CN103103128A

CN103103128A - 一种微藻高效富集培养的方法

Info

Publication number: CN103103128A
Application number: CN2011103524490A
Authority: CN
Inventors: 王领民; 金平; 李晓姝; 师文静; 张霖; 王崇辉; 高大成; 乔凯; 黎元生
Original assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Current assignee: China Petroleum and Chemical Corp; Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date: 2011-11-10
Filing date: 2011-11-10
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明公开了一种微藻高效富集培养的方法，包括如下内容：采用气升式生物反应器与光照气升式生物反应器串联，气升式生物反应器内包括微藻和微藻培养基，通入空气实现气升和好氧培养，并在液相回路上采用藻细胞富集装置。光照式生物反应器包括来自气升式生物反应器富集来的微藻和微藻培养基，通入含CO₂的气体实现气升、补给CO₂和解吸O₂，其中通入的含CO₂的气体来自于工业含CO₂的尾气，该尾气经过输送预处理装置后通入光照气升式生物反应器。与现有技术相比，本发明方法具有高效富集微藻细胞并实现藻细胞的高含油脂积累，提高CO₂利用率，提高O₂解吸能力，减化培养装置等优点。

Description

一种微藻高效富集培养的方法

技术领域

本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种生物反应器培养微藻过程中高效富集藻细胞并利用CO₂实现油脂积累的方法。

背景技术

微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分（如螺旋藻），可用于食品、医药和能源方面；可以大量积累脂肪酸，有些微藻脂肪酸含量可占干重的30％～60％。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能开发可再生资源最热门的研究领域。不仅具有强大的市场潜力，而且具有非凡的社会价值。

但大部分野生微藻生长速度不快，固定二氧化碳能力也有限，要实现规模化生产，就消耗大量的人力物力，而收获甚微。当前，微藻研究正值热门时期，微藻的生长速度和油脂积累量成为研究的重点。

微藻根据其营养方式分为自养与异养两种。第一种自养过程就是微藻利用CO₂气体进行光合作用来固定碳源的同时获得能源，进行生长，并积累油脂。由于CO₂在培养液中溶解度有限，吸收利用效率低下，CO₂的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键。目前开放的光生物培养微藻技术中，有不少CO₂补给方式和装置。CN 200610018771.9采用一种与养殖池相连的CO₂补给装置，可以有效提高CO₂利用率，但工艺繁琐，增加了设备投资。CN 200410020978.0和CN 03128138.9中均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO₂的补给，同时也能实现一定的氧解析效果。这些都难免增加设备投资，工艺过程繁琐。目前文献报道中还有另外的一种CO₂补给方式，CN200410009360.4和CN 200510126465.2中使用烟道气补碳。

第二种是异养培养方式，就是在培养过程人为提供碳源，比如葡萄糖等，显而易见，葡萄糖作为异养碳源，属于速效碳源，可以提高微藻生长的速度，但其油脂积累效率并没有得到相应的提高，同时该类碳源必然增加培养成本，将会受到原料的极大限制。

CN03109312.4公开了一种用淀粉酶解培养异养藻快速热解制备生物柴油的方法。该专利以低质粮食淀粉为原料，利用酶解淀粉制葡萄糖水溶液配制培养液，再通过异养转化技术获得异养小球藻；然后用高脂肪含量的异养藻细胞快速热解，获得高产量和高质量的生物柴油。该方法选择低质粮食淀粉水解后提供葡萄糖用作有机碳源，成本仍较高了。

在微藻培养条件和培养方式的基础上，人们的目光转向利用微藻生产生物柴油的培养策略。单步培养策略：完全培养基培养，虽然油脂的含量会比较低（加大提取成本），但生长速率快，能快速地增加生物量；不完全培养基培养，虽然生产速率比较慢，但高的油脂含量能抵消生物量的不足。两步培养策略：先利用完全培养基异养培养，使其生物量快速增加，再利用不完全培养基自养培养如氮限制或改变培养条件如光强、温度，使藻类大量积累油脂。

CN 200810112998.9公开了一种从自养到异养两步培养小球藻生产生物柴油的方法。该方法包括小球藻的自养培养、细胞浓缩、异养发酵、藻类细胞收集和干燥、从干燥的细胞中提取油脂和酯化反应制备生物柴油等步骤。该方法自养阶段需要使用较多的甘氨酸，在异养阶段加入的有机碳源选自葡萄糖、果糖、玉米淀粉水解液、木薯淀粉水解液等，成本较高。其油脂积累主要在异养阶段完成，在油脂积累同时的呼吸作用也要消耗有机碳源，积累的油脂也由有机碳源提供，因此消耗的有机碳源较多，生产成本很高，没有充分发挥微藻细胞固定二氧化碳的功能。

根据上述分析，为克服目前藻细胞生长速度与油脂积累方面的矛盾，需要对微藻采用异养与自养培养方式耦合培养，实现微藻细胞的连续富集和细胞内油脂高水平积累，优化工艺过程。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种微藻高效富集培养的方法，本发明方法具有高效富集微藻细胞并实现藻细胞的高含油脂积累，提高CO₂利用率，提高O₂解吸能力，简化培养装置等优点。

本发明微藻高效富集培养的方法包括如下内容：采用气升式生物反应器与光照式生物反应器串联操作，气升式生物反应器内包括微藻和微藻异养培养基，通入空气实现气升和好氧的异养培养，在气升式生物反应器排出液相的回路上设置微藻富集装置，富集得到的微藻连续或间歇地输送至光照式生物反应器，分离富集微藻后的液相循环回气升式生物反应器；光照式生物反应器内包括来自气升式生物反应器富集的微藻，光照式生物反应器内同时包括微藻自养培养基，同时通入含CO₂的气体实现气升、补给CO₂和解吸O₂，其中通入的含CO₂的气体来自于工业含CO₂的尾气，含CO₂的气体经过输送预处理装置后通入光照气升式生物反应器。

本发明方法中，含CO₂气体的输送预处理装置采用液环式输送泵，液环式输送泵工作液为灭菌消毒剂水溶液，液环式输送泵在实现气体输送的同时将气体进行预处理。液环式输送泵排出的气液混合物气液分离后的气相可以进一步设置无菌过滤器脱除杂质，液环式输送泵排出的气液混合物气液分离之前可以设置气液接触设备使气液充分混合接触。

本发明方法中，气升式生物反应器排出液相的回路上采用的藻细胞富集装置为设置滤网的过滤装置，滤网可以是任意材料，如金属滤网等，过滤装置优选设置反吹功能，实现藻细胞的截留与收集，收集过滤微藻后的液相通过输送装置循环回气升式生物反应器，输送装置可以是普通的液相输送泵。

本发明方法中，含CO₂的气体可以来自任意含二氧化碳气体的工业尾气，最好是厌氧发酵或微氧发酵过程排放的尾气，对于好氧微生物发酵过程的尾气可以先进行脱氧处理，然后利用，如吸附脱氧处理等，氧含量优选为低于8%（v），最优选为低于5%（v）。典型的厌氧过程如克雷博士肺炎杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇，初始通入的99％N₂，菌体在厌氧状态下发酵，产生大量的CO₂气体，一般尾气中含CO₂的体积浓度为10%左右。典型的好氧过程如酵母菌发酵制乙醇的过程，该尾气通过吸附脱除部分氧气后可以使用。

本发明方法中，灭菌消毒剂为本领域常规的灭菌消毒剂，如二氧化氯、次氯酸钠、漂白粉、过氧乙酸、过氧化氢、高铁酸钾、戊二醛等一切可以灭活菌类的消毒剂。灭菌消毒剂用量达到灭菌作用即可。

本发明方法中，气升式生物反应器和光照式生物反应器的其它操作条件按常规的微藻培养条件控制。如可以设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。本发明方法中，如果发酵尾气中的二氧化碳浓度较高，需要的通气量较低，达不到光照式生物反应器的气升的气量时，可以引入另一路气升气体。

本发明方法中，液环式输送泵可以采用液环式真空泵类似的结构，但本发明方法中，实现的是气体输送和预处理，而不是真空泵的作用，因此操作参数需进行相应调整。工作时，进气口一般为常压或微正压，液环式输送泵出口压力一般表压为2~200KPa，优选5~80 KPa。

本发明方法中，液环式输送泵工作液和输送的气体在液环式输送泵内混合接触，排出的气液混合物在进行气液分离之前设置气液接触设备，进一步提高气液接触效率，在实现输送气体的同时实现输送气体的预处理功能。设置的气液接触设备可以包括静态混合器、动态混合器、填料塔、鼓泡分散构件等。静态混合器、动态混合器和填料塔可以单独设置在液环式输送泵出口管路上。鼓泡分散构件可以设置在气液分离设备中，此时气液分离设备同时具有气液充分接触作用。

本发明方法中，光照式生物反应器可以采用常规的反应器结构，如可以在反应器内部设置光源，也可以在反应器外部设置光源，也可以在反应器内部和外部同时设置光源等方式。

本发明将异养微藻培养和自养微藻培养有机结合起来，利用异养微藻培养过程中，微藻繁殖速度快、生长旺盛等优点，首先将在气升式生物反应器中获得数量较多的微藻；然后利用自养微藻培养过程，使获得的微藻进一步提高油脂含量，提高微藻的品质，提高生物油脂的产量，提高综合微藻培养效率。即微藻细胞在该发明方法下实现了两阶段培养过程，分段培养时微藻细胞所处的生长环境发生了变化，通过该串联工艺优化，使微藻细胞的生长与生产两个较为矛盾的过程得到缓解，从而使微藻细胞获得了高效率培养。

本发明方法克服了当前微藻培养过程中补给CO₂和氧解析效率低、工艺繁琐、设备投入大的问题，提供了一种整合工艺过程，实现理想的CO₂补给和氧解析方式。本发明方法采用的气体输送设备为液环式输送泵，一方面为气体输送提供动力，实现气升式反应器的气升搅拌作用，同时利用液环式输送泵的工作液对输送的气体进行适宜的预处理，实现了气体输送与预处理的双重功能，进而简化了工艺流程，降低了设备投资。

本发明方法中，将气体的输送和预处理有机结合在一起，通过改变液环式输送泵工作液的组成，将其同时作为气体预处理的处理液，在气体输送的同时实现了废气的预处理，避免了通入气体对封闭微藻培养系统造成的微生物污染。气体输送及预处理装置中使用的液环式输送泵虽然与常规的液环式真空泵工作原理相同，但改变了操作条件，入口负压小，出口压力相对较高，因此克服了液环式真空泵用于真空泵时效率低等不足，降低了操作能耗。

本发明方法与先自养后异养的培养方式相比，由于本发明方法的主要油脂积累在自养阶段完成，因此消耗的有机碳原很少，生产成本低。并且，本发明方法在异养阶段完成了大部分细胞繁殖，在自养阶段主要完成油脂积累，因此本发明方法在培养效率并不低于现有方法，并且综合经济效益明显优现有技术方案。另外，本发明方法的自养阶段的培养基由于不使用大量的甘氨酸，成本也大大降低。

附图说明

图1是本发明一种具体工艺流程示意图。

图2为本发明发酵尾气输送及预处理方法中使用的液环式输送泵工作原理图。

其中：1-发酵尾气，2-工作液，3-液环式输送泵，4-气液分离罐，5-气液分布器，6-光照式生物反应器，7-气升式生物反应器，8-空气，9-微藻富集装置，10-普通液相循环泵；11-工作液进口，12-废气进口，13-气液混合物出口，14-液环式输送泵壳体，15-液环式输送泵液环，16-液环式输送泵叶轮。

具体实施方式

本发明方法中，用于微藻富集的培养反应器为气升式反应器，通入空气进行好氧的异养培养，反应器中的培养基为常规异养藻培养基。异养培养基中除了微藻生长所必须的基本营养盐成份外，主要包括有机碳源，该有机碳源可以是葡萄糖、蔗糖、淀粉、木糖、纤维素水解液等。

本发明方法中，在气升式生物反应器异养培养的藻细胞通过富集装置进行富集，所采用的富集装置为一种金属滤网，并设有反吹装置，可以将富集到的微藻细胞泥浆状物质吹到光照式生物反应器中，进行下一步的光自养培养过程。

本发明方法中，在微藻培养的光照式生物反应器中，所培养的微藻来自气升式生物反应器的异养富集微藻细胞，使用的通入气体是克雷博士肺炎杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇过程中的尾气，该尾气中含有N₂和CO₂。由于克雷博士肺炎杆菌厌氧发酵生产1,3-丙二醇中，初始通入的99％N₂，菌体在厌氧状态下发酵，产生大量的CO₂气体，携带出去形成N₂和CO₂混合气，此混合气成份90%以上为N₂，CO₂含量在10%左右。

本发明所使用的为微藻培养提供碳源尾气还包含其他生物发酵过程中的尾气，比如酵母菌发酵等好氧发酵过程。此尾气中含有CO₂量与上述尾气类似，但其中含有大量的氧气，先通过脱氧设备，获得氧分压较低CO₂含量充足的可以用于微藻培养的碳源供气。

本发明中对培养微藻的光照式生物反应器供气可以分为两路，进行并联操作，一路为N₂，用于反应器气升导流，实现培养体系物质返混与传质，以及降低系统氧分压，实现脱氧功能；第二路为发酵尾气，经过上述输送预处理后进入生物反应器，尾气的中CO₂可供微藻生长碳源，此供气支路流量控制与pH电极或CO₂电极进行藕联控制，可以实现系统供碳与pH控制相藕联，也可以实现培养系统供碳与CO₂吸收利用水平相藕联。

本发明中在光照式生物反应器中使用溶氧和CO₂传感器，根据所测溶氧和CO₂利用情况，来调节N₂和含CO₂发酵尾气的通气量，光生物反应器中通气量一般控制在0.01L/L^.min～5L/L^.min（气体的体积与生物反应器容积之比），进而调节O₂和CO₂分压，从而实现理想的微藻光合反应过程中的CO₂利用和氧解析。本发明技术方案中的微藻培养体系尾气，可以部分循环回生物反应器，提高碳源的利用率。光照式生物反应器培养微藻可以培养后微藻连续收集采出或间歇收集采收。采用连续收集采出时，可以设置排出管路，通过收集装置收集培养后的微藻；采用间歇收集采收时，可以经培养10～40天后，停止培养，进行一次性微藻的收集采收。优选间歇收集采收方式。

本发明特别涉及所利用的微藻可以是各种利用二氧化碳为碳源进行光合作用生产有机物的藻类，如小球藻等。本发明方法的其它内容为本领域技术人员熟知的内容。

下面对合附图，进一步说明本发明方案和效果。

如图2所示，液环式输送泵工作原理如下：工作液通过工作液进口11进入液环式输送泵壳体14内，当液环式输送泵叶轮16顺时针旋转时，由于离心力的作用，工作液在液环式输送泵壳体14内形成一个封闭液环15，通过液环式输送泵叶轮16的叶片将废气进口12的废气增压输送至气液混合物出口13，将废气和部分工作液输送至液环式输送泵外。

如图1所示，气升式生物反应器7内接入出发藻种和异养培养基，压缩空气8进入反应器内进行气升搅拌和提供异养生长的氧气。在反应器内生长成熟的藻细胞通过富集装置9在普通液式循环泵的作用下进行富集，富集出来的藻细胞被反吹到光照式生物反应器6中。

发酵尾气1和工作液2通过液环式输送泵3混合输出至气液分离罐4，在气液分离罐4中，尾气和工作液通过气液分布器5进一步充分接触，以工作液对尾气进行预处理，然后进行气液分离，分离的气相进入气升式反应器6，液相作为工作液循环回液环式输送泵。液环式输送泵的工作液为发酵尾气的预处理液，因此需适时补充消毒剂等试剂。

方案1

在10L气升反应器中进行小球藻（购自中国科学院水生生物研究所藻种库1＃）的异养培养，反应器为气升式，以空气为气升气体，内设导流筒，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，外设不锈钢密封罩。在培养初期接入小球藻种子液和常规的异养培养基。

所述的常规培养基为本领域中异养发酵培养普通小球藻通常采用的培养基，所述常规异养培养基的基本组成一般为（以每升计）：

葡萄糖等有机碳源（含量换算成葡萄糖）	1.5g/L.d
		NaNO₃或KNO₃	0.10g
K₂HPO₄·3H₂O	0.05g
		MgSO₄·7H₂O	0.05g
CaCl₂·2H₂O	0.02g
		KH₂PO₄	0.08g
NaCl	0.04g
		Soil extract ^*（土壤提取液）	40mL
FeCl₃·6H₂O	0.003g
		Fe—EDTA	1mL
水	1L

培养一天后开始启动普通液相循环泵和微藻细胞富集装置，将气升反应器中的异养小球藻进行富集收集，并实现液相循环利用，继续实现小球藻在反应器内的异养繁殖和生长。富集后的微藻细胞连续或定期打入光照式生物反应器中。

在10L光照式生物反应器内进行小球藻培养。小球藻来自气升式生物反应器的富集异养小球藻。反应器为气升式，内设导流筒，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，外设不锈钢密封罩，罩内有日光灯光源，自动控制设定光的开关时间，形成小球藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及O₂和CO₂传感器。

光照式生物反应器内的，培养基SE自养培养基。

SE自养培养基配方如下表（以每升计）：

NaNO₃	0.25g
		K₂HPO₄ . 3H₂O	0.075g
MgSO₄ . 7H₂O	0.075g
		CaCl₂ . 2H₂O	0.025g
KH₂PO₄	0.175g
		NaCl	0.025
Soil extract（土壤提取液）	40ml
		FeCl₃·6H₂O	0.005
Fe—EDTA	1ml

通气采用空气压缩机压缩空气通入，通入量1L/min。

培养液在既定的光暗周期下，培养20天后终止培养，收集光照式生物反应器中的藻细胞，测干重与油脂含量，并分析CO₂利用情况。

方案2

同方案1，所不同的是光照式生物反应器的通气部分，两路并联供气，第一支路为压缩N₂气，第二支路采用液环输送泵输送收集来自克雷博士肺炎杆菌（中国微生物菌种保藏中心CGMCC0798）厌氧发酵生产1,3-丙二醇过程中的尾气，液环输送泵的工作液为含过氧化氢质量5%的水溶液，将两支路并联，分别调节流量，压缩混合气通入10L光照式生物反应器中，根据O₂和CO₂传感器所测量数据，分别来调节两个并联支路通气量为0.5L/min和0.1L/min。其他培养条件同方案1所述。

通过脱氧补碳培养20天后，收集光照式生物反应器中的藻细胞，测干重与油脂含量，分析CO₂利用率。

方案3

同方案2，发酵尾气采用普通压缩机输送至光照式生物反应器，其他培养条件同方案2所述。通过培养，20天后收集第二个光生物反应器中的普通小球藻，测干重与油脂含量（质量百分含量），分析CO₂利用率。

方案4

方案1中，仅异养培养（气升式反应器）20天。

方案5

方案1中，仅自养培养（光照式反应器引入藻种后进行培养）20天。

上述实施方案实验结果如下表：

方案	藻干重	油脂含量	CO₂利用率
				1	51.18g/L	49.2%	0.54 g/(L·h)
2	54.72g/L	55.4%	0.88 g/(L·h)
				3	52.35g/L	51.2%	0.71 g/(L·h)
4	21.22g/L	7.8%	-
				5	7.15g/L	46.3%	0.32 g/(L·h)

从上述数据可以看出，本发明方法（方案2）极大地提高了微藻细胞的收获量，油脂含量也得到了提高。而方案4和方案5情况下，不进行异养与自养过程串联，单独进行培养，其细胞积累和油脂含量均不理想。因此，该发明方法明细改善了微藻培养效率。

Claims

1.一种微藻高效富集培养的方法，其特征在于包括如下内容：采用气升式生物反应器与光照式生物反应器串联操作，气升式生物反应器内包括微藻和微藻异养培养基，通入空气实现气升和好氧异养培养，在气升式生物反应器排出液相的回路上设置微藻富集装置，富集得到的微藻连续或间歇地输送至光照式生物反应器，分离富集微藻后的液相循环回气升式生物反应器；光照式生物反应器内包括来自气升式生物反应器富集的微藻，光照式生物反应器内同时包括微藻自养培养基，同时通入含CO₂的气体实现气升、补给CO₂和解吸O₂，其中通入的含CO₂的气体来自于工业含CO₂的尾气，含CO₂的气体经过输送预处理装置后通入光照气升式生物反应器。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：含CO₂气体的输送预处理装置采用液环式输送泵，液环式输送泵工作液为灭菌消毒剂水溶液，液环式输送泵在实现气体输送的同时将气体进行预处理。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：液环式输送泵排出的气液混合物气液分离后的气相设置无菌过滤器脱除杂质。

4.按照权利要求2或3所述的方法，其特征在于：液环式输送泵排出的气液混合物气液分离之前设置气液接触设备使气液充分混合接触。

5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：气升式生物反应器排出液相的回路上采用的藻细胞富集装置为设置滤网的过滤装置，过滤装置设置反吹功能，实现藻细胞的截留与收集，收集过滤微藻后的液相通过输送装置循环回气升式生物反应器。

6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：含CO₂的气体来自含二氧化碳气体的工业尾气，包括厌氧发酵或微氧发酵过程排放的尾气。

7.按照权利要求6所述的方法，其特征在于：含CO₂的气体中的氧体积含量低于8%。

8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：光照式生物反应器设置培养体系二氧化碳和溶解氧量的测定装置。

9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：液环式输送泵工作液和输送的气体在液环式输送泵内混合接触，排出的气液混合物在进行气液分离之前设置气液接触设备，进一步提高气液接触效率，在实现输送气体的同时实现输送气体的预处理功能；设置的气液接触设备包括静态混合器、动态混合器、填料塔、鼓泡分散构件；静态混合器、动态混合器和填料塔单独设置在液环式输送泵出口管路上，鼓泡分散构件设置在气液分离设备中。

10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：光照式生物反应器的光源设置在反应器内部，或者设置在反应器外部，或者同时设置在反应器内部和外部。