CN105755088B - 诱导雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法。所述方法包括如下步骤：步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养，维持一定光照强度，向培养基中持续通入混有体积浓度为1‑2％的二氧化碳的空气；步骤二、红色诱导阶段：将步骤一所得藻液与诱导处理剂按照一定体积比混匀，静置一定时间后加入诱导营养成分形成诱导培养基进行诱导培养，维持一定光照强度，且同时持续通入混有体积浓度为1‑2％的二氧化碳的空气；步骤三、在诱导虾青素过程中，定时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。本发明根据雨生红球藻的藻体快速生长期和藻体稳定期生长状况的不同，通过对环境条件进行调整，达到提高虾青素产量的目的。
Description
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，特别是涉及一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法。
背景技术
虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，C40H52O4)是一种红色类胡萝卜素，广泛存在于虾、蟹、鱼以及某些鸟类的羽毛中。其纯品呈暗紫红色，在体内可与蛋白质结合而呈现青、蓝、棕色等，加热使蛋白质变性后，虾青素被释放而呈现红色。虾青素具有着色功能，也能够增强机体的免疫力，促进抗体的产生，还具有抗氧、清除自由基等方面的功能。因其高效的生物学活性，近年来已成为国内外研究人员和水产养殖、化妆品、医药、食品等众多行业的研究热点。虾青素的主要生理功能包括清除自由基、防止油脂的氧化、淬灭单线态氧等，被广泛应用于食品、药品、饲料等领域。
生物获取天然虾青素的方法，一般有3种：虾蟹等水产品加工的废弃物、红发夫酵母和微藻(主要是雨生红球藻)。其中，废弃物中虾青素含量较低，且提取费用较高，不适宜进行大规模生产；天然的红发夫酵母中虾青素平均含量也仅为0.40％；相比之下，雨生红球藻中虾青素含量却高达1.5％-3.0％，因此被看作是天然虾青素的“浓缩品”。
在大规模利用雨生红球藻生产虾青素时，一般把生产过程分为两步：绿色培养阶段，通过严格控制pH、温度和营养水平等使雨生红球藻细胞大量扩增；红色诱导阶段，在得到足够的营养细胞后，改变培养条件，使藻细胞受到环境和营养胁迫，开始积累虾青素，形成红色囊胞。目前，文献报道关于雨生红球藻诱导虾青素主要集中于营养胁迫、光照以及部分植物激素。
本发明通过对雨生红球藻生产虾青素的过程深入研究，提出了一种利用臭氧水或氯氨试剂使雨生红球藻快速生产虾青素的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，用于高效生产虾青素。本发明通过对微生物的代谢规律进行研究，根据雨生红球藻的藻体快速生长期和藻体稳定期生长状况的不同，通过对环境条件比如光照强度、温度、培养基中二氧化碳含量等进行调整，达到提高虾青素产量的目的。
为了达成上述目的，本发明采用如下技术方案：
诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养，维持光照强度为20-100μmol·m-2·s-1，绿色培养阶段向营养培养基中持续通入经过滤的混有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.15-0.25vvm；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一所得藻液与诱导处理剂按照1：0.5-1体积比混匀，静置一定时间后加入诱导营养成分形成诱导培养基进行诱导培养，诱导阶段维持光照强度为150-300μmol·m-2·s-1，且同时持续向诱导培养基中通入经过滤的混有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.15-0.25vvm；其中，所述诱导处理剂为1-2mg/L的臭氧水或2-6mg/L的氯氨试剂；
步骤三、在步骤二诱导虾青素过程中，定时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
作为优选方式，上述诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到营养培养基中，在温度为20-25℃、持续光照强度为20-100μmol·m-2·s-1且同时持续向所述营养培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生长阶段初期；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一所得藻液与诱导处理剂按照1：1等体积比混匀，静置一定时间后加入诱导营养成分形成诱导培养基进行强光诱导培养，在温度为25-35℃、持续光照强度为150-300μmol·m-2·s-1条件下进行虾青素的积累，且同时持续向所述诱导培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气条件下进行诱导，其通气量为0.2vvm；其中，所述诱导处理剂为1-2mg/L的臭氧水或2-4mg/L的氯氨试剂；
步骤三、在步骤二诱导虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
其中，所述臭氧水是将臭氧通入水中制取；所述氯氨试剂是将铵盐与次氯酸钠按一定顺序和比例相混后制取，制取方法可以采用本领域公知技术实现，不再详述。
优选的，所述营养培养基为BG11培养基。
优选的，所述诱导营养成分为不含硝酸钠的BG11培养基成分。
本发明方法具有以下有益效果：
(1)诱导处理剂起到诱导藻细胞生产虾青素的作用，且没有新的副作用或对环境有害产物的残留；
(2)向培养基中通入的经过滤的混合有二氧化碳的空气不仅可以起到提供碳源的作用，而且能够搅拌细胞，使雨生红球藻接收到的光照强度更均匀，从而缩短生产虾青素的时间；
(3)诱导阶段在缺氮或低氮营养、强光、充足的CO2以及诱导剂的共同作用下，放大了单一条件下刺激雨生红球藻生产虾青素的产量，起到了协同诱导效果；
(4)本发明方法简单易行、成本低廉，添加诱导试剂后能很好的诱导雨生红球藻生产虾青素，使虾青素的产量显著增加，从而大大加快雨生红球藻虾青素积累过程，提高虾青素生产的效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明所用雨生红球藻藻株797，获自中国科学院水生生物研究所。
实施例1
一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到营养培养基中，在温度为20℃、持续光照强度为20μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生长阶段初期；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一中所获藻种的藻液，与1mg/L的臭氧水黑暗条件下等体积比混匀，静置30分钟，加入诱导营养成分，在温度为25℃下进行生产虾青素，其中，光照强度为150μmol·m-2·s-1；向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
实施例2
一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖(营养)培养基中，在温度为25℃、持续光照强度为100μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻稳定生长初期，获得大量藻种；
步骤二、生产虾青素：将步骤一中所获藻种，与2mg/L的臭氧水黑暗条件下等比混匀，静置40分钟，加入诱导营养成分，在温度为35℃下进行生产虾青素，其中，光照强度为300μmol·m-2·s-1；向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
实施例3
一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到繁殖(营养)培养基中，在温度为20℃、持续光照强度为20μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生产初期，获得大量藻种；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一中所获藻种的藻液，与2mg/L的氯氨试剂黑暗条件下等体积比混匀，静置20分钟，加入诱导营养成分，在温度25℃、光照强度为150μmol·m-2·s-1下进行虾青素诱导，其中向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
实施例4
一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到繁殖(营养)培养基中，在温度为25℃、持续光照强度为100μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生长阶段初期；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一中所获藻种的藻液，与4mg/L的氯氨试剂黑暗条件下等比混匀，静置30分钟，加入诱导营养成分，在温度为35℃、光照强度为300μmol·m-2·s-1下进行生产虾青素诱导，其中向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
对比例1
雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到繁殖(营养)培养基中，在温度为20℃、持续光照强度为20μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生长阶段初期；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一中所获藻种的藻液，与缺氮BG11培养基黑暗条件下等比混匀，静置30分钟，在温度为25℃、光照强度为150μmol·m-2·s-1下进行虾青素诱导，其中向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
对比例2
雨生红球藻生产虾青素的方法，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种到繁殖(营养)培养基中，在温度为25℃、持续光照强度为100μmol·m-2·s-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通气量为0.2vvm，直至到达雨生红球藻的稳定生长阶段初期；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一中所获藻种的藻液，与缺氮BG11培养基黑暗条件下等比混匀，静置30分钟，在温度为35℃、光照强度为300μmol·m-2·s-1下进行虾青素诱导，其中向培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.2vvm；
步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
虾青素含量测定方法采用改良的Boussiba的虾青素测定方法测定。
检测结果，见下表：
| 实施例 | 虾青素含量(诱导第1天) | 虾青素含量(诱导第7天) |
| 实施例1 | 14.23mg/L | 26.72mg/L |
| 实施例3 | 12.31mg/L | 22.29mg/L |
| 对比例1 | 5.21mg/L | 8.94mg/L |
| 实施例2 | 45.78mg/L | 79.26mg/L |
| 实施例4 | 41.66mg/L | 69.32mg/L |
| 对比例2 | 11.34mg/L | 25.62mg/L |
从上述结果可以看出，诱导剂的添加可以明显促进雨生红球藻中虾青素的积累，并且虾青素含量随着诱导剂剂量提高，最佳添加浓度：臭氧水浓度为2mg/L，氯氨试剂浓度为4mg/L。并且，还可以看出，对虾青素的诱导上，2mg/L臭氧水的诱导效果要略强于4mg/L的氯氨试剂。综上所述，在红色诱导阶段，诱导剂的添加可以加速诱导雨生红球藻积累虾青素。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作出的等同变化与修改，均应属于本发明保护的范围。
Claims (4)
1.诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、绿色培养阶段：将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养，维持光照强度为20-100μmol·m-2·s-1，绿色培养阶段向营养培养基中持续通入经过滤的混有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.15-0.25vvm；
步骤二、红色诱导阶段：将步骤一所得藻液与诱导处理剂按照1：0.5-1体积比混匀，静置一定时间后加入诱导营养成分形成诱导培养基进行诱导培养，诱导阶段维持光照强度为150-300μmol·m-2·s-1，且同时持续向诱导培养基中通入经过滤的混有体积浓度为1-2％的二氧化碳的空气，其通气量为0.15-0.25vvm；其中，所述诱导处理剂为1-2mg/L的臭氧水；
步骤三、在步骤二诱导虾青素过程中，定时取样进行显微观察，直至藻种细胞内完全变红时结束。
2.根据权利要求1所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：所述臭氧水是将臭氧通入水中制取。
3.根据权利要求1所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：所述营养培养基为BG11培养基。
4.根据权利要求1所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于：所述诱导营养成分为不含硝酸钠的BG11培养基成分。
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