CN104212847A - 一种海洋微藻培养制备epa的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其包括以下步骤：取海洋微藻，接种至装有培养基的三角瓶中，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，培养9-12天；所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mL/L；pH值在7.5到8之间；然后通过离心收集海藻体，冷冻干燥，得到干燥藻体；选取萃取剂萃取干燥藻体，得到萃取液；所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成；再对萃取液进行后处理得到EPA藻油成品。本发明显著提高了EPA的提取率，而且操作步骤简单，成本低，有利于大规模生产。
Description
技术领域
本发明属于海洋微藻开发利用技术领域，特别是涉及一种快速有效地培养海洋微藻制备EPA的方法。
背景技术
EPA属于系列多不饱和脂肪酸，EPA分子中含有20个碳原子和5个双键，首个双键位于甲基端的第三个碳原子上，为ω-3多不饱和脂肪酸；EPA是人体自身不能合成但又不可缺少的重要营养素，因此称为人体必需脂肪酸。虽然亚麻酸在人体内可以转化为EPA，但此反应在人体中的速度很慢且转化量很少，远远不能满足人体对EPA的需要，因此必须从食物中直接补充。EPA有许多功效，可以治疗人体自身免疫缺陷，例如风湿性关节炎；可以促进循环系统的健康；有助于生长发育，保持身体里的Ω-3脂肪酸含量处于一个适当平衡的位置对正常的生长和发育是十分必要的；对肺病、肾病、糖尿病、大肠溃疡和节段性回肠炎的治疗都会起到积极的作用。EPA还具有帮助降低胆固醇和甘油三酯的含量，促进体内饱和脂肪酸代谢。从而起到降低血液粘稠度，增进血液循环，提高组织供氧而消除疲劳，防止脂肪在血管壁的沉积，预防动脉粥样硬化的形成和发展、预防脑血栓、脑溢血、高血压等心血管疾病。
由于陆生动植物的EPA含量很少，目前食品EPA多来源于海洋生物，主要是鱼油。然而从鱼油中提取EPA有很多问题。鱼油中的EPA含量受地区、季节和鱼种的影响；从鱼油中获得的EPA不容易提纯，易氧化变质；鱼油EPA有鱼腥味，胆固醇含量高；部分海洋地区污染严重，导致鱼油含有过高的重金属和有机污染物；从鱼油中提取EPA工艺复杂，成本很高；尤其近些年来，世界野生渔业资源逐渐枯竭，鱼油价格高涨。而研究发现，提供鱼油的海生鱼类本身并不合成EPA。它们是从海洋食物链中获得EPA的，海洋微藻才是EPA的真正生产者。一些海洋微藻例如拟微球藻(Nannochloropsis)对EPA具有较高的合成能力。
眼点拟微球藻(Nannochloropsis oculata)俗称“海洋小球藻”(Marine Chlorella)属于异鞭藻门(Heterokontophyta)，真眼点藻纲(Eustigmatophyceae)，是一种重要的海产经济微藻。其富含蛋白质、多种维生素和矿物质，尤其是富含EPA(eicosapentaenoic acid)而不含有DHA(docosahexaenoic acid)，具有很高的营养价值和多种保健功能，食用安全。国内外在其应用于饵料微藻，健康食品和药品，以及其大规模养殖方面已有很多报道。国际市场供不应求，目前欧美多家公司在研发该种藻类的大规模生产工艺。
从海洋微藻中提取EPA可用的方法有很多，张汐等人在研究EPA和DHA的提取和富集中，作出详细报道，有分子蒸馏法，超临界流体萃取法，脲包法，柱色谱法等许多方法。田龙等对深海鱼油的主要富集方法,包括低温溶剂结晶法,硝酸银络合法,超临界萃取法,色谱分离法,脂肪酶酶催化法,尿素包合法和分子蒸馏法等进行了概括和总结。上述方法多存在提取率低，亦或有操作复杂和固定资产投资成本高等问题，均不适于大规模生产。采用溶剂萃取的方法从海洋微藻中提取EPA，工艺相对简单，固定资产投资需求小，容易放大规模生产，所以受到研究人员的重视。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海洋微藻培养制备EPA的方法，该方法通过海洋微藻的培养制备和有效提取，从而显著提高了EPA的提取率，而且步骤简便、快速、经济实用，有利于大规模生产。
本发明所采用的技术解决方案是：
一种海洋微藻培养制备EPA的方法，包括以下步骤：
a海洋微藻的培养
取海洋微藻，接种至装有培养基的三角瓶中，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，培养9-12天；所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L,硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mg/L；pH值在7.5到8之间；
b溶剂萃取EPA
海洋微藻培养好后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体；选取萃取剂萃取干燥藻体，得到萃取液；所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成；然后对萃取液进行后处理得到EPA藻油成品。
步骤a中，所述海洋微藻优选为眼点拟微球藻或日本小球藻。
步骤a中，所述海洋微藻优选按1∶2的重量比例接种在培养基上。
步骤a中，所述培养时间优选为10天。
步骤a中，所述培养基优选采用海水配制，海水在使用前需进行以下处理：先进行沉淀、过滤，然后加温消毒，加温达到90℃左右时，维持约5min或达到沸腾即刻停止加温。
步骤b中，优选萃取过程如下：先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。
步骤b中，优选后处理过程如下：先对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。
本发明的有益技术效果是：
本发明先采用特制的培养基配方，对海洋微藻进行培育，通过外因的优化提高EPA的表达量，然后采用溶剂萃取法，选取由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成的萃取剂，二者综合作用显著提高了EPA的提取率，而且操作步骤简单，成本低，环境污染小，有利于大规模生产。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
取眼点拟微球藻，接种至装有特制培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养10天。所述特制培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H5070.2mL/L；培养基采用淡水配制，调节其pH值在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体；选取萃取剂萃取干燥藻体，得到萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行常规处理得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为89％。EPA提取率＝EPA藻油成品中EPA的量/眼点拟微球藻中EPA的量×100％。
实施例2
取眼点拟微球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养10天。所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到90℃左右时，维持5min，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体。先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为94.5％。
实施例3
取眼点拟微球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的重量比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养9天。所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H5070.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到沸腾即刻停止加温，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体。先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为93％。
实施例4
取日本小球藻，接种至装有特制培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养9天。所述特制培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H5070.2mL/L；培养基采用淡水配制，调节其pH值在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体；选取萃取剂萃取干燥藻体，得到萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行常规处理得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为79.5％。EPA提取率＝EPA藻油成品中EPA的量/眼点拟微球藻中EPA的量×100％。
实施例5
取日本小球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养10天；所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到90℃左右时，维持5min，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体。先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为82％。
实施例6
取日本小球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的重量比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养9天。所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H5070.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到沸腾即刻停止加温，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。海洋微藻培养完成后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体。先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成。然后对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。经检测EPA的提取率为82.6％。
对比例1
取眼点拟微球藻，不经培养基培养，直接采用常规分子蒸馏法提取，经检测EPA的提取率为18.5％。
对比例2
取眼点拟微球藻，不经培养基培养，直接采用柱色谱法提取，经检测EPA的提取率为23.6％。
对比例3
取眼点拟微球藻，不经培养基培养，直接采用本发明溶剂萃取法提取，所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成，经检测EPA的提取率为43.5％。
对比例4
取眼点拟微球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养10天。所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到90℃左右时，维持5min，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。再采用常规分子蒸馏法提取，经检测EPA的提取率为65.5％。
对比例5
取眼点拟微球藻，接种至装有培养基的三角瓶中，按1∶2的比例进行接种，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，可吸收CO2，以防止因碳源不足而影响藻类生长，培养10天。所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L，硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mL/L。作为培养基用的海水在经过沉淀、过滤后，在烧瓶中加温消毒，加温达到90℃左右时，维持5min，以使海水中含有的一些对海洋微藻的生长有促进作用的有机物质保存下来。消毒后，在天然海水中按照上述配方加入各种营养物，摇匀后调节其pH值使之在7.5到8之间。再采用柱色谱法提取，经检测EPA的提取率为71％。
从上述实施例与对比例的比较可看出，本发明一方面采用特制的培养基配方，对海洋微藻进行培育，通过外因的优化提高EPA的表达量；另一方面通过采用溶剂萃取法，选取由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成的萃取剂，以提高萃取率。两方面综合作用使EPA的提取率较现有提取方法得以显著提高。而且相对于现有提取方法，本发明还具有操作步骤简单，成本低，环境污染小等优点，非常有利于大规模工业化生产。
Claims (7)
1.一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于包括以下步骤：
a海洋微藻的培养
取海洋微藻，接种至装有培养基的三角瓶中，然后置于光照培养箱中摇床培养，温度为28℃，光暗周期为12h/12h，振摇时保持三角瓶开口，培养9-12天；所述培养基的配方如下：硝酸钠0.03g/L，磷酸氢二钾0.01g/L，硼酸12mg/L，氯化锰10mg/L,硫酸铜0.005mg/L，FeC6H507 0.2mg/L；pH值在7.5到8之间；
b溶剂萃取EPA
海洋微藻培养好后，通过离心收集海藻体，然后冷冻干燥，得到干燥藻体；选取萃取剂萃取干燥藻体，得到萃取液；所述萃取剂是由正己烷与乙醇按照体积比1:2的比例配制而成；然后对萃取液进行后处理得到EPA藻油成品。
2.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤a中，所述海洋微藻为眼点拟微球藻或日本小球藻。
3.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤a中，所述海洋微藻按1∶2的重量比例接种在培养基上。
4.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤a中，所述培养时间为10天。
5.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤a中，所述培养基采用海水配制，海水在使用前需进行以下处理：先进行沉淀、过滤，然后加温消毒，加温达到90℃时，维持5min或达到沸腾即刻停止加温。
6.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤b中，萃取过程如下：先用适量的萃取剂浸泡藻体，不时震荡摇匀，抽提3次，合并浸液，然后过滤，用旋转蒸发仪回收萃取液。
7.根据权利要求1所述的一种海洋微藻培养制备EPA的方法，其特征在于：步骤b中，所述后处理过程如下：先对萃取液进行真空浓缩，脱除溶剂后得到EPA毛油；再将EPA毛油进行脱色和蒸汽除臭，浓缩得到EPA藻油成品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20141217 |