CN108587920B - 一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，利用开放式或封闭式光生物反应器先进行微藻的光合自养培养，当藻液中的硝酸根浓度低于1.0 mg/L，向藻液中补加乙酸或乙酸钠，且不添加任何形式的氮源，进行兼性培养。本方法不需要进行无菌培养操作，适合于任意规模的开放式和封闭式培养系统，尤其解决了微藻大规模培养中使用有机碳进行兼性培养的技术难题，在常规的培养条件下添加乙酸/乙酸钠，既有效的避免了细菌大量繁殖，又显著提高了微藻的生物质和代谢产物的产量。

Description

一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，具体涉及一种在大规模培养系统中使用乙酸和乙酸钠兼性营养培养微藻以提高生物质和次生代谢产物产量的方法。
技术背景
微藻资源已经在人类食品、保健品、化妆品等领域中广泛应用。最新的研究表明，微藻有望在人类应对以化石能源过度消耗和二氧化碳过量排放引发的能源、环境危机中发挥重要作用(微藻生物柴油产业化技术中的若干科学问题及其分析.中国基础科学.2009.11(5):64-70)。通过大规模培养生产微藻生物质是微藻资源利用的重要环节，建立新的培养技术，提高微藻的生物质产量是微藻生物技术研发的重要内容。
微藻能够利用无机碳、自然光照和水进行光自养生长繁殖，也有一部分微藻能够在利用光和二氧化碳进行自养生长的同时，利用有机碳源(葡萄糖、蔗糖、甘油、乙酸等)进行异养生长，即兼性营养生长。在这种条件下，微藻细胞除了吸收水、无机碳、光能进行光合作用之外，还能够吸收有机碳源，利用储存在有机碳中的化学能，进行生长繁殖，这一过程的产物--有机碳氧化产生的二氧化碳，也可作为光合作用的底物加以利用(Handbook ofmicroalgal culture:Biotechnology and Applied Phycology.Blackwell Science Ltd,Oxford,UK.Vol.67.2004.02)。因此，相比于光合自养生长，兼性营养生长具有更高的生物质产量。
乙酸钠是一种廉价、易得的有机碳源形式。已公开的资料显示，乙酸钠可以用于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)、小球藻(Chlorella)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)(乙酸对两种杜氏藻生长和细胞生化组成的影响.海洋科学.2005.29(6):22-27)、聚球藻(聚球藻7942混养培养中碳代谢与能量利用.生物工程学报.2010.26(9):1239-1248)等微藻的培养，其中培养基中添加1.5g/L乙酸钠时，雨生红球藻H0的细胞密度是对照(不添加乙酸钠)的2倍以上(兼养对雨生红球藻细胞生长的促进作用及藻株差异性.海洋科学.2014.38(12):1-7)；而小球藻Chlorella sorokiniana在添加30mM乙酸钠的培养基中细胞密度达到3.0×107个/mL，而完全自养的细胞密度为2.3×107个/mL(不同营养方式下小球藻生长与光合作用的变化.广西科学.2016.23(2):115-119)。由此可见，向培养基中添加一定浓度的乙酸钠，进行兼性营养培养，能够提高微藻生物质产量。
然而上述报道均是在实验室内进行的研究性工作，利用有机碳源兼养培养微藻，需要满足无菌培养条件才能进行，否则有机物质的添加会引发异养细菌等敌害生物的严重污染(乙酸钠兼养下雨生红球藻生长特性分析.中国科学院大学.硕士学位论文.2014；醋酸盐兼养培养下蛋白小球藻油脂积累的研究.中国环境科学.2017.37(3):1111-1119；眼点微拟球藻和朱氏四爿藻的异养与兼养研究.中国海洋大学.博士学位论文.2015；葡萄糖对单针藻异养、兼养生长及油脂合成的影响.中国生物工程杂志.2015.35(11):46-51；反硝化细菌在污水脱氮中的作用.微生物学通报.2007,34(4):773-776)。
在室外进行微藻的规模化培养时，由于单个生物反应器的规模大，例如单个培养池一般从几平米到几百平米，甚至超过1000平米，无法达到无菌培养的要求。向培养基中添加乙酸或乙酸钠等有机碳源，藻液中的细菌会利用有机碳源和培养基中的无机氮源(NO3 -)进行快速生长繁殖，发生大规模的菌类污染。当藻液中发生细菌污染时，肉眼可见藻液的颜色发生明显变化：藻液由清亮变为浑浊，污染越严重，藻液越浑浊，通过过滤、沉淀等方法将藻细胞与培养基分开，培养基呈现乳白色。通过显微镜高倍镜(40倍物镜)和油镜(100倍物镜)观察，可以清楚地分辨正常培养和发生细菌污染的情况。微藻的光自养培养，培养基中不添加有机碳源，细菌不能大量繁殖，藻液中细菌很少，不经过浓缩，在显微镜下一般观察不到细菌。当藻液发生细菌感染时，显微镜观察可以看到培养基中密集分布的细菌，既有游离的单个细菌，也有大量细菌形成的菌片、菌团。所以，如果在不能满足无菌培养条件的情况下使用有机碳源进行微藻的兼养培养，会有两个严重后果：1、藻液中的菌类(主要是细菌)会爆发式增长，发生严重的菌类污染，轻则抑制微藻的生长繁殖，重则造成藻类细胞大量死亡，致使培养失败；2、对于以生产食品、保健品为目的的微藻培养，藻液中的菌类大量繁殖，就无法保证产品的品质。因此，目前还没有办法在大规模培养系统中使用有机碳进行兼性营养培养。
针对这一技术难题，本发明提供了一种乙酸/乙酸钠兼性营养大规模培养微藻的方法。该方法先进行微藻的光合自养培养，在培养基氮源耗尽之后，以流加的方式，少量多次地将乙酸或乙酸钠添加到藻液中，微藻能够利用有机碳源进行兼性营养生长，而细菌却不能大量繁殖。解决了非无菌条件下兼养培养微藻菌类污染的难题，显著提高了微藻的生物质和代谢产物的产量。这一技术在微藻生物技术领域具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，克服了现有技术中需要满足无菌培养条件才能进行有机碳源兼养培养微藻，且只适合于实验室内小规模培养的不足，本方法不需要进行无菌培养操作，适合于任意规模的开放式和封闭式培养系统，使在大规模培养系统中使用乙酸/乙酸钠进行兼养培养成为可能，显著提高了微藻的生物质和代谢产物的产量。
发明人在实验室培养油球藻(Graesiella sp.)和雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)，培养油球藻起始氮源(NaNO3)浓度0.1g/L，接种后藻液OD值约为OD540 0.1。培养红球藻起始氮源(KNO3)0.15g/L，藻液OD值约为OD5400.05。每天取藻液样品测定氮源(NO3 -)浓度，研究微藻培养过程中藻液氮源浓度的变化规律，发现培养开始后藻液中氮源浓度直线下降，油球藻培养48小时氮源基本被耗尽，红球藻培养96小时氮源基本被耗尽。
在掌握了微藻培养过程中藻液氮源浓度变化规律后，发明人研究了氮源消耗完的前后添加乙酸/乙酸钠，藻液中细菌数量的变化。油球藻同时进行光合自养培养和乙酸兼养培养，培养基氮源(NaNO3)浓度0.1g/L，乙酸兼养分两种方法，一种是培养开始就进行兼养，每天添加乙酸0.14ml/L，连续添加6天，第二种是等藻液的氮源消耗完(NO3 -浓度<1.0mg/L)再开始添加乙酸，每天添加乙酸0.14ml/L，连续添加6天。雨生红球藻同时进行光合自养培养和乙酸钠兼养培养，培养基氮源(KNO3)浓度0.15g/L，乙酸钠兼养分两种方法，一种是培养开始就进行兼养，每天添加乙酸钠0.33g/L，连续添加6天，第二种是等藻液的氮源消耗完(NO3 -浓度<1.0mg/L)再开始添加乙酸钠，每天添加0.33g/L，连续添加6天。培养结束后按照细菌菌落计数法测定藻液细菌数量，藻液细菌数量用每毫升藻液的CFU(菌落形成单位)表示。
结果表明，培养刚开始就加入乙酸/乙酸钠，藻液的细菌数量急剧上升，培养结束时，细菌的数量级是光合自养培养的微藻藻液的10万倍，藻液外观呈现乳白色。当培养基中氮源耗尽(NO3 -浓度<1.0mg/L)之后，将乙酸/乙酸钠添加到藻液中，细菌不能大量繁殖，培养结束后，细菌数量只比光合自养培养的微藻藻液稍有增加，藻液外观与光合自养培养的藻液没有明显差别。这一发现，为解决非无菌条件下兼养培养微藻发生菌类污染的难题提供了一种全新的技术方法。
本发明采用以下技术方案：
一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，具体如下：微藻在开放式或封闭式光生物反应器中先进行光合自养培养，当硝酸根浓度低于1.0mg/L，向藻液中补加乙酸或乙酸钠进行兼性培养，兼性培养阶段不添加任何形式的氮源(包括硝态氮(NO3 -)、铵态氮(NH4 +)和有机氮(尿素、氨基酸)等)。
所述的微藻指能够利用乙酸或乙酸钠为有机碳源进行完全异养生长或兼性营养生长的微藻种类，包括但不限于油球藻(Graesiella)、红球藻(Haematococcus)、小球藻(Chlorella)。
进一步地，乙酸或乙酸钠连续添加4-8天，或添加1-2天后间隔1-3天再添加。
进一步地，乙酸的添加量为每天0.14-0.28ml/L，或乙酸钠的添加量为每天0.33g/L-1.32g/L。
进一步地，乙酸的添加总量为0.84ml/L，或乙酸钠添加总量2.0g/L。
本发明等氮源消耗完再加入有机碳源进行兼养培养，解决了菌类污染的问题。每种微藻在使用相同的培养基和大致相同的条件下培养，培养基氮源的消耗速率基本相同，只要掌握了氮源浓度变化的规律，就不需要每次测定培养基氮源浓度。根据氮源浓度变化的规律，确定氮源消耗完的时间，就可以补加有机碳源开始进行兼性营养培养。
培养微藻生产次生代谢产物，分为二个阶段，培养前期，藻液中氮源(NO3 -)供应充足，微藻快速生长繁殖，细胞数量持续增加，这个阶段称为生长阶段；随着微藻的生长繁殖，藻液中的氮源消耗殆尽，藻细胞处于氮胁迫条件下，停止分裂，细胞数量不再增加，此时，微藻细胞仍在进行光合作用，生物质持续增加，并在细胞中合成、积累代谢产物。例如，产油微藻在细胞中合成并积累大量的中性脂，雨生红球藻在细胞内合成并积累大量的虾青素，这个阶段称为代谢产物的生产阶段(Two-stage characteristics of lipid production inbatch culture of two green microalgae.Fresenius EnvironmentalBulletin.2014.23(9A):2253-2258.；Production of astaxanthin from Haematococcusin open pond by two-stage growth one-step process.Aquaculture.2009.295(3):275-281)。在生产阶段向藻液中加入有机碳，微藻细胞一边进行光合作用，一边利用有机碳源进行异养生长，进入兼性营养培养模式。已有研究表明，乙酸或乙酸钠能够显著提高微藻生物质和代谢产物-虾青素的产量(见背景技术)。所以，本发明利用乙酸或乙酸钠为有机碳源进行微藻的兼养培养，达到提高生物质和代谢产物产量的目的。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、先按照常规方法进行微藻光合自养培养，等氮源消耗完再加入有机碳源，有效地解决了在非无菌条件下进行兼养培养菌类污染的问题。所以，本发明的乙酸/乙酸钠兼性营养培养微藻，打破了有机碳兼养培养微藻必需满足无菌培养条件的束缚，适合在大规模培养系统中使用；
2、生物质和高价值的次生代谢产物产率提高20％以上，具有显著的经济效益。
附图说明
图1为实施例1中油球藻培养过程中硝酸根(NO3 -)的浓度变化。
图2为实施例2中雨生红球藻培养过程中硝酸根(NO3 -)的浓度变化。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的方法及该方法所达到的效果作进一步详细说明。
实施例1：乙酸添加时机对兼养培养油球藻藻液中细菌数量的影响
为了实现利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻，同时又能控制藻液中细菌数量，不发生菌类污染的目的，发明人首先研究了微藻培养过程中藻液氮源浓度的变化规律。
油球藻Graesiella sp.是一种产油微藻，在氮胁迫条件下细胞内能够合成大量中性脂，在开放池中培养，总脂含量超过30％，是一株具有规模培养潜力的产油微藻(Effective cultivation of microalgae for biofuel production:a pilot-scaleevaluation of a novel oleaginous microalga Graesiellasp.WBG-1.(2016)9:123.DOI10.1186/s13068-016-0541-y)。
利用气升式光生物反应器培养油球藻Graesiella sp.，培养基成分及浓度：NaNO3100mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O75mg/L，CaCl2·2H2O36mg/L，Na2CO336mg/L，Fe-citrate6mg/L，Citric acid6mg/L，EDTA·Na25mg/L，微量元素母液1mL/L。微量元素母液成分及浓度：H3BO32.86g/L，MnCl2·4H2O1.8g/L，ZnSO4·7H2O0.22g/L，CuSO4·5H2O0.08g/L，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.1104g/L，Co(NO3)2·6H2O0.0494g/L。接种后藻液密度约OD5400.1，每个柱式反应器(Ф3cm×H 30cm)中放200ml藻液，每天14小时光照，10小时黑暗，光照期间连续通入二氧化碳与空气的混合气体(二氧化碳占气体总体积的1％左右)，黑暗期间连续通入空气。通气的作用是搅动藻液，并为微藻的光合作用提供碳源。每天下午4点取藻液样品测定氮源(NO3 -)浓度。每次取样后在柱式反应器(玻璃管)外壁标记藻液位置，下次取样前先加入蒸馏水使藻液液面恢复到标记的位置，以补充培养过程中蒸发的水分。
藻液氮源(NO3 -)浓度测定方法：取适量藻液，经过孔径0.22μm的膜过滤，上清液酸化处理后放入1cm比色杯，测定220nm、275nm处的光吸收值A220和A275。按照下述方程计算NO3 -浓度(mg/L)：
CN＝18.1556(A220-2×A275)-0.1299
培养过程中油球藻藻液中硝酸根(NO3 -)浓度的变化如图1所示。在掌握了微藻培养过程中藻液氮源浓度变化规律后，研究了氮源消耗完的前后添加乙酸对兼养培养油球藻藻液中细菌数量的影响。油球藻同时进行光合自养培养和乙酸兼养培养，培养基氮源(NaNO3)浓度0.1g/L，乙酸兼养分二种方法，一种是培养开始就进行兼养，每天添加乙酸0.14ml/L，连续添加6天，第二种是等藻液的氮源消耗完(NO3 -浓度<1.0mg/L)再开始添加乙酸，每天添加乙酸0.14ml/L，连续添加6天。光合自养培养和两种兼养培养，每种培养都设置3个重复。培养结束后按照细菌菌落计数法测定藻液细菌数量，藻液细菌数量用每毫升藻液的CFU(菌落形成单位)表示。
藻液细菌数量测定方法：藻液细菌数量用每毫升藻液的CFU(菌落形成单位)表示。用无菌生理盐水稀释待测藻液，制成10倍递增稀释液，取1ml稀释藻液涂布到无菌平板(LB培养基+1.8％琼脂)上，翻转平板，置于恒温培养箱中36±1℃培养。样品稀释和平板涂布在严格无菌条件下进行，每个稀释度做2个重复。培养48小时后，选择菌落数量适中(每个平板30-300个菌落)的平板进行菌落计数，根据稀释倍数计算每ml样品藻液中的CFU(菌落形成单位)。
氮源消耗完前后开始乙酸兼养，对油球藻藻液中细菌数量的影响如表1所示，细菌数量是3个重复培养的平均值。
表1不同培养方式下油球藻藻液中细菌数量比较
藻液细菌数量(cfu/mL)
光合自养 1.05×10<sup>4</sup>
培养开始就兼养 1.74×10<sup>9</sup>
氮源消耗完后兼养 3.50×10<sup>4</sup>
培养刚开始就加入乙酸/乙酸钠，藻液的细菌数量急剧上升，培养结束时，细菌数量是光合自养培养的微藻藻液细菌数量的10万倍以上，藻液外观呈现乳白色。当培养基中氮源耗尽(NO3 -浓度<1.0mg/L)之后，将乙酸添加到藻液中，细菌没有大量繁殖，培养结束后，细菌数量只比光合自养培养的微藻藻液增加2.33倍，藻液外观与光合自养培养的藻液没有明显差别。
实施例2：乙酸钠添加时机对兼养培养红球藻藻液细菌数量的影响
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞绿藻，其细胞内所含有的虾青素(Astaxanthin)是类胡萝卜素的一种，是目前发现的抗氧化活性最强的天然抗氧化剂(天然虾青素的超级抗氧化活性及其应用.中国海洋药物.2001,20(4):45-50；雨生红球藻及虾青素的生产.微藻生物技术.1999，中国轻工业出版社，北京，174-213)。规模培养红球藻生产天然虾青素是国际上新兴的微藻生物技术产业，虾青素被广泛应用于人类保健食品和珍贵水产动物养殖的饲料添加剂(大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状.中国海洋药物.2001,20(5):4-8；Haematococcus astaxanthin:applications for human health and nutrition.Trends in Biotechnology,2003.21(5):210-216；Industrial production of micralga cell-mass and secondaryproducts-species of high potential:Haematococcus,In Amos Richmond(Ed),Handbook of microalgalculture:Biotechnology and applied phycology,2004,Blackwell science Ltd a Blackwell publishing Company,Oxford)。
利用气升式光生物反应器培养雨生红球藻，培养基组分及含量如下：KNO3 150mg/L，K2HPO4·3H2O40mg/L，MgSO4·7H2O 75mg/L，CaCl2·2H2O36mg/L，柠檬酸6mg/L，柠檬酸铁6mg/L，EDTA·Na25mg/L，NaHCO3 40mg/L。H3BO32.86mg/L，MnCl2·4H2O 1.8mg/L，ZnSO4·7H2O0.22mg/L，CuSO4·5H2O 0.08mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.391mg/L，Co(NO3)2·6H2O 0.0494mg/L。其中硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、碳酸氢钠可直接称量药品并逐个加入并充分溶解，其余组份首先配制成浓缩液，再将浓缩液逐个加入培养基中。接种后藻液光密度OD540约为0.05，每个柱式反应器中放200ml藻液。培养方法、取样方法、藻液中硝酸根测定方法与实施例1相同。
培养过程中红球藻藻液中硝酸根NO3 -浓度的变化如图2所示。
在掌握了微藻培养过程中藻液氮源浓度变化规律后，研究了氮源消耗完的前后添加乙酸钠对兼养培养红球藻藻液中细菌数量的影响。
雨生红球藻同时进行光合自养培养和乙酸钠兼养培养，培养基氮源(KNO3)浓度0.15g/L，乙酸钠兼养分两种方法，一种是培养开始就进行兼养，每天添加乙酸钠0.33g/L，连续添加6天，第二种是等藻液的氮源消耗完(NO3 -浓度<1.0mg/L)再开始添加乙酸钠，每天添加0.33g/L，连续添加6天。光合自养培养和两种兼养培养，每种都设置3个重复培养。培养结束后按照细菌菌落计数法测定藻液细菌数量，藻液细菌数量用每毫升藻液的CFU(菌落形成单位)表示。
藻液细菌数量测定方法与实施例1相同。
氮源消耗完前后开始乙酸/乙酸钠兼养，对红球藻藻液中细菌数量的影响如表2所示，细菌数量是3个重复培养的平均值。
表2不同培养方式下红球藻藻液中细菌数量比较
藻液细菌数量(cfu/mL)
光合自养 1.34×10<sup>4</sup>
培养开始就兼养 6.69×10<sup>8</sup>
氮源消耗完后兼养 2.92×10<sup>4</sup>
培养刚开始就加入乙酸钠，藻液的细菌数量急剧上升，培养结束时，细菌数量是光合自养培养的藻液细菌数量的5万倍，藻液外观呈现乳白色。当培养基中氮源耗尽(NO3 -浓度<1.0mg/L)之后，将乙酸钠添加到藻液中，细菌没有大量繁殖，培养结束后，细菌数量只比光合自养培养的微藻藻液增加了1.18倍，藻液外观与光合自养培养的藻液没有明显差别。这一发现，为解决非无菌条件下兼养培养微藻发生菌类污染的难题提供了一种全新的技术方法。
实施例3：乙酸/乙酸钠兼性营养提高油球藻Graesiella sp.生物质和总脂产量
利用气升式光生物反应器培养油球藻Graesiella sp.，培养基成分及浓度，培养方法与实施例1相同。每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中是否有菌类(主要是细菌)污染发生，下午4点的藻液还要测定氮源(NO3 -)浓度。每次取样后在柱式反应器(玻璃管)外壁标记藻液位置，下次取样前先加入蒸馏水使藻液液面恢复到标记的位置，以补充培养过程中蒸发的水分。
等藻液中的氮源基本消耗完，NO3 -浓度低于1.0mg/L，即可向藻液中加入乙酸或乙酸钠进行兼养培养，以不加有机碳源为对照，对照和处理都设置3平行培养。有机碳添加方法如表3所示。乙酸钠的每天添加量均可一次加入藻液中。乙酸每天添加0.14ml/L，可以一次加入藻液；每天添加0.28ml/L，需要分2次加入藻液，避免藻液pH降低幅度太大，超出适宜的pH范围。
表3乙酸、乙酸钠兼养培养油球藻的添加方法
Figure BDA0001737943510000081
Figure BDA0001737943510000091
注：乙酸添加总量0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠添加总量2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等。
培养结束前，先取样测定藻液中生物质干重(g/L)，然后离心采收油球藻，冷冻真空干燥，测定总脂含量。根据生物质干重、总脂含量和培养时间计算生物质和总脂日平均产量。
藻液氮源(NO3 -)浓度测定方法与实施例1相同。
生物质干重测定方法：孔径0.45μm的玻璃纤维滤膜，烘干至恒重，重量记为M1(g)；取10ml藻液，真空抽滤，藻细胞留在滤膜上，将附着藻细胞的滤膜再次烘干至恒重，重量记为M2(g)；生物质干重DW(g/L)按照下述公式计算：
Figure BDA0001737943510000092
生物质日平均产量Pmass(g/L·d)计算公式:
Pmass＝DW/t
式中DW是生物质干重(g/L)，t是培养时间(天)。
总脂含量测定方法：称取约50mg冷冻干燥的藻粉于研钵中，加适量石英砂研磨破壁后转移入5mL带盖离心管；加入4mL乙酸乙酯/正己烷的混合溶剂(1/1，v/v)，超声波10min，50℃提取30分钟，之后10000rpm离心5分钟，收集上清液至50mL离心管中，重复提取一到两次，合并上清；向上述获得的含有油脂的有机溶剂中加入等体积的纯水，振荡混匀后2000rpm离心1分钟加速分层，收集上层有机相至已烘干并称量净重(m1,g)的玻璃试管中；氮气吹干溶剂，50℃干燥1h后再次称量试管(m2,g)；通过重量法计算总脂含量。
总脂含量Clipid(％dw)计算公式：
Figure BDA0001737943510000093
Clipid为总脂百分含量，m为藻粉重量(g)
总脂日平均产量Plipid(g/L·d)计算公式：
Plipid＝Pmass×Clipid
经过2天培养(接种后48小时)，藻液中NO3 -浓度低于1.0mg/L。第3天开始补加有机碳源，连续补加6天，达到有机碳补加总量。从接种到培养结束共8天时间，油球藻生物质日平均产量、总脂含量和日平均产量如表4所示。
表4乙酸、乙酸钠兼性营养培养对油球藻生物质和总脂产量的影响
Figure BDA0001737943510000101
注：乙酸添加总量0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠添加总量2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等。
添加乙酸钠和乙酸都显著提高了油球藻生物质和总脂的日平均产量。与光合自养培养相比，添加2.0g/L乙酸钠的生物质日平均产量增加了18.1％，总脂日平均产量增加了27.85％。当乙酸钠添加量进一步增加，生物质和总脂产率虽然都呈现升高的趋势，但是升高的幅度明显减小。添加0.84ml/L乙酸的生物质日平均产量比对照增加了20.17％，总脂日平均产量提高了32.65％。乙酸添加量增加到1.68ml/L，虽然生物质日平均产量和总脂日平均产量都有所增加，但是增加的幅度很小。所以，乙酸钠的最优添加量是2.0g/L，乙酸的最优添加量是0.84ml/L。
添加乙酸0.84ml/L和1.68ml/L的生物质日平均产量、总脂含量与添加乙酸钠2.0g/L和4.0g/L的生物质日平均产量、总脂含量很接近。乙酸0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等，说明等摩尔的乙酸和乙酸钠对油球藻生物质和总脂的影响相同。
培养过程中每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况。从接种到培养结束，油球藻细胞形态都正常。培养前期，油球藻细胞快速分裂，细胞数量大幅度上升；氮源消耗完以后，细胞停止分裂，细胞数量不再增加，但是，细胞体积在增大，而且在细胞内部也发生一些明显的变化：蛋白核逐渐变得不可见，细胞逐渐被颗粒物充满。乙酸、乙酸钠兼养的细胞形态变化过程与对照一样，但是变化进展比对照快一些。仔细观察藻液颜色，乙酸或乙酸钠兼养培养与对照一样，藻液是鲜艳的绿色，没有呈现丝毫浑浊。用显微镜40倍物镜和100倍物镜(油镜)观察，藻液中几乎观察不到细菌，更没有出现大量细菌结成的菌片、菌团，表明没有发生菌类的污染。
实施例4：乙酸/乙酸钠兼性营养提高雨生红球藻生物质和虾青素的产量
利用气升式光生物反应器培养雨生红球藻，培养基组分及含量，培养方法与实施例2相同。每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况，下午4点的藻液还要测定氮源(NO3 -)浓度。每次取样后在柱式反应器(玻璃管)外壁标记藻液位置，下次取样前先加入蒸馏水使藻液液面恢复到标记的位置，以补充培养过程中蒸发的水分。
等藻液中的氮源基本消耗完，NO3 -浓度低于1.0mg/L，即可向藻液中加入乙酸或乙酸钠进行兼养培养，以不加有机碳源为对照，对照和处理都设置3个平行培养。有机碳添加方法如表5所示。乙酸每天添加0.14ml/L，可以一次加入藻液；每天添加0.28ml/L，需要分2次加入藻液，避免藻液pH降低幅度太大，超出适宜的pH范围。
表5乙酸、乙酸钠兼养培养红球藻的添加方法
Figure BDA0001737943510000111
注：乙酸添加总量0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠添加总量2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等。
培养结束前，先取样测定藻液中生物质干重(g/L)，然后离心采收红球藻，冷冻真空干燥，测定虾青素含量。根据生物质干重、虾青素含量和培养时间计算生物质和虾青素的日平均产量。
藻液氮源(NO3 -)浓度测定方法与实施例1相同。
红球藻生物质干重DW测定方法、生物质日平均产量Pmass(mg/L·d)计算公式与实施例3相同。
虾青素提取和含量测定方法：称取约10mg雨生红球藻干粉于带盖离心管中，加入二甲亚砜5mL，充分振荡使藻粉在溶剂中分散均匀，然后置70℃水浴中保温10min，保温期间振荡离心管1～2次，使藻粉与溶剂混合均匀；10000rpm离心5min，收集上清液；重复提取1-2次，合并上清并定容至25ml，取定容后的溶液1ml于10ml容量瓶中，再定容至10ml，取稀释液放入1cm比色杯，测定492nm处光吸收值A492。
虾青素含量Casta(％dw)计算方法：
Figure BDA0001737943510000121
式中A492是稀释液在492nm处的光吸收值，
Figure BDA0001737943510000122
是1％虾青素的DMSO溶液(10mg/ml)在1cm比色杯中吸光值，波长为492nm时，
Figure BDA0001737943510000123
V是提取液体积(ml)，T是稀释倍数，m是藻粉质量(mg)。
虾青素日平均产量Pasta(mg/L·d)计算公式：
Pasta＝Pmass×Casta
式中Pmass是红球藻生物质日平均产量，Casta是虾青素含量。
经过4天培养(接种后96小时)，藻液中NO3 -的浓度低于1.0mg/L。第5天开始补加有机碳源，连续补加6天，达到有机碳补加总量。从接种到培养结束共12天，红球藻生物质干重和产率、虾青素含量和产率如表6所示。
表6乙酸、乙酸钠兼性营养培养红球藻提高生物质和虾青素的产量
Figure BDA0001737943510000124
注：乙酸添加总量0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠添加总量2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等。
乙酸和乙酸钠兼性营养都显著提高了红球藻的生物质和虾青素的日平均产量。与光合自养培养相比，添加2.0g/L乙酸钠的生物质日平均产量提高了19.27％，虾青素日平均产量提高了21.57％。添加0.84ml/L乙酸的生物质日平均产量提高了22.89％，虾青素日平均产量提高了24.84％。与乙酸、乙酸钠兼养培养油球藻对生物质日平均产量和总脂日平均产量的影响类似，当乙酸、乙酸钠的添加量进一步增加，生物质和虾青素产量虽然呈现升高的趋势，但是升高的幅度明显减小。
添加乙酸0.84ml/L和1.68ml/L的生物质干重、虾青素含量与添加乙酸钠2.0g/L和4.0g/L的生物质干重、虾青素含量很接近，乙酸0.84ml/L和1.68ml/L分别与乙酸钠2.0g/L和4.0g/L的摩尔浓度相等，说明等摩尔的乙酸和乙酸钠对红球藻生物质产量和虾青素产量的影响相同。
培养过程中每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察红球藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况。从接种到培养结束，红球藻细胞形态都正常。培养前期，红球藻绿色细胞快速分裂繁殖，细胞数量大幅度上升；氮源消耗完以后，细胞停止分裂，数量不再增加，并逐步变为不游动的厚壁孢子，厚壁孢子体积增大，而且在细胞中积累红色的虾青素。虾青素首先出现在细胞的中部，然后红色区域逐渐向外扩展，直到占据整个细胞。仔细观察藻液颜色，乙酸或乙酸兼养培养与对照一样，藻液没有呈现丝毫浑浊。用显微镜40倍物镜和100倍物镜(油镜)观察，藻液中几乎观察不到细菌，更没有出现大量细菌结成的菌片、菌团，表明没有发生菌类的污染。
实施例5：开放池中乙酸兼养培养油球藻
在200平米开放池中配制培养基，培养基成分及其浓度与实施例1相同。接种浓度控制在OD540 0.1左右，在自然光温条件下进行培养。培养过程中向藻液中通入二氧化碳(钢瓶装商品二氧化碳)为微藻的光合作用提供碳源并控制藻液的pH。采用pH控制仪在线控制二氧化碳的通入：油球藻吸收利用培养基中的无机碳(CO2，HCO3 -)进行光合作用，藻液pH上升，当藻液pH值达到8.0，pH控制仪开通电磁阀，二氧化碳通入藻液中，藻液吸收二氧化碳后pH降低，当pH值降低到7.0，pH控制仪关闭电磁阀，二氧化碳停止通入藻液。如此循环，藻液pH值被控制在7.0-8.5范围内。每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况。每天下午4点的样品测定生物质干重(mg/L)、总脂含量以及藻液氮源(NO3 -)浓度。取样的同时准确测量并记录培养池中藻液的深度，根据生物质干重(mg/L)、总脂含量、藻液深度和培养时间计算生物质日平均面积产量(g/m2/d)和总脂日平均面积产量(g/m2/d)。培养结束时取藻液样品，按照菌落计数法测定藻液中细菌数量。
等藻液中的氮源基本消耗完，NO3 -浓度低于1.0mg/L，即可向藻液中加入乙酸进行兼养培养，乙酸每天添加0.14ml/L，连续添加6天。以不加有机碳源为对照，对照、乙酸兼养培养和乙酸钠兼养培养都培养三次。
藻液氮源(NO3 -)浓度测定方法与实施例1相同。
生物质干重和总脂含量测定方法与实施例3相同。
生物质日平均面积产量Pmass(g/m2·d)计算公式：
Pmass＝DW×H×10/t
式中DW是生物质干重(g/L)，H是藻液深度(cm)，t是培养时间(d)。
总脂日平均面积产量Plipid(g/m2·d)计算公式：
Plipid＝Pmass(g m2·d)×Clipid
藻液细菌数量测定方法与实施例1相同。
接种后经过4天培养，藻液中NO3 -的浓度低于1.0mg/L。从第5天开始，每天上午8点向培养池中加入乙酸，连续补加6天，补加乙酸总量0.84ml/L。
从接种到培养结束总共14天，藻液颜色由绿色逐步变成黄绿色，最后变为黄色。培养结束后停止搅拌，使藻液静置12小时，油球藻细胞都沉到培养池的底部，将上清液排出培养池，池底剩下的浓藻浆经过离心获得鲜藻泥。
开放池中乙酸兼养培养油球藻的效果如表7所示。
表7开放池中乙酸兼养培养油球藻的效果(数据是三次培养的平均值)
Figure BDA0001737943510000141
在开放池培养条件下，乙酸兼性营养培养能够显著地提高油球藻生物质产量和总脂产量。与光合自养相比，三次乙酸兼性营养培养的生物质日平均产量提高了27.53％；乙酸兼养的总脂含量比光合自养培养稍高，三次乙酸兼养培养的总脂日平均产量比光合自养培养提高了32.75％。
培养过程中每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况。从接种到培养结束，油球藻细胞形态都正常。油球藻细胞形态的变化与实施例3中观察到的相同，乙酸兼养的细胞形态变化过程与对照一样，但是变化进展比对照快一些。培养过程中，乙酸兼养和对照一样，藻液中看不到丝毫浑浊，显微镜检查没有发现细菌结成的菌片、菌团，表明没有发生细菌的污染。培养结束时，光合自养培养油球藻藻液中细菌总数平均4.1×104cfu/ml，乙酸兼养藻液中细菌总数平均5.3×104cfu/ml，虽然细菌数量比光合自养培养有所增加，但是远远低于发生细菌污染的情况(实施例1，细菌总数1.74×109cfu/ml)。
实施例6：开放池中乙酸兼性营养培养雨生红球藻
在5平米开放式跑道池中配制培养基，培养基成分及其浓度与实施例2相同。接种浓度控制在OD540 0.02左右，在自然光温条件下进行培养。培养过程中向藻液中通入二氧化碳(钢瓶装商品二氧化碳)为微藻的光合作用提供碳源并控制藻液的pH。采用pH控制仪在线控制二氧化碳的通入：红球藻吸收利用培养基中的无机碳(CO2，HCO3 -)进行光合作用，藻液pH上升，当藻液pH值达到8.0，pH控制仪开通电磁阀，二氧化碳通入藻液中，藻液吸收二氧化碳后pH降低，当pH值降低到7.0，pH控制仪关闭电磁阀，二氧化碳停止通入藻液。如此循环，藻液pH值被控制在7.0-8.5范围内。每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况，每天下午4点的样品测定生物质干重(mg/L)、虾青素含量以及藻液氮源(NO3 -)浓度，并按照菌落计数法测定藻液中细菌数量。取样的同时准确测量并记录培养池中藻液的深度，根据生物质干重(mg/L)、虾青素含量、藻液深度和培养时间计算生物质日平均面积产率(mg/m2·d)和虾青素日平均面积产率(mg/m2·d)。
等藻液中的氮源基本消耗完，NO3 -浓度低于1.0mg/L，即可向藻液中加入乙酸进行兼养培养，乙酸每天添加0.14ml/L，连续添加6天。以不加有机碳源为对照，对照和乙酸兼养培养都培养三次。
藻液氮源(NO3 -)浓度测定方法与实施例1相同。
生物质干重DW(g/L)测定方法与实施例3相同。
虾青素含量Casta(％)测定方法与实施例4相同。
生物质日平均面积产量Pmass(g/m2·d)计算公式与实施例5相同。
虾青素日平均面积产量Pasta(mg/m2·d)计算公式：
PAsta＝Pmass×Casta×1000
接种后经过5天培养，藻液中NO3 -的浓度低于1.0mg/L。从第6天开始，每天上午8点向培养池中加入0.14ml/L乙酸，连续补加6天，补加乙酸总量0.84ml/L。
每次培养14天，藻液颜色经历了绿色-褐色-棕色-红色的变化过程，成为富含虾青素的厚壁不动孢子。培养结束后停止搅拌，使藻液静置12小时，红球藻厚壁孢子都沉到培养池的底部，将上清液排出培养池，池底剩下的浓藻浆经过离心获得红球藻鲜藻泥。
开放池中乙酸兼养培养雨生红球藻的效果如表8所示。
表8开放池中乙酸兼养培养雨生红球藻的效果(数据为3次培养的平均值)
Figure BDA0001737943510000161
乙酸兼性营养培养可以显著地提高雨生红球藻在开放池中的生物质产量和虾青素产量。三次添加乙酸兼养培养红球藻，生物质日平均产量达到5.37g/m2·d，而不添加乙酸的光合自养培养是4.2g/m2·d，兼养比光合自养提高了24.88％；三次添加乙酸兼养的虾青素含量平均值和三次光合自养的平均值都是2.7％左右，没有明显差异；三次兼性营养培养的虾青素日平均产量达到150mg/m2·d，光合自养只有116.8mg/m2·d，兼养比自养提高了28.42％。
培养过程中每天上午8点和下午4点取藻液样品，在显微镜下观察红球藻细胞形态和藻液中菌类(主要是细菌)的繁殖情况。从接种到培养结束，红球藻细胞形态都正常。红球藻细胞形态的变化、细胞中虾青素的积累情况与实施4中观察到的相同。培养过程中，乙酸兼养和对照一样，藻液中看不到丝毫浑浊，没有见到细菌结成的菌片、菌团，表明没有发生细菌的污染。培养结束时，光合自养培养红球藻藻液细菌总数平均3.17×104cfu/ml，乙酸兼养藻液细菌总数平均8.10×104cfu/ml，虽然细菌数量比光合自养培养稍有增加，但是远远低于发生细菌污染的情况(实施例2，细菌总数6.69×108cfu/ml)。
根据表8对乙酸兼养培养红球藻的经济效益进行初步分析。光合自养培养雨生红球藻，虾青素面积产量平均116.8mg/m2·d；乙酸兼养培养雨生红球藻，乙酸添加量0.84ml/L，虾青素面积产量平均150mg/m2·d，一个培养周期14天，每平米培养面积增产虾青素465mg。按照藻液深度20cm计算，每平米使用冰乙酸168ml，食品级冰乙酸市场价6.5元/kg，冰乙酸比重1.0492，168ml冰乙酸的重量是176g，费用是1.14元。红球藻经过提取，得到含虾青素约5％的虾青素油，市场价格3500元/kg，换算成虾青素的价格是70元/g。乙酸兼养培养红球藻，每个培养周期一平米培养面积增产虾青素465mg，增加收入32.55元，减去投入1.14元，收入净增加31.41元，经济效益非常可观。
实施例3表明，添加等摩尔的乙酸钠和乙酸进行红球藻兼养培养，对提高红球藻生物质产量和虾青素产量的效果相同。根据表8的数据，也可以分析乙酸钠兼养培养红球藻的经济效益。每平米培养面积投入三水乙酸钠400g，增产虾青素465mg，增加收入32.55元。食品级三水乙酸钠的市场价格是9元/kg，400g的费用是3.6元。乙酸钠兼养培养红球藻，每个培养周期一平米培养面积收入净增加28.95元，经济效益非常可观。

Claims (3)

1.一种利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，其特征在于：微藻在开放式或封闭式光生物反应器中先进行光合自养培养，当硝酸根浓度低于1.0 mg/L，向藻液中补加乙酸或乙酸钠，乙酸的添加量为每天0.14-0.28ml/L，乙酸钠的添加量为每天0.33g/L-1.33g/L，且不添加任何形式的氮源，进行兼性培养，所述的微藻为油球藻、红球藻。
2.根据权利要求1所述的利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，其特征在于，乙酸或乙酸钠连续添加4-8天，或添加1-2天后间隔1-3天再添加。
3.根据权利要求1或2所述的利用乙酸/乙酸钠兼养培养微藻的方法，其特征在于，所述的乙酸的添加总量为0.84ml/L，或乙酸钠添加总量2.0g /L。
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