CN107384832B - 一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法 - Google Patents

一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法，包括以下步骤：1、收集畜禽养殖废弃物并进行固液分离，获得畜禽养殖废弃物分离液；2、测定畜禽养殖废弃物分离液中的总氮和总磷含量；3、稀释畜禽养殖废弃物分离液；4、驯化培养固氮蓝藻并收集藻种；5、配置简易型固氮蓝藻培养基JYM；6、按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与JYM培养基体积比1:1.5‑9:1的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基配置；7、将驯化后固氮蓝藻以OD680=0.1‑0.3接种入低成本固氮蓝藻培养基中进行自然培养。本发明所述方法简便易行，成本低廉，合理利用了畜禽养殖业废弃物，实现了固氮蓝藻的低成本培养。

Description

一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及微藻生物质的培养，更具体涉及一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法。
背景技术
固氮蓝藻属于蓝藻门(Cyanophyta)，是藻类植物中最原始的一类。它能够通过分化的异形胞固定空气中的分子态氮成为作物能够利用的氮素化合物。自1889年德国的Frank发现某些藻类具有固氮的生物学特性后，人们开始自觉地去认识、利用固氮蓝藻为农业生产服务。到20世纪90年代为止，世界各地已报道发现有33属150多种藻类具有固氮能力，所报道的固氮蓝藻多数属于念珠藻属和鱼腥藻属。
我国用全球8％的耕地，生产了全球21％的粮食，但同时化肥消耗量占全球35％。我国农作物亩均化肥用量21.9公斤，远高于世界平均水平(每亩8公斤)，是美国的2.6倍，欧盟的2.5倍。随着化肥用量的逐步增加，土壤板结、土壤酸化等一系列的问题导致了我国耕地的逐步退化。固氮蓝藻所具有的固氮特性和自身的生活特性使其在农业作物的栽培方面具有广阔的应用空间。利用固氮蓝藻作为农作物肥源，不仅可以为农作物提供氮素从而减少氮肥的使用，还能增加土壤的有机质改良土壤，同时还可以提供活性物质，促进作物生长。因此，利用固氮蓝藻作为肥源有助于解决化学肥料过量施用进而造成土壤板结、土壤酸化、污染水体这一系列的生态环境问题。
尽管固氮蓝藻在农业生产中具有广阔的前景，但其大规模培养却面临着成本的挑战，因为固氮蓝藻的培养过程需要消耗较多的化学试剂。我国是畜禽养殖大国，肉类总产量居世界第一位，全球肉类1/3产自中国，而畜禽养殖业产生的大量废弃物无法得到深度利用进而无序排放，造成了严重的环境污染问题。因此合理利用畜禽养殖业废弃物规模化培养固氮蓝藻将对农业面源污染治理产生积极的作用。
发明内容
为了解决现有技术中存在的难题，本发明的目的是在于提供一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法，方法易行，成本低廉，操作简便，合理利用了畜禽养殖业废弃物，实现了固氮蓝藻的低成本培养。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其步骤是：
1.畜禽养殖废弃物收集与预处理：从养殖场收集畜禽养殖废弃物，将固体粪便与液体粪污混合并进行固液分离，获得畜禽养殖废弃物分离液；
2.畜禽养殖废弃物分离液营养参数测定：测定畜禽养殖废弃物分离液中的总氮和总磷含量，获得总氮含量C1mg/L和总磷含量C2mg/L；
3.畜禽养殖废弃物分离液稀释：分别以总氮含量C1和总磷含量C2计算畜禽养殖废弃物分离液稀释比例，计算公式如下：
基于总氮的畜禽养殖废弃物分离液稀释倍数：
Figure BDA0001391068670000021
基于总磷的畜禽养殖废弃物分离液稀释倍数：
Figure BDA0001391068670000022
比较D1与D2的大小，如果D1>D2，则按照D2的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，反之则按照D1的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，获得畜禽养殖废弃物分离稀释液；
4.固氮蓝藻驯化培养与藻种收集：将固氮蓝藻用液体BG11培养基通气培养至对数生长期，自然沉降去除上清后获得藻浆，将畜禽养殖废弃物分离稀释液再次稀释100倍，并加入藻浆中，使藻液的体积与去除上清液之前一致，通气培养36至48小时后自然沉降去除上清液获得驯化藻浆；
5.简易型固氮蓝藻培养基JYM配置：以钙镁磷肥为基础，添加微量元素配置成简易型低成本固氮蓝藻培养基，其配方为：市售钙镁磷肥1.12g·L-1、1.43mg·L-1硼酸(H3BO3)、0.93mg·L-1四水氯化锰(MnCl2·4H2O)、0.195mg·L-1二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.11mg·L-1七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、0.04mg·L-1五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg·L-1六水硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)；
6.低成本固氮蓝藻培养基配置：将步骤3所述的畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照体积比为1:1.5～9:1的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基；
7.驯化后固氮蓝藻的接种与培养：驯化后的固氮蓝藻藻浆以OD680＝0.1～0.3接种入低成本固氮蓝藻培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16至24小时进行一次搅拌；
所述的固氮蓝藻为蓝藻门念珠藻属(Nostoc)、单歧藻属(Tolypothrix)或鱼腥藻属(Anabaena)中的任意一种。
优选的，选取鱼腥藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为1:1.5的比例进行混合。
优选的，选取单歧藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为1:1的比例进行混合。
优选的，选取念珠藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为9:1的比例进行混合。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1.使用该发明大规模的培养固氮蓝藻能够实现畜禽养殖废弃物的深度高效利用。
2.以低成本固氮蓝藻培养基培养固氮蓝藻大大降低了固氮蓝藻的培养成本，使其能够在农业生产中得到的更为广泛的应用。
附图说明
图1FACHB-119在不同培养基下的生长曲线。
图2FACHB-176在不同培养基下的生长曲线。
图3FACHB-179在不同培养基下的生长曲线。
图4FACHB-129在不同培养基下的生长曲线。
图5FACHB-148在不同培养基下的生长曲线。
具体实施方式
实施例1：
以鱼腥藻为例说明低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其步骤是：
1.畜禽养殖废弃物收集与预处理：从湖北省随州市某养猪场收集养殖废弃物，将固体粪便与液体粪污混合，采用板框式压滤机进行固液分离，获得猪粪分离液，剩余的固体废弃物可进行肥料化资源利用。
2.猪粪分离液营养参数测定：参照国家环境保护标准HJ 636-2012和HJ 671-2013的方法对猪粪分离液进行总氮和总磷含量的测定，获得总氮含量C1＝2107.40mg/L和总磷含量C2＝195.24mg/L。
3.猪粪分离液稀释：分别以总氮含量C1和总磷含量C2计算畜禽养殖废弃物分离液稀释比例，计算公式如下：
基于总氮的猪粪分离液稀释倍数：
Figure BDA0001391068670000041
基于总磷的猪粪分离液稀释倍数：
Figure BDA0001391068670000042
比较D1与D2的大小，如果D1>D2，则按照D2的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，反之则按照D1的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，获得畜禽养殖废弃物分离稀释液。因为D2>D1，因此将猪粪分离液稀释8.5倍，获得猪粪分离稀释液。
4.固氮蓝藻驯化培养与藻种收集：将固氮鱼腥藻FACHB-119(Anabaena azotica)、鱼腥藻FACHB-176(Anabaena sp.1058)和鱼腥藻FACHB-179(Anabaena sp.1105)用液体BG11培养基在10L血清瓶中通气培养至对数生长期，自然沉降去除大部分上清后获得藻浆；将猪粪分离稀释液再次稀释100倍，并加入藻浆中，使藻液的体积与去除上清液之前一致，通气培养36～48小时后自然沉降12小时，去除大部分上清液获得驯化FACHB-119、FACHB-176和FACHB-179藻浆。
所述藻种均取自中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae CultureCollection at the Institute of Hydrobiology,FACHB-collection)。
所述的培养条件具体为：温度分别为白天28-30℃、夜间20-25℃，光暗周期为12/12小时，光照强度为70-100μmol·m-2·s-1。
所述的通气培养是以空气泵将气体泵入液体培养基中，气体通入培养液之前以Millipore Millex-GP过滤器对空气进行过滤，通气量为9·L·h-1。
所述的BG11培养基配方为：1500mg·L-1硝酸钠(NaNO3)、75mg·L-1七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)、40mg·L-1三水磷酸氢二钾(K2HPO3·3H2O)、36mg·L-1二水氯化钙(CaCl2·2H2O)、20mg·L-1碳酸钠(Na2CO3)、6mg·L-1柠檬酸(C6H8O7)、6mg·L-1柠檬酸铁铵(C6H10FeNO8)、1mg·L-1乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、2.86mg·L-1硼酸(H3BO3)、1.86mg·L-1四水氯化锰(MnCl2·4H2O)、0.39mg·L-1二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.22mg·L-1七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、0.08mg·L-1五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.05mg·L-1六水硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)。
5.简易型固氮蓝藻培养基JYM配置：以钙镁磷肥为基础，添加微量元素配置成简易型低成本固氮蓝藻培养基，其配方为：市售钙镁磷肥1.12g·L-1、1.43mg·L-1硼酸(H3BO3)、0.93mg·L-1四水氯化锰(MnCl2·4H2O)、0.195mg·L-1二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.11mg·L-1七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、0.04mg·L-1五水硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg·L-1六水硝酸钴(Co(NO3)2·6H2O)。
6.按照下述方法配制不同的固氮蓝藻培养基：
(1)将猪粪分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照体积比为1:1.5的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基；
(2)直接采用猪粪分离稀释液；
(3)直接采用BG11培养基。
7.驯化后FACHB-119、FACHB-176和FACHB-179藻浆的接种与培养：驯化后的FACHB-119、FACHB-176和FACHB-179藻浆按照OD680＝0.3分别接种入步骤6所述的不同培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16～24小时进行一次搅拌，使固氮蓝藻不会因自然沉降而影响生长。培养过程中每隔2天测量一次叶绿素a浓度以绘制其在不同培养条件下的生长曲线。
从图1中可以看出，对于固氮鱼腥藻FACHB-119来说，采用低成本固氮蓝藻培养基所获得的藻类生物量与使用BG11培养基所获得的生物量并无显著性的差异。而采用猪粪分离稀释液所获得的藻类生物量远低于上述两种培养基。而对于鱼腥藻FACHB-176来说，三种培养基所获得的藻类生物量差异并不显著(图2)。对于鱼腥藻FACHB-179来说，采用低成本固氮蓝藻培养基所获得的藻类生物量远高于BG11培养基和猪粪分离稀释液(图3)。综上所述，对于固氮鱼腥藻来说，采用畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照1:1.5的比例混合配置而成的低成本固氮蓝藻培养基能够在相同的培养条件下获得与传统BG11培养基相当或更高的藻类生物量，同时能够显著降低微藻培养的成本。
实施例2：
以小单歧藻为例说明低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其步骤是：
1.畜禽养殖废弃物收集和测量与实施例1相同。
2.根据测量结果，将猪粪分离液稀释50倍备用。
3.固氮蓝藻驯化培养与藻种收集：将小单歧藻FACHB-129(Tolypothrix tenuis)用液体BG11培养基在10L血清瓶中通气培养至对数生长期，自然沉降去除大部分上清后获得藻浆。将猪粪分离稀释液再次稀释100倍，并加入藻浆中，使藻液的体积与去除上清之前一致，通气培养36～48小时后自然沉降12小时，去除大部分上清获得驯化FACHB-129藻浆。
所述藻种取自中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collectionat the Institute of Hydrobiology,FACHB-collection)。
所述的培养条件具体为：温度分别为白天28-30℃、夜间20-25℃，光暗周期为12/12小时，光照强度为70-100μmol m-2s-1。
所述的通气培养条件与实施例1相同。
所述的BG11培养基配方与实施例1相同。
4.简易型固氮蓝藻培养基JYM配置与实施例1相同。
5.按照下述方法配制不同的固氮蓝藻培养基：
(1)低成本固氮蓝藻培养基配置：将猪粪分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照体积比为1:1的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基；
(2)直接采用猪粪分离稀释液；
(3)直接采用BG11培养基。
6.驯化后FACHB-129藻浆的接种与培养：驯化后的FACHB-129藻浆按照OD680＝0.1分别接种入步骤5所述的不同培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16～24小时进行一次搅拌，使固氮蓝藻不会因自然沉降而影响生长。培养过程中每隔2天测量一次叶绿素a浓度以绘制其在不同培养条件下的生长曲线。
从图4中可以看出，对于小单歧藻FACHB-129来说，采用畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照1:1的比例混合配置而成的低成本固氮蓝藻培养基能够在相同的培养条件下获得仅比传统BG11培养基低10％左右的藻类生物量，但却能够显著降低微藻培养的成本。
实施例3：
以念珠藻为例说明低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其步骤是：
1.畜禽养殖废弃物收集和测量与实施例1相同。
2.根据测量结果，将猪粪分离液稀释50倍备用。
3.固氮蓝藻驯化培养与藻种收集：将念珠藻FACHB-148(Nostoc sp.)用液体BG11培养基在10L血清瓶中通气培养至对数生长期，自然沉降去除大部分上清后获得藻浆。将猪粪分离稀释液再次稀释100倍，并加入藻浆中，使藻液的体积与去除上清之前一致，通气培养36～48小时后自然沉降12小时，去除大部分上清获得驯化FACHB-148藻浆。
所述藻种取自中国科学院淡水藻种库(Freshwater Algae Culture Collectionat the Institute of Hydrobiology,FACHB-collection)。
所述的培养条件具体为：温度分别为白天28-30℃、夜间20-25℃，光暗周期为12/12小时，光照强度为70-100μmol m-2s-1。
所述的通气培养条件与实施例1相同。
所述的BG11培养基配方与实施例1相同。
4.简易型固氮蓝藻培养基JYM配置与实施例1相同。
5.按照下述方法配制不同的固氮蓝藻培养基：
(1)低成本固氮蓝藻培养基配置：将猪粪分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照体积比为9:1的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基；
(2)直接采用猪粪分离稀释液；
(3)直接采用BG11培养基。
6.驯化后FACHB-148藻浆的接种与培养：驯化后的FACHB-148藻浆按照OD680＝0.1分别接种入步骤5所述的不同培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16～24小时进行一次搅拌，使固氮蓝藻不会因自然沉降而影响生长。培养过程中每隔2天测量一次叶绿素a浓度以绘制其在不同培养条件下的生长曲线。
从图5中可以看出，对于念珠藻FACHB-148来说，采用畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照9:1的比例混合配置而成的低成本固氮蓝藻培养基能够在相同的培养条件下获得比传统BG11培养基低17％的藻类生物量，但却能够显著降低微藻培养的成本。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明，本发明所述的低成本大量培养固氮蓝藻的方法还可适用于蓝藻门念珠藻属(Nostoc)、单歧藻属(Tolypothrix)或鱼腥藻属(Anabaena)中的任意一种。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (4)

1.一种低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其步骤是：
1)畜禽养殖废弃物收集与预处理：从养殖场收集畜禽养殖废弃物，将固体粪便与液体粪污混合并进行固液分离，获得畜禽养殖废弃物分离液；
2)畜禽养殖废弃物分离液营养参数测定：测定畜禽养殖废弃物分离液中的总氮和总磷含量，获得总氮含量C1mg/L和总磷含量C2mg/L；
3)畜禽养殖废弃物分离液稀释：分别以总氮含量C1和总磷含量C2计算畜禽养殖废弃物分离液稀释比例，计算公式如下：
基于总氮的畜禽养殖废弃物分离液稀释倍数：
Figure FDA0001391068660000011
基于总磷的畜禽养殖废弃物分离液稀释倍数：
Figure FDA0001391068660000012
比较D1与D2的大小，如果D1>D2，则按照D2的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，反之则按照D1的数值对畜禽养殖废弃物分离液进行稀释，获得畜禽养殖废弃物分离稀释液；
4)固氮蓝藻驯化培养与藻种收集：将固氮蓝藻用液体BG11培养基通气培养至对数生长期，自然沉降去除上清后获得藻浆，将畜禽养殖废弃物分离稀释液再次稀释100倍，并加入藻浆中，使藻液的体积与去除上清液之前一致，通气培养36-48小时后自然沉降去除上清液获得驯化藻浆；
5)简易型固氮蓝藻培养基JYM配置：以钙镁磷肥为基础，添加微量元素配置成简易型低成本固氮蓝藻培养基，其配方为：市售钙镁磷肥1.12g·L-1、1.43mg·L-1硼酸、0.93mg·L-1四水氯化锰、0.195mg·L-1二水钼酸钠、0.11mg·L-1七水硫酸锌、0.04mg·L-1五水硫酸铜、0.025mg·L-1六水硝酸钴；
6)低成本固氮蓝藻培养基配置：将步骤3)所述的畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM按照体积比为1:1.5～9:1的比例进行混合，配置成低成本固氮蓝藻培养基；
7)驯化后固氮蓝藻的接种与培养：驯化后的固氮蓝藻藻浆以OD680＝0.1～0.3接种入低成本固氮蓝藻培养基中进行自然培养，即采用自然光照进行开放式培养，培养过程中每隔16至24小时进行一次搅拌；
所述的固氮蓝藻为蓝藻门念珠藻属、单歧藻属或鱼腥藻属中的任意一种。
2.根据权利要求1所述的低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其特征在于，选取鱼腥藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为1:1.5的比例进行混合。
3.根据权利要求1所述的低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其特征在于，选取单歧藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为1:1的比例进行混合。
4.根据权利要求1所述的低成本大量培养固氮蓝藻的方法，其特征在于，选取念珠藻属中的任意一种进行培养时，步骤6)所述的低成本固氮蓝藻培养基按照畜禽养殖废弃物分离稀释液与简易型固氮蓝藻培养基JYM体积比为9:1的比例进行混合。
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