CN104862232A - 一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基及配制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适用于雨生红球藻营养生长阶段的改良MCM培养基及配制方法:先分别配制A液母液、B液母液、C液母液和D液母液;A液为硝酸钾200mg/L,磷酸氢二钾20mg/L,七水合硫酸镁100mg/L;B液为无水氯化钙40.5mg/L;C液为乙二胺四乙酸二钠19.8μg/L,六水合三氯化铁24.4μg/L;D液为氯化锌4.1μg/L,硼酸61μg/L,六水合氯化钴5.1μg/L,五水合硫酸铜6.0μ/L,六水合氯化锰4.1μg/L和四水合钼酸铵38μg/L,溶剂为灭菌自来水,使用时依次将定量A液、B液、C液和D液母液溶于溶剂中,调节pH7.0±0.1,将雨生红球藻藻种接种于培养基。本发明的改良MCM培养基营养均衡、成本低,配置过程操作简单,可储存,培养藻种生长率和生物量积累高,有利于提高工厂化生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种适用于微藻养殖的培养基及配制方法,具体涉及一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基及配制方法,尤其涉及一种适用于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段的改良MCM培养基及配制方法,该培养基适用于雨生红球藻712株品系、雨生红球藻797株品系的规模化培养。
背景技术
雨生红球藻(Haematococuus pluvialis)是一种单细胞淡水绿藻,在分类学上属于绿藻门,绿藻纲,团藻目,红球藻科,红球藻属。在环境胁迫条件下能迅速合成一种红色的酮式类胡萝卜素虾青素,是公认的自然界中生产天然虾青素的最好生物,其积累量最高可达细胞干重的4%。虾青素可在水产养殖(如鲑鱼)及家禽养殖中做饲料添加剂,另一方面,虾青素的抗脂肪抗氧化能力最强,比β-胡萝卜素高10倍,比维生素E高100倍,又被称为“超级维生素E”,在营养保健,医药和化妆品领域有很大的应用潜力。同时,雨生红球藻还是研究次生类胡萝卜素的生物合成与基因表达以及细胞的感光与运动的良好材料。因此,雨生红球藻的工厂化规模生产日趋重要。
雨生红球藻具有特殊的生物学性质,其生活周期中主要有两种不同的细胞类型,即进行营养生长的绿色游动细胞以及累积虾青素的红色不动细胞。在有利的生长条件下,细胞生长旺盛,以绿色的游动细胞存在,细胞内含极少量虾青素;而在不利的环境下,细胞受到胁迫,生长趋于缓慢,游动细胞尾部脱落,运动能力丧失由游动状态逐渐趋于静止状态,细胞体积增大,转化为厚壁孢子,同时大量累积虾青素,细胞由绿转红。目前工厂化大规模培养雨生红球藻最大的壁垒就在于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段其相对生长率低,生物量积累低。
雨生红球藻绿色细胞营养阶段培养一般采取传统MCM培养基,传统MCM培养基配方为硝酸钾200mg/L,磷酸氢二钾20mg/L,七水合硫酸镁100mg/L,六水合氯化钙80mg/L,维他命B12,40μg/L乙二胺四乙酸二钠19.8μg/L,六水合三氯化铁24.4μg/L,微量元素溶液1ml内含氯化锌4.1μg/L,硼酸61μg/L,六水合氯化钴5.1μg/L,五水合硫酸铜6.0μ/L,四水合氯化锰4.1μg/L和四水合钼酸铵38μg/L。该培养基已在实验室和工厂化养殖中沿用多年,且有在雨生红球藻培养方面取得不错的效果。但是,传统MCM培养基仍有不足之处。1.传统培养基由于配方之间没有分批投放,易导致如水合硫酸镁中的硫酸根离子和六水合氯化钙中的钙离子结合生成沉淀使培养基中营养缺失。2.传统培养基由于失效快,只能现用现配,无法储存,使用繁琐。3.传统培养基所使用的配方原料价格偏高,不符合大规模工厂化生产节约成本的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足,而提供一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基及配制方法,对传统MCM培养基进行改良,可以有效解决传统培养基易生成沉淀导致营养缺失,无法存储,使用繁琐,原料价格高等技术缺陷。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基的配制方法,配制方法为:先分别配制A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液,A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别保存;使用时,依次将A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液溶于溶剂中,调节pH后即可接种雨生红球藻的藻种。
进一步的,所述的配制方法具体包括以下步骤:
(1)配制A溶液母液:称取20g硝酸钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取2g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取10g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的硝酸钾溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀,用溶剂定容至1L配成A液母液,使硝酸钾浓度为20g/L,磷酸氢二钾浓度为2g/L,七水合硫酸镁浓度为10g/L;
(2)配制B溶液母液:称取4.05g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解,用溶剂定容至1L配成B液母液,使氯化钙浓度为4.05g/L;
(3)配制C溶液母液:称取198mg乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取244mg六水合三氯化铁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的乙二胺四乙酸二钠溶液和六水合三氯化铁溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成C溶液母液,使乙二胺四乙酸二钠浓度为198mg/L,六水合三氯化铁为244mg/L;
(4)配制D溶液母液:称取41mg氯化锌溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取610mg硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取51mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取60mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取41mg六水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取380mg四水合钼酸铵溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的氯化锌溶液、硼酸溶液、六水合氯化钴溶液、五水合硫酸铜溶液、六水合氯化锰溶液和四水合钼酸铵溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成D溶液母液,使氯化锌浓度为41mg/L,硼酸浓度为610mg/L,六水合氯化钴浓度为51mg/L,五水合硫酸铜浓度为60mg/L,六水合氯化锰浓度为41mg/L,四水合钼酸铵浓度为380mg/L;
(5)使用时,取10mL A溶液母液、10mL B溶液母液、100μL C溶液母液和100μL D溶液母液,依次溶于970mL溶剂,最后用溶剂定容至1L;使A液硝酸钾浓度为200mg/L、磷酸氢二钾浓度为20mg/L、七水合硫酸镁浓度为100mg/L,B液无水氯化钙浓度为40.5mg/L,C液乙二胺四乙酸二钠浓度为19.8μg/L、六水合三氯化铁浓度为24.4μg/L,D液氯化锌浓度为4.1μg/L、硼酸浓度为61μg/L、六水合氯化钴浓度为5.1μg/L、五水合硫酸铜浓度为6.0μg/L、六水合氯化锰浓度为4.1μg/L、四水合钼酸铵浓度为38μg/L;用pH计调节pH为6.9-7.1,然后用于接种所需培养的雨生红球藻藻种。
进一步的,所述的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别于4℃、避光条件下保存,可以保存1-2个月。
进一步的,所述的溶剂为经过120℃高温100kpa高压灭菌20分钟的自来水,冷却至室温后用于配制培养基。
本发明还提供一种按照上述配制方法配制而成的改良培养基。
进一步的,所述的改良培养基用于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段。
进一步的,所述的改良培养基用于雨生红球藻712株品系或雨生红球藻797株品系的规模化培养。
本发明所述的配制方法操作简单,可储存;获得的改良培养基,营养均衡、成本低,培养藻种生长率和生物量积累高,特别有利于提高工厂化生产效率,特别有利于提升现有情况下工厂化微藻培养的效率。
具体实施方式
下面结合实施例来对本发明配制方法以及获得的改良培养基进行具体的描述:
实施例1:
一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基的配制方法,包括以下步骤:
(1)配制A溶液母液:称取20g硝酸钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取2g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取10g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的硝酸钾溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀,用溶剂定容至1L配成A液母液,使硝酸钾浓度为20g/L,磷酸氢二钾浓度为2g/L,七水合硫酸镁浓度为10g/L;
(2)配制B溶液母液:称取4.05g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解,用溶剂定容至1L配成B液母液,使氯化钙浓度为4.05g/L;
(3)配制C溶液母液:称取198mg乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取244mg六水合三氯化铁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的乙二胺四乙酸二钠溶液和六水合三氯化铁溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成C溶液母液,使乙二胺四乙酸二钠浓度为198mg/L,六水合三氯化铁为244mg/L;
(4)配制D溶液母液:称取41mg氯化锌溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取610mg硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取51mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取60mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取41mg六水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取380mg四水合钼酸铵溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的氯化锌溶液、硼酸溶液、六水合氯化钴溶液、五水合硫酸铜溶液、六水合氯化锰溶液和四水合钼酸铵溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成D溶液母液,使氯化锌浓度为41mg/L,硼酸浓度为610mg/L,六水合氯化钴浓度为51mg/L,五水合硫酸铜浓度为60mg/L,六水合氯化锰浓度为41mg/L,四水合钼酸铵浓度为380mg/L;
(5)使用时,取10mL A溶液母液、10mL B溶液母液、100μL C溶液母液和100μL D溶液母液,依次溶于970mL溶剂,最后用溶剂定容至1L。使A液、B液、C液、D液各化合物的最终浓度如表1所示;用pH计调节pH为7后即得改良培养基。
所述的溶剂为经过120℃高温100kpa高压灭菌20分钟的自来水,冷却至室温后用于配制培养基。
表1:本发明改良MCM培养基配方含中文名与化学式对照表:
实施例2:本发明现配改良培养基培养雨生红球藻712株品系:
(1)准备:6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶,实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良MCM培养基,对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统MCM培养基,pH均用pH计调为7,培养基均为现用现配,并且每瓶内均含3L培养基;
(2)接种:第1天在实验组、对照组分别接种712株品系雨生红球藻指数生长期绿色营养阶段藻种,使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml;
(3)培养:实验组和对照组在同一光照培养箱中培养,光暗周期12:12,温度23℃,光强50μmol·m-2·s-1;实验组和对照组均采取摇床摇藻,每日早中晚各人工再摇藻一次;
(4)结果比较:培养10天后,实验组雨生红球藻细胞密度达2.2×106cells/ml,对照组雨生红球藻细胞密度达1.8×106cells/ml;实验组相对于对照组,细胞培养浓度提高了22.2%。
实施例3:本发明储存1个月的改良培养基培养雨生红球藻712株品系:
(1)准备:6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶,实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良MCM培养基,对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统MCM培养基,本发明改良培养基的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别于4℃、避光条件下储存1个月,然后配制成改良MCM培养基;传统MCM培养也于4℃、避光条件下储存1个月之后使用;两种培养基pH均用pH计调为7,并且每瓶内均含3L培养基;
(2)接种:第1天在实验组、对照组接种712株品系雨生红球藻指数生长期绿色营养阶段藻种,使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml;
(3)培养:实验组和对照组在同一光照培养箱中培养,光暗周期12:12,温度23℃,光强50μmol·m-2·s-1;实验组和对照组均采取摇床摇藻,每日早中晚各人工再摇藻一次;
(4)结果比较:培养10天后,实验组雨生红球藻细胞密度达2.0×106cells/ml,对照组雨生红球藻细胞密度达1.3×106cells/ml;实验组相对于对照组,细胞培养浓度提高了53.8%。
实施例4:本发明现配改良培养基培养雨生红球藻797株品系:
(1)准备:6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶,实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良MCM培养基,对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统MCM培养基,pH均用pH计调为7,培养基均为现用现配,并且每瓶内均含3L培养基;
(2)接种:第1天在实验组、对照组分别接种797株品系雨生红球藻指数生长期绿色营养阶段藻种,使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml;
(3)培养:实验组和对照组在同一光照培养箱中培养,光暗周期12:12,温度23℃,光强50μmol·m-2·s-1;实验组和对照组均采取摇床摇藻,每日早中晚各人工再摇藻一次;
(4)结果比较:培养10天后,实验组雨生红球藻细胞密度达2.1×106cells/ml,对照组雨生红球藻细胞密度达1.8×106cells/ml;实验组相对于对照组,细胞培养浓度提高了16.7%。
实施例5:本发明储存1个月的改良培养基培养雨生红球藻797株品系:
(1)准备:6个5L已高压灭菌透明玻璃锥形瓶,实验组3个5L透明玻璃锥形瓶内含本发明改良MCM培养基,对照组3个5L透明玻璃锥形瓶内含传统MCM培养基,本发明改良培养基的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别于4℃、避光条件下储存1个月,然后配制成改良MCM培养基;传统MCM培养也于4℃、避光条件下储存1个月之后使用;两种培养基pH均用pH计调为7,并且每瓶内均含3L培养基;
(2)接种:第1天在实验组、对照组接种797株品系雨生红球藻指数生长期绿色营养阶段藻种,使每锥形瓶中细胞接种密度均为1.0×106cells/ml;
(3)培养:实验组和对照组在同一光照培养箱中培养,光暗周期12:12,温度23℃,光强50μmol·m-2·s-1;实验组和对照组均采取摇床摇藻,每日早中晚各人工再摇藻一次;
(4)结果比较:培养10天后,实验组雨生红球藻细胞密度达1.9×106cells/ml,对照组雨生红球藻细胞密度达1.2×106cells/ml;实验组相对于对照组,细胞培养浓度提高了58.3%。
由上述结果可知,本发明的改良培养基,现配培养基与传统现配培养基相比,细胞浓度可提高16.7%-22.2%;而本发明培养基储存一个月后用于细胞培养,与传统培养基相比,细胞浓度可提高53.8%-58.3%;本发明的改良培养基,无论是现配培养基还是储存一个月的培养基,均有利于雨生红球藻绿色细胞营养生长。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点,并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰,都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基的配制方法,其特征在于,配制方法为:先分别配制A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液,A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别保存;使用时,依次将A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液溶于溶剂中,调节pH后即可接种雨生红球藻的藻种。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的配制方法具体包括以下步骤:
(1)配制A溶液母液:称取20g硝酸钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取2g磷酸氢二钾溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取10g七水合硫酸镁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的硝酸钾溶液、磷酸氢二钾溶液和七水合硫酸镁溶液混合均匀,用溶剂定容至1L配成A液母液,使硝酸钾浓度为20g/L,磷酸氢二钾浓度为2g/L,七水合硫酸镁浓度为10g/L;
(2)配制B溶液母液:称取4.05g无水氯化钙溶于少量溶剂中使之完全溶解,用溶剂定容至1L配成B液母液,使氯化钙浓度为4.05g/L;
(3)配制C溶液母液:称取198mg乙二胺四乙酸二钠溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取244mg六水合三氯化铁溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的乙二胺四乙酸二钠溶液和六水合三氯化铁溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成C溶液母液,使乙二胺四乙酸二钠浓度为198mg/L,六水合三氯化铁为244mg/L;
(4)配制D溶液母液:称取41mg氯化锌溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取610mg硼酸溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取51mg六水合氯化钴溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取60mg五水合硫酸铜溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取41mg六水合氯化锰溶于少量溶剂中使之完全溶解;称取380mg四水合钼酸铵溶于少量溶剂中使之完全溶解;将溶解的氯化锌溶液、硼酸溶液、六水合氯化钴溶液、五水合硫酸铜溶液、六水合氯化锰溶液和四水合钼酸铵溶液混合在一起,用溶剂定容至1L配成D溶液母液,使氯化锌浓度为41mg/L,硼酸浓度为610mg/L,六水合氯化钴浓度为51mg/L,五水合硫酸铜浓度为60mg/L,六水合氯化锰浓度为41mg/L,四水合钼酸铵浓度为380mg/L;
(5)使用时,取10mL A溶液母液、10mL B溶液母液、100μL C溶液母液和100μL D溶液母液,依次溶于970mL溶剂,最后用溶剂定容至1L;使A液硝酸钾浓度为200mg/L、磷酸氢二钾浓度为20mg/L、七水合硫酸镁浓度为100mg/L,B液无水氯化钙浓度为40.5mg/L,C液乙二胺四乙酸二钠浓度为19.8μg/L、六水合三氯化铁浓度为24.4μg/L,D液氯化锌浓度为4.1μg/L、硼酸浓度为61μg/L、六水合氯化钴浓度为5.1μg/L、五水合硫酸铜浓度为6.0μg/L、六水合氯化锰浓度为4.1μg/L、四水合钼酸铵浓度为38μg/L;用pH计调节pH为6.9-7.1,然后用于接种所需培养的雨生红球藻藻种。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的A溶液母液、B溶液母液、C溶液母液和D溶液母液分别于4℃、避光条件下保存。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述的溶剂为经过120℃高温高压100kpa灭菌20分钟的自来水,冷却至室温后用于配制培养基。
5.一种按照权利要求1-4任一项所述的配制方法配制而成的改良培养基。
6.根据权利要求5所述的改良培养基,其特征在于,所述的改良培养基用于雨生红球藻绿色细胞营养生长阶段。
7.根据权利要求5所述的改良培养基,其特征在于,所述的改良培养基用于雨生红球藻712株品系或雨生红球藻797株品系的规模化培养。
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