附加值的虾青素以及微藻能源（生物柴油）原料。

2.按权利要求1所述的利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：所述光生物反应器由封闭体系的光生物反应器与开放体系的光生物反应器相结合组成。

3.按权利要求2所述的利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：所述封闭体系的光生物反应器为柱状光生物反应器或平板光生物反应器或管道式光生物反应器；开放体系的光生物反应器为敞开跑道池光生物反应器。

4.按权利要求1所述的利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：将红球藻在游动细胞阶段培养到稳定生长期，然后转入到缺氮和/或缺磷的培养基中在胁迫条件下诱导游动细胞向不动细胞转化；不动细胞降低生长速度并开始累积虾青素和油脂，随着上述胁迫时间的延长，在红球藻不动细胞内实现快速积累高附加值的天然虾青素和生物能源油脂；

5.按权利要求1所述的利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：将诱导培养后的藻细胞采用自然沉降、板框过滤和离心收集藻泥，所得藻泥经高压均质或高速物理碰撞实现细胞破壁，细胞破碎后利用超临界二氧化碳提取分离得到虾青素和能够转化为生物柴油的微藻能源原料。

6.按权利要求5所述的利用红球藻生产微藻能源（生物柴油）原料的工艺方法，其特征在于：所述离心后收集的藻泥需经反复清洗后，直接经高压均质的方式实现细胞破壁；或清洗后的藻泥通过真空冷冻喷雾干燥处理成干藻粉，再利用超高速碰撞的方式实现细胞破壁。