CN101974598A - 利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，采用如下步骤：(1)制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；(2)积累虾青素：先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成浓度为20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸终浓度为0.95～1.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素产量达到最高。本发明简单易行、成本低廉、能大幅缩短雨生红球藻细胞完全变红的时间，并显著增加虾青素产量，从而大大提高雨生红球藻生产虾青素的效率。

Description

利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法
技术领域
本发明提供一种利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，属于生物技术领域。
背景技术
天然虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，C40H52O4)是一种脂溶性的次生类胡萝卜素，是目前自然界中已发现的最强抗氧化剂。有研究显示虾青素的抗氧化活性显著高于β-胡萝卜素(10倍以上)、花青素OPC(17倍)玉米黄素、角黄质、维生素C和维生素E(550倍)等常见抗氧化物质。超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能，如提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等，不仅可以用作珍贵水产动物养殖的饵料添加剂、人类的食品添加剂，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也具有非常广阔的应用潜力。目前国际上已具备的虾青素生产工艺有化学合成和生物提取两种，但化学合成的虾青素在结构、功能、应用和安全性等方面均较天然虾青素逊色。动物和人体实验的结果已经证明，天然虾青素无任何毒副作用，对人体绝对安全。
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种双鞭毛单细胞绿藻，在多种胁迫条件下，如强光、高温、营养盐(氮、磷)饥饿、高盐等，能够迅速合成并大量积累虾青素，其积累量远远高于从水产品废弃物(虾、蟹等甲壳)中提取和利用红发夫酵母发酵生产虾青素的产量，因此被公认是目前自然界中生产天然虾青素最理想的工具。美国FDA认为从雨生红球藻中提取的天然虾青素使用安全可靠，对动物和人类使用过程中绝对不产生任何毒副作用，已经通过了富含虾青素的雨生红球藻安全性论证，并明文禁止化学合成的虾青素进入保健品市场。国外已于上世纪90年代末在美国和瑞典的少数几家大公司实现了利用雨生红球藻大规模生产天然虾青素，并在技术上形成了垄断，从而导致天然虾青素的国际市场价格居高不下。国内对利用雨生红球藻生产虾青素的研究始于本世纪初，目前还处于实验室阶段，至今尚未具备规模化生产的相关技术和专利，同时存在许多难以解决的技术问题。
过去关于刺激雨生红球藻积累虾青素的诱导因子研究大多集中在物理因子(如紫外线、x、γ射线、激光辐射等)和化学因子(如盐胁迫、重金属离子、亚硝基胍、叠氮化合物等)，同上述诱导因子相比较，植物激素具有用量小、效益高、残毒少等优势。为一种抗逆激素，茉莉酸(JA)对植物生长发育和逆境条件下的抗性起着重要调节作用，而雨生红球藻正是在逆境胁迫条件下才能大量积累虾青素。外源应用茉莉酸能够激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，产生与机械损伤和昆虫取食相似的效果，并且在作用过程中与其它植物激素如脱落酸、水杨酸、乙烯等有着密切联系，因此茉莉酸应该会促进雨生红球藻大量积累虾青素。
目前，国内市场上已经有一些生产虾青素的相关专利技术，如“从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素和蛋白质的方法”(CN200510047267.7)，主要是从甲壳质、壳聚糖生产废水中回收虾青素，虽然能变废为宝，但是虾青素的提取效率较低。“一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法(CN02138827.X)公开了一种培养雨生红球藻生产虾青素的方法，包括培养基配方、一步法生产工艺、培养基的循环使用和用二氧化碳调节培养液pH值诱导红球藻孢子的形成及虾青素积累的方法。宁波大学的“大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及其方法”(200610154678.0)公开了一种大规模培养雨生红球藻和转化虾青素的装置及方法，整个培养装置由设置在固定架上的光生物反应器系统、充气装置、培养液灌输装置和静细胞收集装置组成，固定架上设置浮沉控制装置；中山大学的“光生物反应器促进雨生红球藻生长增殖及调控虾青素合成和积累的方法”(CN02134387.X)，涉及几种可调控的全天候封闭式大规模运行系统光生物反应器培养和促进雨生红球藻生长增殖及提高种群密度和调控细胞内次生代谢产物虾青素合成和积累的方法。“产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法”(CN03105314.9)，公开了一种产虾青素的藻类和酵母混合培养发酵生产虾青素的方法，属于生物法生产虾青素技术。该方法是在装有特定培养基的反应器内，同时接种包括雨生红球藻在内的藻类和包括红发夫酵母在内的酵母进行混合培养发酵生产虾青素。上述相关专利技术虽然先进，但均涉及光生物反应器等专业设施，对设备要求比较高，技术工艺比较复杂，操作有难度，而且费用很高，这无疑增加了生产成本和技术推广的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够克服现有技术中存在的缺陷、工艺简单、成本低且能显著提高雨生红球藻生产虾青素效率的利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法。其具体的技术方案为：
一种利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤：
(1)制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；
(2)积累虾青素：先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸终浓度为0.95～1.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，此时虾青素产量达到最高。
所述的利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，步骤(1)中，雨生红球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19～21℃，光强1500～1800lx，光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达108个/mL。
所述的利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，茉莉酸采用SIGMA公司生产的茉莉酸。
本发明与现有技术相比，其优点是：
1、本发明简单易行、成本低廉，原材料雨生红球藻细胞可以按常规方法自行培养。
2、本发明能大幅提高雨生红球藻中虾青素的积累效率，实验证明，添加0.95～1.05mg/L茉莉酸处理组比空白对照组雨生红球藻细胞完成虾青素积累的周期缩短了45.5～50.0％，虾青素产量比空白对照提高了34.4～36.9％，达16.04～16.35mg/L藻液。
具体实施方式
实施例1：
步骤1、制备藻液：雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度19℃、1500lx光强、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达108个/mL，即获得诱导培养的藻液；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：茉莉酸采用SIGMA公司生产的茉莉酸。先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸浓度为0.95mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液与空白对照组藻液同时在25℃、光强4500lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，24天后雨生红球藻细胞完全变红即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。
实施例2：
步骤1、制备藻液：雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度20℃、光强1800lx、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达108个/mL，即获得诱导培养的藻液；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：茉莉酸采用SIGMA公司生产的茉莉酸。先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸浓度为1.0mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液与空白对照组藻液同时在26℃、光强4800lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，23天后雨生红球藻细胞完全变红即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。
实施例3：
步骤1、制备藻液：雨生红球藻选用712藻株，采用MCM培养基，在温度21℃、光强1600lx、光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至雨生红球藻细胞达到对数生长期，细胞浓度达108个/mL，即获得诱导培养的藻液；
步骤2、诱导雨生红球藻积累虾青素：茉莉酸采用SIGMA公司生产的茉莉酸。先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已培养好的藻液中至茉莉酸浓度为1.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液与空白对照组藻液同时在28℃、光强5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，22天后雨生红球藻细胞完全变红即完成虾青素积累，此时虾青素含量达到最高。
采用以下方法对本发明中含有茉莉酸的藻液及空白对照组藻液定期进行显微观察，具体是每天取少量藻液样品在光学显微镜下观察藻细胞的颜色变化以及虾青素积累情况；然后按以下步骤对本发明含有茉莉酸的藻液及空白对照组藻液中的虾青素含量进行测定：①每三天各取出3ml上述两种藻液，5000r/min离心5min，弃上清得到藻细胞沉淀；②分别向两种藻细胞沉淀加入5％KOH和30％甲醇破坏叶绿素5min后，5000r/min离心收集沉淀；③在收集的沉淀中分别加入3ml二甲亚砜，利用超声波破壁后(3次15sec破壁/5sec间歇，输出功率40W)，于70℃水浴中处理10min，抽提至藻体发白；④然后10000r/min离心10min，分别取上清于490nm下测定OD值；⑤按公式C(mg/L)＝(4.5A×490×Va)/Vb计算两种上清中的虾青素含量，其中A表示OD值，Va表示二甲亚砜的体积，Vb表示藻液体积。
结果表明：空白对照组雨生红球藻细胞完全变红的时间为44天，此时虾青素含量为11.94mg/L藻液，茉莉酸处理组比空白对照组雨生红球藻细胞完全变红的周期缩短了45.5～50％，虾青素产量却比对照提高了34.4～36.9％，达16.04～16.35mg/L藻液。

Claims (3)

1.一种利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于采用如下步骤：
(1)制备藻液：培养雨生红球藻细胞到对数生长期，获得诱导培养的藻液；
(2)积累虾青素：先用2倍体积的无水乙醇溶解茉莉酸，再用超纯水配制成浓度为20mg/L的茉莉酸母液，将茉莉酸母液添加到上述已经培养好的藻液中至茉莉酸终浓度为0.95～1.05mg/L；然后将上述添加了茉莉酸的藻液在25～28℃、光强4500～5000lx、日光灯连续光照及营养盐饥饿的复合胁迫条件下进行培养，直至光学显微镜下观察到雨生红球藻细胞完全变红，即完成虾青素积累，此时虾青素产量达到最高。
2.根据权利要求1所述的利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：步骤(1)中，雨生红球藻采用712藻株，采用MCM培养基，在温度19～21℃，光强1500～1800lx，光暗比为12h/12h的条件下培养，日光灯下培养至培雨生红球藻细胞达到对数生长期，此时细胞浓度达108个/mL。
3.根据权利要求1所述的利用茉莉酸促进雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：茉莉酸采用SIGMA公司生产的茉莉酸。
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