CN106479898A - 一种雨生红球藻的培养基及其应用 - Google Patents

一种雨生红球藻的培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种适合于规模化快速培养雨生红球藻的培养基，每升培养基中含有：NaNO3 600‑1000mg、KH2PO4 120‑160mg、Na2HPO4·12H2O 120‑160mg、MgSO4·7H2O 70‑100mg、Ca(NO3)2·4H2O 20‑55mg、C6H8O7·H2O 5‑15mg、NaHCO3 150‑220mg、FeCl3·6H2O 2‑6mg、EDTA‑Na2 3‑8mg、微量元素溶液1‑2ml；其中，每升微量元素溶液含有：H3BO3 1.0‑2.0mg、MnCl2·4H2O 1.0‑1.5mg、ZnSO4·7H2O 0.1‑0.4mg、CuSO4·5H2O 0.01‑0.15mg、Co(NO3)2.6H2O 0.01‑0.15mg、(NH4)6MO7O24·4H2O 0.2‑0.6mg。该培养基可大大缩短雨生红球藻培养周期，显著提高细胞密度，同时该培养基可提高雨生红球藻细胞抗高光胁迫、抗病虫害污染能力，非常适合于大规模的雨生红球藻培养。

Description

一种雨生红球藻的培养基及其应用
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种雨生红球藻培养基及其应用。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis Flotow)是生活在淡水中的单细胞绿藻，隶属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，红球藻科，红球藻属。研究表明，雨生红球藻细胞在胁迫条件下可大量合成并积累天然虾青素，最高可达细胞干重的3％左右，被认为是天然虾青素的“浓缩品”和生产天然虾青素最好的生物资源。目前虾青素在国际市场的价格为每千克约2500美元，全球每年约有1亿美元以上的市场容量。因此，利用雨生红球藻规模化培养生产天然虾青素的研究已成为近年来国内外微藻开发领域的热点。
然而，雨生红球藻的生理特点较为特殊。一般情况下，雨生红球藻的生长周期中存在绿色游动细胞生长期和静止孢子期两个阶段，其中虾青素的合成和积累主要在静止孢子期。因而，目前雨生红球藻多采用两步培养法：首先通过三角瓶、管状光生物反应器、平板式光生物反应器、中试反应池和规模化跑道池或管道式光生物反应器等逐级放大培养，进行雨生红球藻的绿色阶段培养，获得其最大生物量；其次是红色孢子诱导阶段，将培养的雨生红球藻绿色细胞进行高光低氮等胁迫，诱导绿色细胞向静止孢子期转化，并逐渐合成和积累虾青素而转化为红色不动孢子。在这种培养模式下，雨生红球藻细胞生长过程缓慢，且容易被其他生物污染而导致培养失败，尤其在绿色游动细胞培养阶段。因而，如何提高雨生红球藻的生长速率，缩短接种后绿色游动细胞生长停滞期，快速获得较大生物量的培养物，是利用雨生红球藻规模化培养生产虾青素的关键步骤。
雨生红球藻的生长受多种因素限制，其中培养基是决定其生长速率和生物量的一个非常关键的条件。迄今为止，针对规模化培养雨生红球藻的研究中涉及到的培养基种类较多，主要有CN104745479(一种雨生红球藻的培养方法)、CN105483016A(培养雨生红球藻的方法及应用)、CN 104862232A(一种适用于雨生红球藻营养生长的改良培养基及配制方法)、CN 105567625A(一种雨生红球藻的诱导培养基)、CN 103589643 B(一种雨生红球藻培养基)等。其中CN 103589643 B系发明人前期研究成果，虽然能有效提升雨生红球藻生长速率，但配方较为复杂，营养成分多达20余种，且含有成分复杂的有机磷，在规模化养殖中不仅增加了培养的难度和复杂性，且不利于环境保护；CN 105567625A主要应用于培养后期静止孢子的诱导阶段；而CN 104862232A公开的改良培养基虽配置方法简便，但其对细胞生长和增殖速率有限，培养10天后，细胞密度从1.0×106cells/ml增至约2.0×106cells/ml左右，即生物量仅提高1倍左右，难以满足规模化培养中对于快速获得较高生物量的要求；CN105483016A基于生活污水净化提出了利用灭菌处理后的生活污水作为雨生红球藻的培养基，该方法不适合于以获得保健品和医药原料的天然虾青素为目的的雨生红球藻培养，且生活污水成分复杂多变，质量难以控制；而CN104745479采用两步法培养，但两个阶段培养基中均需添加一定浓度的多种类抗生素以降低污染几率，这在规模化培养中，无疑会增加生产成本和环境风险。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种适合于大规模雨生红球藻培养的培养基，尤其在柱状光生物反应器、平板式光生物反应器、管道式光生物反应器等各类规模化培养装置中可提高雨生红球藻的生长速率，缩短培养周期，快速获得较高的生物量，提高培养效率。本发明中培养基配方简单，原料低价易得，且配制操作方便，非常适合于规模化生产，为利用雨生红球藻培养生产天然虾青素的生产活动提供一种更为经济可靠的培养基配方。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种适合于大规模快速培养雨生红球藻的培养基，每升培养基中含有下述营养物质：
进一步优选的，每升培养基中含有下述营养物质：
进一步优选的，所述微量元素溶液包括硼、锰、锌、铜、钴和钼六种微量元素。
进一步优选的，每升微量元素溶液含有：
进一步优选的，每升微量元素溶液含有：
相对于目前已有报道的雨生红球藻培养基，本发明的培养基优化了无机盐离子的组成，以NaNO3提供的氮源为主，以低含量的Ca(NO3)2·4H2O作为氮源的补充，更有利于促进藻细胞的生长，同时较低浓度的Ca2+也可有效避免传统规模化培养中反应器中易结垢的弊端；该配方避免了有机氮和磷的使用，降低了培养过程中微生物污染的风险，同时也减小了红球藻培养废水对环境造成的压力；此外，该培养基也通过调整磷酸盐的配比而提高其pH值缓冲能力，从而更有利于维持雨生红球藻的稳定生长。
本发明还得到了一种雨生红球藻的培养方法，将雨生红球藻于规模化培养装置中培养，培养过程中使用权利要求1所述培养基。
进一步优选的，所述规模化培养装置包括柱状光生物反应器、平板式光生物反应器、开放式跑道池光生物反应器、管道式光生物反应器等。
上述培养基在雨生红球藻大规模快速培养的应用时，为方便工厂化操作，将雨生红球藻的培养基各营养物质分别配制成一定比例的浓缩溶液作为贮备液，使用时按照比例稀释制成工作液即可。
本发明有益效果是：该培养基可促进红球藻细胞快速增殖，维持细胞持续稳定的增长并达到较高的细胞密度；培养周期短；同时接种后藻细胞快速进入分裂增殖期，也有利于提高其抵御高光胁迫、病虫微生物破坏等能力，提高产业化大规模培养的成功率。
附图说明
图1为实施例1中利用本发明培养基配方在250ml三角瓶培养体系中培养雨生红球藻的情况(与对照相比)；
图2为实施例2中利用本发明培养基配方在1L柱状光生物反应器培养体系中培养雨生红球藻的情况(与对照相比)；
图3为实施例3中利用本发明培养基配方在300L平板光生物反应器培养体系中培养雨生红球藻的情况(与对照相比)；
图4为实施例4中利用本发明培养基配方在2.5吨管道光生物反应器培养体系中培养雨生红球藻的情况(与对照相比)；
图5为试验1中利用本发明培养基配方在各种规格培养体系中所培养雨生红球藻细胞中虾青素积累的情况(与对照相比)。
具体实施方式
以下通过具体实验实例对本发明的具体实施方式进行详细说明。此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
实施例1：250ml三角瓶培养体系雨生红球藻的培养
1.1培养基各组分储备液的配制
培养基的配置：每升培养基中含有：①NaNO3 800mg、②KH2PO4 150mg、③Na2HPO4·12H2O 150mg、④MgSO4·7H2O 90mg、⑤Ca(NO3)2·4H2O 50mg、⑥C6H8O7·H2O 10mg、⑦NaHCO3200mg、⑧FeCl3·6H2O 3mg、⑨EDTA-Na2 5mg、⑩微量元素溶液1ml；其中，每升微量元素溶液含有：H3BO3 1.73mg、MnCl2·4H2O 1.11mg、ZnSO4·7H2O 0.25mg、CuSO4·5H2O 0.05mg、Co(NO3)2·6H2O 0.05mg、(NH4)6MO7O24·4H2O 0.4mg。
在小规模培养和保种过程中，为方便操作，节约时间，并保证不同培养批次之间的一致性，可将本发明中培养基各组分按照1:1000的比例进行浓缩，配制贮备液，4℃保存。
1.2培养基配制
在新鲜制备的900ml纯水中，依次加入上述①-⑩储备液各1ml，边加边充分搅拌，然后定容至1000ml，即得雨生红球藻培养液。121℃，灭菌30分钟，冷却至室温后使用。
1.3雨生红球藻的接种、培养和生长测定
将培养至对数生长期的雨生红球藻种按照1.0×104的起始密度接种于上述制备的培养基中，按照150ml/瓶的装液量分装于250ml无菌三角瓶中，置于25±1℃，光照强度为1500Lux、光：暗比为16:8的培养箱中静置培养，每隔12h摇动一次培养瓶，设置三个平行。每48小时在无菌操作台中摇匀后取样3ml，用鲁哥氏染色液固定后，于显微镜下计数。根据计数结果计算生物量和比生长速率。以绿藻培养中常用的BG11和SM培养基为对照组，结果见图1。
实施例2：1L柱状光生物反应器体系雨生红球藻的培养
1.1培养基配制
在9L新鲜制备的纯水中，依次加入实施例1中1.1所列的培养基储备液①-⑩各10ml，然后定容至10L，摇匀后，121℃，灭菌30分钟，冷却至室温后使用。
1.2雨生红球藻的接种、培养和生长测定
将培养至对数生长期的雨生红球藻种按照1.0×104个细胞/ml的起始密度接入上述培养基中，摇匀后按照800ml/管分装于容积为1L的柱状光生物反应器中，置于25±1℃，光照强度为2000Lux，光：暗周期为16:8的培养室中，以120ml/min的速率通入过滤空气。每48小时在无菌操作台中摇匀后取样3ml，用鲁哥氏染色液固定后，于显微镜下计数。根据计数结果计算生物量和比生长速率。以藻类培养中常用的BG11和SM培养基为对照组，结果见图2。
实施例3：300L平板式光生物反应器体系雨生红球藻的培养
1.1培养基配制
在300L平板式光生物反应器中盛入200L新鲜制备的纯水，按照实施例1的配方，依次称取①-⑩各组分并分别用10L新鲜制备的纯水充分溶解后，再依次加入反应器即可。
1.2雨生红球藻的接种、培养和生长测定
将培养至对数生长期的雨生红球藻种按照1.0×104个细胞/ml的起始密度接入上述反应器中，置于25±1℃，光照强度为2000Lux培养室中连续光照培养，以150ml/min的速率通入过滤空气。每48小时取样3ml，用鲁哥氏染色液固定后，于显微镜下计数。根据计数结果计算生物量和比生长速率。以绿藻培养中常用的BG11和SM培养基为对照组，结果见图3。
实施例4：2.5吨管道式光生物反应器体系雨生红球藻的培养
1.1培养基配制
在有效容积为2.5吨的中试规模管道式光生物反应器中预装入最终培养体积约80％的新鲜制备的纯水。按照实施例1培养基配方，依次称取①-⑩各组分，并分别用50L新鲜制备的纯水充分溶解，然后依次通过压力泵将各溶液加入到管道培养体系中，并保持管道内培养基循环4-6小时，以充分混合各营养组分。
1.2雨生红球藻的接种、培养和生长测定
将培养至对数生长期的雨生红球藻种按照1.0×104个细胞/ml的初始密度接入上述反应器中，在室外自然光照条件下培养(调节泵流速使管道培养物以0.4m/s的速度循环，通气速率50L/min)。每48小时取样，用鲁哥氏染色液固定后，于显微镜下计数。根据计数结果计算生物量和比生长速率。以绿藻培养中常用的BG11和SM培养基为对照组，结果见图4。
试验1：雨生红球藻中虾青素含量的比较试验
1.1不同培养基和培养体系培养雨生红球藻累积虾青素的诱导
为检验本发明培养基配方对雨生红球藻中虾青素积累量的影响，14天培养结束后，从实施例1-4各培养体系中每个实验组培养物中取300ml藻液，5000转/分钟离心8分钟，弃去上清液，收获藻细胞，再加入新鲜制备的无氮培养基，即本发明培养基配方中不添加①和⑤号组分，而添加终浓度为40mg/L的CaCl2·2H2O，同时置于4500-5000Lux光照强度下，诱导虾青素积累，显微镜下检查待全部实验组藻细胞中色素转变为红色后，停止诱导，离心收集藻细胞，纯水洗涤细胞表面3次，将最终收获得到的藻细胞冷冻干燥。
1.2虾青素的提取、分析和含量计算
精确称取500毫克5.1中冷冻干燥的藻细胞于搪瓷碾砵中，加入液氮预冻后，用2ml提取溶剂(V二氯甲烷：V甲醇＝2:1)和少量石英砂碾磨提取2分钟，5000转/分钟离心后，含色素的上清液转移至10ml棕色容量瓶中。重复该提取步骤2-3次，至藻体成白色为止，合并提取液并定容至10ml。采用722S型分光光度计和lcm光径的比色杯，分别测定480、645、663nm波长下色素提取液的光吸收值(OD值)。按公式计算虾青素含量：
虾青素量(％)＝[4.6×10-4×(OD480-0.638×OD645+0.114×OD663)×10ml]/500mg，结果见图5。图5对照1和对照2所选用的培养物分别选取实施例1-4中对照1和对照2中的藻液。
实施例5
一种雨生红球藻的培养基，每升培养基中含有下述营养物质：①NaNO3 600mg、②KH2PO4 120mg、③Na2HPO4·12H2O 120mg、④MgSO4·7H2O 70mg、⑤Ca(NO3)2·4H2O 20mg、⑥C6H8O7·H2O 5mg、⑦NaHCO3 150mg、⑧FeCl3·6H2O 2mg、⑨EDTA-Na2 3mg、⑩微量元素溶液1ml；其中，每升微量元素溶液含有：H3BO3 1.0mg、MnCl2·4H2O 1.0mg、ZnSO4·7H2O 0.1mg、CuSO4·5H2O 0.01mg、Co(NO3)2.6H2O 0.01mg、(NH4)6MO7O24·4H2O 0.2mg。
该配方与实施例1的配方相比，降低了各组分的含量。利用该培养基在管道式光生物反应器中，经14天培养结束后雨生红球藻生物量达到48.5×104个细胞/ml，略低于本发明中优选配方的最高生物量56.26×104个细胞/ml，高于对照组41.3×104和39.7×104个细胞/ml。
实施例6
一种雨生红球藻的培养基，每升培养基中含有下述营养物质：①NaNO3 1000mg、②KH2PO4 160mg、③Na2HPO4·12H2O 160mg、④MgSO4·7H2O 100mg、⑤Ca(NO3)2·4H2O 55mg、⑥C6H8O7·H2O 15mg、⑦NaHCO3 220mg、⑧FeCl3·6H2O 6mg、⑨EDTA-Na2 8mg、⑩微量元素溶液2ml；其中，每升微量元素溶液含有：H3BO3 2.0mg、MnCl2·4H2O 1.5mg、ZnSO4·7H2O 0.4mg、CuSO4·5H2O 0.15mg、Co(NO3)2.6H2O 0.15mg、(NH4)6MO7O24·4H2O 0.6mg。
该配方与实施例1的配方相比，提高了各组分的含量。利用该培养基在管道式光生物反应器中，经14天培养结束后雨生红球藻生物量平均达到58.7×104个细胞/ml。
本发明所给出的具体实施方式是为了进一步解释本发明，而不是限制本发明的范围。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (9)

1.一种雨生红球藻的培养基，其特征在于：每升培养基中含有下述营养物质：
2.如权利要求1所述雨生红球藻的培养基，其特征在于：每升培养基中含有下述营养物质：
3.如权利要求1或2所述的雨生红球藻的培养基，其特征在于，所述微量元素溶液包括硼、锰、锌、铜、钴和钼六种微量元素。
4.如权利要求3所述的雨生红球藻的培养基，其特征在于，每升微量元素溶液含有：
5.如权利要求4所述的雨生红球藻的培养基，其特征在于，每升微量元素溶液含有：
6.一种雨生红球藻的培养方法，其特征在于，将雨生红球藻于规模化培养装置中培养，培养过程中使用权利要求1所述培养基。
7.如权利要求6所述的雨生红球藻的培养方法，其特征在于，所述规模化培养装置包括柱状光生物反应器、平板式光生物反应器、管道式光生物反应器。
8.如权利要求1所述的培养基关于雨生红球藻大规模快速培养的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，将雨生红球藻的培养基各营养物质分别配制成一定比例的浓缩溶液作为贮备液，使用时按照比例稀释制成工作液即可。
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