CN105123491A - 一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种藻类的培养方法，具体涉及一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，包括如下步骤：S1材料挑选：选取生长状态良好的紫菜自由丝状体，与培养液按比例混合，用粉碎机打碎切断藻丝，筛绢过滤藻体再用灭菌海水冲洗，加入新鲜培养液放置于特定参数下培养，每七天更换培养液，待其伤口愈合长到14-15天，备用；S2藻丝培养：选取按照S1培养的丝状体按初始密度0.8-1.2g：1L培养液接种到培养容器，置于特定参数下培养，每七天更换培养液。与现有技术相比，本发明是基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，既可保持紫菜自由丝状体较高生长率，又提高其体内藻胆蛋白含量，达到开发功能食品的要求。

Description

一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法

技术领域

本发明涉及一种藻类的培养方法，具体涉及一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法。

背景技术

紫菜是一类具有食用价值和经济价值的大型海洋藻类，我们每年紫菜的产量巨大，对紫菜的开发和研究尤为重要。目前，国内外学者的研究主要集中在两个方面，一是紫菜的培养，主要研究紫菜的生长规律和生长环境，优化栽培紫菜的生长条件，但是由于地方海域和季节的局限性，栽培规模和数量到达一定程度也很难再提高，研究人员也一直在探寻工厂化、规模化的紫菜培养方法。二是紫菜的功能性开发研究，紫菜中的藻胆蛋白含量较高，藻胆蛋白是蓝藻、甲藻和红藻等藻类光合辅助蛋白，带有开链四吡咯化合物的发色团，主要包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋(APC)，藻胆蛋白颜色鲜艳，色泽亮丽，欧美等发达国家很早就将其作为食品添加剂和化妆品着色剂，藻胆蛋白被认为是最具商业价值的安全天然色素之一。此外，藻胆蛋白还涉及到临床医学诊断、免疫化学和抗癌药物等多种高附加值产业。鉴于其卓越的生理功能，藻胆蛋白在国内外已被应用于食品、医药、化工和化妆品等领域，市场前景广阔。目前我国分离纯化藻胆蛋白的来源主要是螺旋藻、紫球藻、多管藻、江蓠和紫菜（叶状体）等藻类，但大型海藻因提取成本较高及得率偏低等问题而未能完全实现工业化生产。紫菜叶状体和丝状体藻胆蛋白含量较高，且丝状体细胞成分简单、多糖含量少，易于提取纯化藻胆蛋白，不像其叶状体时期因细胞壁厚和藻胶含量高而相对较难提取纯化。

专利201010299370.4《一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体》和201010238278.4《一种采用优化调控培养条件提高坛紫菜丝状藻体的生长速率》通过优化调控培养条件达到提高紫菜的藻胆蛋白含量和生产速率，他们利用成熟的叶状体，提取果孢子，再培养成丝状体的，这种方法需要每年采种菜后提取果孢子，每次种菜挑选、购买、保存及采果孢子等过程都需要耗费大量的人力物力，另外种菜每年只能产生一次，具有明显的季节限制。而且专利201010299370.4《一种优化调控培养条件获得高含量藻红蛋白的坛紫菜丝状藻体》的营养液配方中含有抑制大型藻类生长和污染的重金属铜等离子，无法用于开发食品级的藻胆蛋白，限制了应用范围。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，解决现有技术存在的问题。

为了实现上述的目的，采用如下的技术方案。

一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，包括如下步骤：

S1材料挑选：选取生长状态良好的紫菜自由丝状体，要求藻体无污染，自由丝状体与培养液按照鲜重8-12g:1L混合，用粉碎机打碎切断藻丝，筛绢过滤藻体再用灭菌海水冲洗，加入新鲜培养液放置于19-21℃暂养，光照38-42μmol/(m²·s)、光暗比10-14h:14-10h，每七天更换培养液，待其伤口愈合长到14-15天，备用；

S2藻丝培养：选取按照S1培养的丝状体按初始密度0.8-1.2g：1L培养液接种到培养容器，放置于19-21℃培养，光照18-22μmol/(m²·s)，光暗比10-14h:14-10h，每七天更换培养液。

本发明挑选干净无污染的丝状体，粉碎过滤之后还需要冲洗，是为了保证后续培养不受污染。经过挑选、冲洗、培养后所得丝状体颜色鲜艳，色泽亮丽，外观完整。本环节只需一次采果孢子，之后在室内培养丝状体或直接利用已有丝状体，可多年培养保种，节约了大量的成本，也防止了每年因种菜规格不一致导致的丝状体质量问题，且不受季节限制，可长年生产。丝状体阶段是紫菜生活史一个重要世代。与其它世代相比，丝状体可长期保存、随时扩增，能在人为控制下大规模相对封闭培养。更重要的是，丝状体细胞成分简单、多糖含量少，易于提取纯化藻胆蛋白，不像其叶状体时期因细胞壁厚和藻胶含量高而相对较难提取纯化。

光照来源为日光灯，通过调节培养材料与日光灯距离来控制光照强度，由测光仪进行测量，根据自然天黑时间设定自动关灯控制，培养液盐度用粗海盐调节并且用盐度计测量，全部模拟丝状体长期野外生存环境。

进一步地，所述步骤S1和S2每七天更换培养液的3/5，既增加了营养，又能减轻外界环境对藻体的扰动，保证优势生长。

进一步地，所述步骤S2培养方式为自动悬浮培养，培养期间每天定时摇动培养容器。该方式易于放大，适用于工厂化产业应用，悬浮培养流体层间产生的剪切力较弱，藻体受到的光照和吸收的营养较为均匀，保持良好的混合状态和藻丝的分散性有利于藻丝合成和积累藻胆蛋白。

进一步地，所述灭菌海水是由海水加粗海盐将盐度调至29-31，暗沉淀半个月以上，再经过0.45μm微孔滤膜过滤制成。过高和过低的盐胁迫会降低其藻胆蛋白含量和增加类胡萝卜素含量。丝状体培养在合适盐度范围内的培养基，可促进其合成藻胆蛋白及其它色素。

更进一步地，所述灭菌海水是由海水加粗海盐将盐度调至30，暗沉淀半个月以上，再经过0.45μm微孔滤膜过滤制成。批量生产保证产品质量需要严格控制好固定的参数，同等条件下盐度30的效果最佳。

进一步地，所述培养液是以每1000mL灭菌海水添加1mLF1培养液的比例配制成。

进一步地，所述的F1培养液配方包括NaNO₃、NaH₂PO₄、FeC₆H₅O₇、Tris、KI、H₃BO₃、维生素B₁、维生素B₁₂。本配方成分简单，不含有抑制藻类生长和污染藻类的重金属离子，培养的紫菜可用于开发食品级的藻胆蛋白以及其他各种食品级的应用，应用范围较广。

更进一步地，所述F1培养液配方包括：

硝酸钠（NaNO₃）21.249g，

磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）3.599g，

柠檬酸铁（FeC₆H₅O₇）0.129g，

Tris30.283g，

碘化钾（KI）0.416g，

硼酸（H₃BO₃）15.449g，

维生素B₁0.126g，

维生素B₁₂0.249x10^-3g，

灭菌海水500ml。

进一步地，所述步骤S1用粉碎机打至切断藻丝长度在300μm-500μm之间，保证藻丝易于成活的同时制备最大量的后续扩增培养藻丝。

进一步地，所述步骤S1的培养条件为光照40μmol/(m²·s)、光暗比12h:12h，所述步骤S2的培养条件为光照20μmol/(m²·s)、光暗比12h:12h。光照强度的变化会影响到能量传递效率，从而改变藻红蛋白数量及大小，进而影响到光合作用。保持合适的光照，既增加生物量，又促使其积累藻胆蛋白等目标色素。

很多藻类培养液都含有钾离子，钾离子对植物的作用主要为增加植株的抗倒伏能力，即增加植株的强度，这可能对紫菜育苗后期采苗（采种子）有一定的帮助，可以减少在采苗过程中丝状体由于强度差造成的损失，但强度过大的植株对本专利用于功能食品开发的藻胆蛋白提取有负面影响，所以调节合理的钾离子浓度对紫菜丝状体的培养也十分重要。

与现有技术相比，本发明是基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，既可保持紫菜自由丝状体较高生长率，又提高其体内藻胆蛋白含量，达到开发功能食品的要求。本发明有如下优点：第一，培养出来的丝状体颜色鲜艳，色泽亮丽，外观完整，不出现成团聚集的现象。第二，通过改变环境因子来促使其积累藻胆蛋白，无需添加额外的生化成分。第三，自动悬浮培养的丝状体生长速度快，积累藻胆蛋白的同时保证生物量的增加；第四，所使用的培养基为海水，来源方便，不使用淡水，保持环境可持续发展。第五，培养基母液不含重金属离子，培养紫菜可用于食品级功能开发。第六，藻丝干净不带有附生杂藻，培养过程受污染程度小，污染概率低，便于工厂化控制。第七，培养方式易于放大，适用工厂化产业应用，占地面积小，成本较低。第八，工厂化调控扩增相对于大型海藻野外栽培不存在明显季节性变化影响、可操控性强。根据本发明所述的培养方法可快速获得高藻胆蛋白的藻体，并将其应用到食品添加剂和生物活性物质等新兴产业。本发明易于应用到大规模工厂化生产，可操作性较强，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是本发明的流程图；

图2是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体生长速率（SGR）；

图3是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体藻红蛋白（PE）的含量；

图4是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体藻蓝蛋白（PC）的含量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和附图对本发明作进一步的描述。

实施例1

本发明是一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，培养方法流程如图1所示，本实施例具体包括以下几个步骤。

S1材料挑选：汕头大学海洋生物研究所重点实验室藻种室选育的坛紫菜自由丝状体品系（丝状藻丝＞99%），其叶状体2012年采于汕头南澳平屿，其与大陆完全隔绝，受污染程度较小。自由丝状体用粉碎机打碎15s，筛绢过滤藻体后用灭菌海水冲洗，置于20℃培养间(±1℃)暂养，光照40μmol/(m²·s)、光暗比为12h:12h，每七天更换一次培养基3/5。待长到15天待用。

S2藻体培养：培养方式设静置培养、模拟自动悬浮培养、通气悬浮培养三个水平，每个水平设置三组重复。各水平分组按丝状体初始密度0.28(±0.05)g/400mL接种到500mL锥形瓶。分别放到20℃培养间(±1℃)培养，其中静置培养每天轻摇培养瓶两次（早上9:00，下午5:00）；模拟自动悬浮培养使用摇床模拟自动悬浮培养丝状体，调节转速为137r/min；通气培养通入的气体量以藻丝悬浮生长为准，期间每天两次摇动培养瓶（早上9:00，下午5:00），使部分粘附在气石表面或瓶底的丝状体重新悬浮，通入的气流都预先经过硫酸铜溶液和纯净水除菌。调节培养容器与光源距离，设置光强为20μmol/(m²·s)，光强以最大表面照射为准，光暗比12h:12h。所用的都为取自汕头、暗沉淀半个月以上天然海水，粗海盐将盐度调至30，再经过0.45μm微孔滤膜过滤、高温灭菌之后，以每1000mL灭菌海水添加1mLF1培养液的比例配制成培养丝状体的海水。每七天更换培养液3/5，培养至20天后结束，测定丝状体鲜重、藻红蛋白(PE)及藻蓝蛋白(PC)含量。

S3丝状体鲜重(Freshweight,FW)测定：培养初始和结束分别对丝状体进行称重。丝状体用筛绢过滤后静置10分钟，电子天平称重，按以下公式计算特定生长速率(Specificgrowthrate，SGR)：

SGR(%/d)=[(W_t/W_O)1/t－1]×100%

其中W_O为初始FW，W_t为t天后的FW，t为培养天数。

图2是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体生长速率（SGR），如图2所示，模拟自动悬浮培养的生长速率优于静置培养和悬浮通气培养。这种差异可能与培养过程产生的流体剪切力有一定的关系。模拟自动悬浮培养的流体层间产生剪切力较弱，保持培养瓶良好的固液混合状态和藻丝的分散性，使藻丝受到的光照和营养吸收较均匀，有利于提高藻丝的SGR。

S4藻红蛋白(PE)及藻蓝蛋白(PC)含量测定：所有坛紫菜自由丝状体样品都经-20℃冰箱冷冻过夜，再由真空冷冻干燥72h过。称取0.1g(±0.01g)丝状体样品加入少量磷酸缓冲液(0.1mol·L^-1PH=6.8)冰浴研磨至匀浆状态，转入离心管用磷酸缓冲液补足到5mL，4℃下5000r/min离心10min。藻红蛋白（PE）、藻蓝蛋白（PC）含量计算参考Beer等的方法测定。藻胆蛋白的光吸收值均使用岛津紫外可见分光光度计UV—2501测定。

PE=[(A₅₆₄-A₅₉₂)–(A₄₅₅-A₅₉₂)*0.20]*0.12

PC=[(A₆₁₈-A₆₄₅₎–(A₅₉₂-A₆₄₅)*0.51]*0.15

其中，A₅₆₄，A₅₉₂及A₄₅₅等分别代表在相应波长下的提取液吸光值。

图3是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体藻红蛋白（PE）的含量，如图3所示，模拟自动悬浮培养和静置培养的藻红蛋白含量明显高于悬浮通气培养，图4是不同培养方式的坛紫菜自由丝状体藻蓝蛋白（PC）的含量，如图4所示，藻蓝蛋白含量从高到低依次是静置培养、模拟自动悬浮培养、悬浮通气培养。出现这种结果的可能原因是藻红蛋白在实验环境改变时，其蛋白质二级结构水平上关键区域的稳定性高于其他非关键区域，多肽链的柔性排列使藻红蛋白在环境发生改变时保持稳定的光谱特性，且藻红蛋白在变形过程中其内部荧光的传递能力高于藻蓝蛋白。

实施例2

S1材料挑选：汕头大学海洋生物研究所重点实验室藻种室选育的坛紫菜自由丝状体品系（丝状藻丝＞99%），其叶状体2012年采于汕头南澳平屿，其与大陆完全隔绝，受污染程度较小。自由丝状体用粉碎机打碎15s，筛绢过滤藻体后用灭菌海水冲洗藻体，置于20℃培养间(±1℃)暂养，光照40μmol/(m²·s)、光暗比为12h:12h，每七天更换一次培养基3/5。待长到14天待用；

S2藻丝培养：选取上述培养状态较好的丝状体按初始密度1g：1L培养液接种到锥形瓶，放置20℃培养间(±1℃)悬浮培养，根据培养容器大小设置转速使藻丝悬浮，期间每天摇动培养容器。通过调节光源与培养容器距离设置光强为20μmol/(m²·s)，光强以培养容器最大表面照射为准，光暗比12h:12h。所用的天然海水都先用粗海盐将盐度调至30，暗沉淀半个月以上，再经过0.45μm微孔滤膜过滤。每七天更换培养液3/5，培养至21天后测量藻红蛋白和藻蓝蛋白含量。经测量，每克干重丝状体藻红蛋白含量约为36.8168mg/g，藻蓝蛋白约为2.63872mg/g。

本发明是基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，既可保持紫菜自由丝状体较高生长率，又提高其体内藻胆蛋白含量，达到开发功能食品的要求；保证丝状体颜色鲜艳，色泽亮丽，外观完整，不出现成团聚集的现象。

Claims (10)

1.一种基于功能食品开发的紫菜自由丝状体工厂化培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1材料挑选：选取生长状态良好的紫菜自由丝状体，要求藻体无污染，自由丝状体与培养液按照鲜重8-12g:1L混合，用粉碎机打碎切断藻丝，筛绢过滤藻体再用灭菌海水冲洗，加入新鲜培养液放置于19-21℃暂养，光照38-42μmol/(m2·s)、光暗比10-14h:14-10h，每七天更换培养液，待其伤口愈合长到14-15天，备用；

S2藻丝培养：选取按照S1培养的丝状体按初始密度0.8-1.2g：1L培养液接种到培养容器，放置于19-21℃培养，光照18-22μmol/(m2·s)，光暗比10-14h:14-10h，每七天更换培养液。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1和S2每七天更换培养液的3/5。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S2培养方式为自动悬浮培养，培养期间每天定时摇动培养容器。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述灭菌海水是由海水加粗海盐将盐度调至29-31，暗沉淀半个月以上，再经过0.45μm微孔滤膜过滤制成。

5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述灭菌海水是由海水加粗海盐将盐度调至30，暗沉淀半个月以上，再经过0.45μm微孔滤膜过滤制成。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述培养液是以每1000mL灭菌海水添加1mLF1培养液的比例配制成。

7.根据权利要求6所述的培养方法，所述F1培养液配方包括NaNO3、NaH2PO4、FeC6H5O7、Tris、KI、H3BO3、维生素B1、维生素B12。

8.根据权利要求7所述的培养方法，所述F1培养液配方包括：

NaNO321.249g，

NaH2PO43.599g，

FeC6H5O70.129g，

Tris30.283g，

KI0.416g，

H3BO315.449g，

维生素B10.126g，

维生素B120.249x10-3g，

灭菌海水500ml。

9.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1用粉碎机打至切断藻丝长度在300μm-500μm之间。

10.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤S1的培养条件为光照40μmol/(m2·s)、光暗比12h:12h，所述步骤S2的培养条件为光照20μmol/(m2·s)、光暗比12h:12h。