CN105803031A - 一种利用植物生长调节剂eth诱导布朗葡萄藻b12藻株高效积累类胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法，其特征在于采用如下步骤：1)制备藻液：在23℃±2℃、光强1900±100lx、光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍浓度BG11营养盐培养藻细胞至对数生长期，培养每14±1天添加1倍浓度BG11营养盐，每天摇藻3±1次；2)积累类胡萝卜素：取200ml对数生长期藻液置于300mL锥形瓶中，然后加入ETH至0.2±0.005mg/L，在上述相同条件下培养14±1天，诱导类胡萝卜素快速积累。本发明技术成熟、简单易行、成本低廉、高效无污染，能在短时间内显著提高布朗葡萄藻B12藻株类胡萝卜素产量。

Description

一种利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法

技术领域

本发明提供一种利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法，属于生物技术领域。

背景技术

布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)隶属于黄藻门(Xanthophyta)、黄藻纲(Xanthophyceae)、柄球藻目(Mischococcales)、葡萄藻科(Botryococcaceae)、葡萄藻属(Botryococcus)，是一种世界性分布的淡水单细胞微藻。布朗葡萄藻含有较高的胞外多糖、脂肪酸，尤其是含烃量。在培养物中,其产烃量为生物量干重的0.3%~76.0%,通常为25%~40%,在天然样品中最高达86%,大大高于其他微生物的含烃量(几乎都低于1%),其产烃平均热值较高，1kg葡萄烃完全燃烧能放出3.0×10⁴～4.2×10⁴kJ热量，燃烧后对大气CO₂含量无净增加并且葡萄藻所产烃的组成和结构与石油极其相似,在一些石油沉积中几乎全部有机质都是该藻形成的，故又被称为“油藻”，最可望成为工业藻种。

类胡萝卜素是广泛存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的的一类萜类化合物天然色素。所有类胡萝卜素形式上都可由有11个共轭双键中间碳链的番茄红素(1ycopene)基础结构通过氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架的重排、降解而衍生。类胡萝卜素在生物体内具有十分重要的生理功能，它是植物光合作用的辅助色素，在保护细胞免受强光、活性氧和敏化色素的有害影响中起着重要的作用。同时，类胡萝卜素具有较高的医药价值，通过摄食类胡萝卜素不仅可以预防眼病和心血管疾病的发生，还可以增强人体的免疫功能，具有抗癌、抗氧化、抗衰老等功效。因此，类胡萝卜素作为营养、保健、着色等多功能天然色素，已广泛应用于食品、医药、保健品、饲料、化妆品等工业领域。植物生长调节剂在较低的浓度下即可高效调控植物的生长发育和次生代谢物的种类与产量，已经被广泛应用于高等植物尤其是农作物生产上。植物生长调节剂诱导具有操作简单、诱导率高、速度快、造价低、无污染、安全性强等诸多优点。微藻是进行植物生长调节剂调控次生代谢的优良材料，其结构简单、生命周期短、光敏性强、代谢过程极易受环境影响，也容易被检测。

目前，国外内已经公开了一些关于制备、提纯类胡萝卜素工艺的相关技术，大多数是针对一些发酵、提纯分离等技术改良的。如青岛大学公布了一种利用海洋红酵母高产类胡萝卜素和铜发酵培养方法（CN201510512641），该发明的目的在于提供一株从海洋环境中分离获得的既能高产类胡萝卜素又能富集铜的海洋红酵母，并提供其能够实现高产胡萝卜素并富集铜的最佳发酵培养条件，为工业化生产提供理论依据。具体的方法是：优选的发酵培养基组成为葡萄糖1％、酶解玉米粉1-3％、蛋白胨2.5％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.15％、铜含量150-200mg/L、氯化钠20％、其余为水；初始pH为8，接种量3-8％，摇床转速为50-80r/min，24-28℃培养10-15小时后调整温度为16-20℃进行低温静止培养，停止搅拌，pH调整为3-5，保持2-4小时；之后阶梯形升温到24-30℃，pH调整为4.6-5.5，按照2.5％的添加量添加蛋白胨，按照2％的量添加酵母粉；摇床转速为50-100r/min，继续发酵10-15h。优选的，在低温静止培养阶段向培养基中添加培养基重量3-5wt％的蛋氨酸螯和铜。威海利达生物科技有限公司发明的一种提高类胡萝卜素发酵产率的方法（CN104846049A），以胶红酵母菌作为类胡萝卜素发酵菌种，按照接种量为2％-10％将所述胶红酵母接种至培养基中，所述培养基中包括：葡萄糖12-130g/L、酵母粉2-22g/L、盐3-12g/L，该培养基的pH在5.5-7.5之间，向所述培养基中添加亚铁离子溶剂，所述亚铁离子溶剂的添加量为相对所述培养基的摩尔浓度在0.5mmol/L之间，发酵温度维持在27-33℃，发酵32-40小时后，摇床速度140-200r/min，将温度降至20-25℃继续发酵，发酵24-46小时，摇床速度80-140r/min。四川理工学院提供了一种利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法（CN104805168A），将活化的光合细菌(Rhodobactersphaeroides)单菌落接种到MMS培养基中，好氧过夜培养获得种子；然后按接种量为8％将好氧过夜培养的种子分别接种到含有MMS培养基的培养瓶中，接种后培养液体积相当于培养瓶体积的40％，然后在转速为200～250rpm、温度为30～32℃、黑暗条件下好氧发酵至OD600为0.6-0.8；合并发酵液，使发酵液体积相当于培养瓶体积的80％，再在转速为140～150rpm、温度为30-32℃、黑暗条件下微氧发酵36小时。中国农业大学郭仰东等发明了一种提高番茄果实中类胡萝卜素含量的方法（CN104686215A），该方法主要利用不同浓度的褪黑素溶液对绿熟期番茄进行喷施处理，从而达到提高番茄中类胡萝卜素的含量。

上述相关提纯、制备类胡萝卜素工艺的相关专利技术虽然先进，但有的存在被重金属污染的可能，如铜，且发酵技术工艺相对复杂，对生产设备要求高，这无疑增加了生产成本和技术推广难度。它们并未涉及广泛应用于农作物农业生产的成熟技术——植物生长调剂诱导生长快、易培养、产量高、养殖成本低廉的微藻类积累类胡萝卜素的内容。

发明内容

本发明提供一种本发明的目的是提供一种工艺简单、速度快、造价低、无污染、安全性强的利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法。

其具体的技术方案为：

本发明提供一种利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法其特征在于采用如下步骤：

1）制备藻液：在23℃±2℃、光强1900±100lxlx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍浓度BG11培养基培养布朗葡萄藻B12藻株28±1天到对数生长期，获得用于ETH诱导的藻液，培养期间每14±1天加一次1倍浓度的BG11营养盐；

2）积累类胡萝卜素：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入ETH至工作浓度为0.2±0.005mg/L，于1900±100lx，23℃±2℃进行诱导处理14±1天，处理阶段每天人工摇藻3±1次，摇藻时间间隔为5±0.5小时，诱导类胡萝卜素在藻液中的快速积累。

本发明与现有技术相比，其优点是：

1、简单易行，原材料布朗葡萄藻B12藻株细胞易培养，周期短，成本低，抗逆性强，植物生长调节剂诱导技术成熟、见效快、无污染、生产工艺简单、产量高;

2、短时间内能显著提高布朗葡萄藻B12藻株细胞内类胡萝卜素的生产效率，研究表明，诱导处理后布朗葡萄藻B12藻株细胞类胡罗素含量可达藻细胞干重的5.15%（是空白对照组藻细胞中类胡萝卜素含量的1.45倍），产量可达20.87mg/L藻液。

具体实施方式

实施例1，采用以下步骤：

1）制备藻液：在22℃、光强2000lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍浓度BG11培养基培养布朗葡萄藻B12藻株27天到对数生长期，获得用于ETH诱导的藻液，培养期间每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐；

2）积累类胡萝卜素：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北京索莱宝科技有限公司生产的ETH至工作浓度为0.20mg/L，在2000lx，24℃进行诱导处理14天，处理阶段每天人工摇藻3次，摇藻时间间隔为5小时，诱导类胡萝卜素在藻液中的快速积累。

实施例2，采用以下步骤：

1）制备藻液：在24℃、光强1800x和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍浓度BG11培养基培养布朗葡萄藻B12藻株28天到对数生长期，获得用于ETH诱导的藻液，培养期间每14天加一次1倍浓度的BG11营养盐；

2）积累类胡萝卜素：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入北

京索莱宝科技有限公司生产的ETH至工作浓度为0.195mg/L，于1800x23℃进行诱导处理

15天，处理阶段每天人工摇藻3次，摇藻时间间隔5小时，诱导类胡萝卜素在藻液中的快速积累。

实验检测：

1）富集藻细胞：8000-9000rpm，4℃离心5-8分钟，得到澡泥，再将藻泥在-40℃冷冻干燥成藻粉;

2）转移到90%的丙酮溶液中黑暗条件下，4℃抽提24h后，测定663.6,646.6和470nm的消光值;

3）根据以下公式计算分析：

4）计算结果为：

实施例1所得类胡罗素含量为藻细胞干重的5.14%（是空白对照组藻细胞中类胡萝卜素含量的1.4倍），产量可达20.26mg/L藻液；

实施例2所得类胡罗素含量分别可达藻细胞干重的5.15%（是空白对照组藻细胞中类胡萝卜素含量的1.45倍），产量为20.87mg/L藻液。

Claims (1)

1.一种利用植物生长调节剂ETH诱导布朗葡萄藻B12藻株高效积累类胡萝卜素的方法，其特征在于采用如下步骤：

1）制备藻液：在23℃±2℃、光强1900±100lx和光暗比为12h/12h的条件下，采用1/4倍浓度BG11培养基培养布朗葡萄藻B12藻株细胞28±1天到对数生长期，获得用于ETH诱导的藻液，培养期间每14±1天加一次1倍浓度的BG11营养盐；

2）积累类胡萝卜素：取对数生长期藻液200mL置于300mL三角锥形瓶中，然后加入ETH至工作浓度为0.2±0.005mg/L，于1900±100lx，23℃±2℃进行诱导处理14±1天，处理阶段每天人工摇藻3±1次，摇藻时间间隔为5±0.5小时，诱导类胡萝卜素在藻液中的快速积累。