CN103103130B - 一种微生物混合培养生产油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物混合培养生产油脂的方法，包括如下内容：（1）培养兼性厌氧细菌种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～15.0；（2）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为2.0～10.0；（3）将扩大培养的兼性厌氧细菌和扩大培养的自养微藻混合，在光照式生物反应器内进行混合培养。与现有技术相比，本发明方法具有提高自养微藻收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点，同时对兼性厌氧细菌的发酵过程影响较小，实现两者同步进行。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说涉及一种利用自养产油微藻来获取高细胞收获量，同时提高微藻细胞的油脂含量。
背景技术
随着石油资源的日益紧缺、石油价格的不断上涨、油品供需矛盾的日渐凸显及环境污染问题的更加突出，多渠道开发可再生资源成为必然。来自微生物油脂的柴油具有能量密度高、含硫量低、燃烧充分、润滑性好等性能，还具有可再生、易生物降解、储运安全、抗爆性能好等特点，可作为石化能源的替代品。
微藻是含油微生物之一，微藻富含蛋白质、多糖、不饱和脂肪酸等营养成分（如螺旋藻等），可用于食品、医药和能源方面；可以大量积累脂肪酸，有些微藻如小球藻，其体内脂肪酸含量可占干重的30％～60％。利用培养微藻来积累油脂资源，已经成为目前利用太阳能开发可再生资源最热门的研究领域。不仅具有巨大的市场潜力，而且具有突出的社会价值。
微藻细胞生长方式分一般为光自养和异养碳源两种，光自养过程要消耗CO2，CO2的有效利用吸收，是实现理想培养效果的关键，同时存在补充CO2与光合作用产生O2的解吸、排出的问题。刘建国等“微藻规模培养的管道光生物反应器”（CN200410020978.0）及缪坚人等“一种微藻工业生产用光合生物反应器系统”（CN03128138.9）均采用在光生物反应器系统中加入一种装置方法，来实现CO2的补给，同时也能实现一定的氧解析效果。异养生长过程是利用有机碳源为底物替代自养过程中的CO2来进行微藻生物质的积累，细胞生长速度较快，但细胞内油脂积累水平较低。
利用其它非藻类微生物与微藻进行混合培养的研究也比较多，比如CN200910038908.0公开了一种芽孢杆菌调控浮游微藻混合培养的方法，该方法在混合培养体系中使用芽孢杆菌对各微藻进行混合培养时发现，各微藻生长均衡，稳定性好，可避免混合培养体系中藻相的生物多样性单一，避免某种微藻的数量出现极端优势或劣势，因此该方法主要用于控制某种微藻在水体中的泛滥。CN200910038910.8公开了一种乳酸杆菌调控微藻混合培养及协同净化养殖排放水的方法，该方法通过乳酸杆菌的直接或间接作用，调控各种微藻的数量比例，使各种藻生长均衡，稳定性好，通过菌、藻间的协同作用达到对养殖排放废水的去氮除磷的目的。上述现有技术是通过菌体来控制水体中藻的生长均衡，并没有促进藻的生长和藻细胞中的油脂积累的效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种利用兼性厌氧细菌与自养微藻进行异步种子制备，进而实现混合培养的方法，本发明方法具有提高自养微藻收获量，提高无机碳源（CO2）的利用率，提高微生物油脂含量，简化培养装置等优点，同时对兼性厌氧细菌的发酵过程影响较小，实现两者同步进行。
本发明微生物异步混合培养生产油脂的方法，包括如下内容：
（1）培养兼性厌氧细菌种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～15.0；
（2）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为2.0～10.0；
（3）将扩大培养的兼性厌氧细菌和扩大培养的自养微藻混合，在光照式生物反应器内进行混合培养。
本发明方法中，扩大培养的兼性厌氧细菌培养液和扩大培养的自养微藻培养液，在进行混合培养时的混合体积比为2：1～1：2，混合培养在光照式生物反应器内进行，混合培养过程中，流加补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。
本发明方法中，兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌等，有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉、纤维素水解液等，兼性厌氧细菌的代谢产物，即兼性厌氧细菌发酵产物一般为1,3-丙二醇和/或有机酸等，不同的兼性厌氧细菌得到的发酵产物有所不同，根据兼性厌氧细菌的种类不同而有所不同。兼性厌氧细菌种子液培养和扩大培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用搅拌式生物反应器，加入培养基和兼性厌氧细菌，在适宜的条件下进行培养。
本发明方法中，自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻、硅藻等，自养微藻种子液培养和扩大培养是本领域技术人员熟知的方法，如采用常规的气升式光照生物反应器进行培养。
本发明方法中，种子液培养基分别为兼性厌氧细菌培养基和微藻SE培养基。两种微生物分别进行扩大培养时和扩大培养后的混合培养所用培养基均为混合培养基。混合培养基以兼性厌氧细菌所需基础培养基为基础，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素（可以按SE培养基的组成添加相关物质）等。混合培养过程分批次或连续补充兼性厌氧细菌发酵过程所需的有机碳源。
本发明方法中，混合培养一般采用光照生物反应器，混合培养的条件一般采用与兼性厌氧细菌发酵过程的条件相似的条件，如温度一般为20℃～37℃，pH值一般为6～9，优选为6.5～7.5等。同步混合培养过程中，可以通入氮气或含二氧化碳的气体。混合培养时间一般为1～5天。混合培养体系中溶解氧量（DO）一般低于1mg/L。
本发明方法利用经过扩大培养后的兼性厌氧细菌细胞和微藻细胞进行混合培养，兼性厌氧细菌细胞与微藻细胞生长条件和所需碳源的不同，互相补充和促进。同时由于混合培养前，两种微生物经过扩大培养，各自均处于生长最佳期，混合后培养体系除微生物细胞外，其他组成没有变化，对两种微生物的生长影响较小。微藻细胞利用兼性厌氧细菌细胞发酵后排放的废弃碳源（CO2）为自身生长碳源，同时维持系统较平稳的渗透压条件（pH值），通过补充有机碳源保证兼性厌氧细菌细胞不断生长，通过光条件使微藻细胞不断生长，从而实现兼性厌氧细菌细胞与微藻细胞的混合培养过程。选择适宜种类兼性厌氧细菌细胞和适宜种类微藻细胞，通过控制异步扩大培养兼性厌氧细菌细胞和微藻细胞的不同生长时期等条件，使两者形成相互竞争性稳定的共同培养体系，并建立起不同细胞间共生的依存关系，实现了含油微藻的高效生长过程，并提高了油脂的累积效果，提高了单一含油微藻培养过程中单位发酵体系内的油脂收获量，从而为微生物油脂的制备奠定了基础。同时混合培养不会对兼性厌氧细菌细胞的发酵过程造成影响，可以同时获得所需的发酵产物。微藻对发酵过程使用的碳源和发酵产物均具有耐受性，不影响微藻的生长和油脂的积累。
附图说明
图1是本发明一种具体工艺流程示意图。
其中：1-自养微藻种子，2-兼性厌氧细菌种子，3-自养微藻种子液培养反应器，4-兼性厌氧细菌种子液培养反应器，5-自养微藻扩大培养反应器，6-兼性厌氧细菌扩大培养反应器（也即混合培养反应器），7-酸碱中和剂，8-气升气进气口，9-异步混合培养尾气出口。
具体实施方式
本发明微生物混合培养生产油脂的方法，具体包括如下内容：采用搅拌式生物反应器进行兼性厌氧细菌种子液培养，采用光照式生物反应器进行自养微藻种子液培养，搅拌式生物反应器内包括兼性厌氧细菌、细菌发酵培养基，光照式生物反应器内包括微藻藻种和自养培养基。混合培养之前，两种微生物分别单独进行细胞的扩大培养，扩大培养液培养合格后，将不同培养时期的两种微生物进行混合，继续进行混合培养。其中混合培养基中的有机碳源用于兼性厌氧细菌生长，而兼性厌氧细菌生长所产生的CO2用于微藻生长。混合培养过程通过正常pH控制、温度控制和通气量等控制培养过程。其中混合培养时有机碳源最优选采用流加方式补充，有机碳源被兼性厌氧细菌利用生长，兼性厌氧细菌发酵后产生较多的二氧化碳，排出细菌体外进入培养系统中，兼性厌氧细菌细胞排出的CO2处于溶解状态，可以立即被系统中的微藻细胞利用，作为微藻细胞生长的碳源供应。
本发明方法中，光生物反应器可以是板式、管式、气升搅拌式等封闭反应器。可以通入氮气或含二氧化碳气体为返混动力。生物反应器的其它操作条件按常规的细菌和微藻培养条件控制。培养体系可以设置二氧化碳和溶解氧量的测定装置，根据需要调整通气量，以获得良好的效果。
本发明方法中，兼性厌氧细菌细胞在有机碳源条件下实现快速生长，兼性厌氧细菌细胞消耗有机碳源，生成细菌生物质和各种代谢产物，同时发酵产生的CO2气体排出体外，使培养体系内无机碳源含量增加，微藻细胞利用这些无机碳源进行光合作用，获得微藻细胞自身的生长。同时兼性厌氧细菌细胞发酵使系统的pH值下降，而随着微藻细胞的生长，利用溶解的CO2，使系统的pH值上升，两者互为作用，调节系统的pH处于适应范围。同时光生物反应器提供pH电极检测，以便通过外源加入酸、碱来实现系统pH的控制。
本方法中pH控制酸中和剂为HCl、H2SO4、HNO3等常用的无机酸，碱中和剂为NaOH、NaHCO3、KOH、Ca（OH）2、氨水等常用的无机碱。
本发明方法中，混合培养过程温度控制为内部盘管加热方式。
本发明方法中，混合培养过程通入气体为氮气，通入气体量随培养液体积变化而变化，通入气体体积速率与培养系统装液体积比例为0.1 vvm ~1.0 vvm（单位液体体积每分钟通入的单位气体量）。
本发明方法中，兼性厌氧细菌细胞所需的有机碳源可以是甘油、葡萄糖、果糖、淀粉、纤维素水解液等，该有机碳源的加入采用流加补充方式进行，根据培养液成样品成份分析，随时检测系统的有机碳源浓度水平，将配置好的有机碳源母液按消耗速度进行流加。
如图1所示，微藻细胞经自养微藻种子液培养反应器3培养至生长达生物量OD＝2.0～10.0，兼性厌氧细菌经兼性厌氧细菌种子液培养反应器4培养至生物量OD＝5.0～15.0，然后将微藻细胞种子液和兼性厌氧细菌种子液分别转入气升搅拌式光生物反应器（自养微藻扩大培养反应器5和兼性厌氧细菌扩大培养反应器6）中进行扩大培养，当兼性厌氧细菌扩大培养反应器6中兼性厌氧细菌生长进入指数生长期（OD＝5.0～15.0）以后，将已经进入指数生长期（OD＝2.0～10.0）的自养微藻扩大培养反应器5中的微藻细胞等体积加入到兼性厌氧细菌扩大培养反应器6中，将两种处于指数生长期的微生物混合在一起，进行混合培养。在该混合培养过程中两种微生物指数生长期细胞的混合优选按等体积进行混合，使两种微生物细胞处于相同的体系内继续进行生长，同时经过检测分析混合后培养系统中pH值来调节混合液pH至6.5~7.5，进行混合发酵过程控制。
本发明方法中，混合培养过程有机碳源经过补加泵进行不断补加，维持有机碳源浓度在1.0%~2.0%范围内。混合培养条件一般为：温度为25℃~35℃；通气量为0.1 vvm ~1.0 vvm，搅拌转速为100 rpm ~400rpm，混合培养时间为24h~120h。
本发明方法中，扩大培养过程中，种子液接种量为扩大培养反应器体积的5%~20%。
方案1（比较例）
将克雷伯氏菌（中国微生物菌种保藏中心CGMCC0798）在300mL摇瓶中进行培养，所用培养基为兼性厌氧细菌培养基，培养20h后得到所需种子液。将培养的兼性厌氧细菌种子液接入10L生物反应器中进行扩大培养，所用培养基为混合培养基，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。
兼性厌氧细菌为克雷伯氏肺炎杆菌，其培养基为甘油培养基。
甘油培养基配方（以每升计）：
NH4Cl 5.35 g，KCl 0.75 g，NaH2PO4 1.38 g，Na2SO4 0.28 g，MgCl2·6H2O 0.26 g，CaCl2·H2O 0.02 g，酵母提取物1.0 g，甘油40 g。
SE培养基配方（以每升计）：
| NaNO3 | 0.20g |
| K2HPO4 . 3H2O | 0.07g |
| MgSO4 . 7H2O | 0.07g |
| CaCl2 . 2H2O | 0.03g |
| KH2PO4 | 0.18g |
| NaCl | 0.03 |
| Soil extract （土壤提取液） | 40mL |
| FeCl3·6H2O | 0.01 |
| Fe—EDTA | 1mL |
10L扩大培养反应器培养条件为，采用混合培养基（以甘油培养基为基础，同时按SE培养期组成添加适宜物质）：接种量（V/V）：10%；温度：30℃；通气量（氮气）：0.4 vvm，搅拌转速：200 rpm，时间：120h。
培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得出单位发酵体系微生物油脂的收获量。其中初始甘油培养基有机碳源（甘油）质量为40.0g/L，过程补加有机碳源维持含量为15g/L左右，培养结束时残余甘油含量为5.0g/L。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中主要产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
方案2（比较例）
将小球藻（购自中国科学院水生生物研究所藻种库1＃）在摇瓶中进行光自养培养，所用培养基为SE培养基，培养2天后得到所需种子液。将培养好的小球藻种子液接种至10L光生物反应器中进行扩大，接种量为扩大培养反应器体积的10%。反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯源，自动控制设定光的开关时间，形成小球藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。10L反应器培养条件同比较例方案1所示。
藻种为普通小球藻，小球藻扩大培养过程的培养基同方案1的混合培养基。
通气采用空气压缩机压缩氮气通入，通入量4.0L/min。
培养液在既定的光暗周期下（每天按12：12小时的比例确定），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。
方案3（实施例1）
克雷伯氏肺炎杆菌种子液培养方法同比较例方案1，小球藻种子液培养条件同比较例方案2，将克雷伯氏肺炎杆菌和小球藻在摇瓶中使用各自培养基进行单独培养，培养得到所需种子液。然后两种微生物分别进行扩大培养，培养基均为方案1中的混合培养基，培养条件同方案1和方案2中微生物发酵培养过程。将各自经过扩大培养的克雷伯氏肺炎杆菌培养液和小球藻细胞培养液等体积混合混合至20L光生物反应器中，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯光源，自动控制设定光的开关时间，形成小球藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。混合培养基同方案1的混合培养基，同时按方案2补充有机碳源。
混合培养通气采用气体压缩机压缩氮气通入，通入量4.0L/min。培养液在既定的光暗周期下（按每天12：12小时的比例），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
方案4（实施例2）
克雷伯氏肺炎杆菌种子液培养方法同比较例方案1，葡萄藻（购自中国科学院水生生物研究所藻种库357＃）种子液培养条件同比较例方案2，将克雷伯氏肺炎杆菌和葡萄藻在摇瓶中使用各自培养基进行单独培养，培养得到所需种子液。然后两种微生物分别进行扩大培养，培养基均为方案1中涉及的混合培养基，培养条件同方案1和方案2中微生物发酵培养过程。将各自经过扩大培养的克雷伯氏肺炎杆菌培养液和葡萄藻细胞培养液等体积混合混合至20L光生物反应器中，反应器为气升搅拌式，可以实现培养液的返混，反应器为玻璃体，设置日光灯光源，自动控制设定光的开关时间，形成葡萄藻培养过程中光暗过程转换。反应器内有温度控制盘管，以及pH、O2和CO2传感器。混合培养基同方案1的混合培养基，同时按方案2补充有机碳源。
同步混合培养通气采用气体压缩机压缩氮气通入，通入量4.0L/min。培养液在既定的光暗周期下（按每天12：12小时的比例），培养5天后终止培养，收集微生物细胞，测干重与油脂含量，得到单位发酵体系的油脂收获量。利用液相色谱分析发酵液离心收集菌体后清液中产物1,3-丙二醇浓度来确定兼性厌氧菌的发酵水平。
上述实施例实验结果如下表1。
表1 各实施方案的混合培养结果
| 方案 | 微生物干重 | 油脂含量 | 油脂收获量 | 兼性厌氧菌发酵水平 |
| 1 | 7.02g/L | 2.2% | 0.15g/L | 54.2g/L |
| 2 | 5.21g/L | 7.4% | 0.39g/L | - |
| 3 | 12.70g/L | 34.2% | 3.34g/L | 53.4g/L |
| 4 | 14.10g/L | 34.8% | 4.91g/L | 57.1g/L |
从上述数据可以看出，本发明方法（方案3和4）极大地提高了微生物细胞的收获量，油脂含量也得到了提高。因此采用本发明方法，在相同的培养条件下，与微生物单独培养方法相比，将两种微生物先分别经过异步扩大培养，再等体积混合后继续混合培养，得到的油脂收获量得到了较大提高。通过先异步扩大培养后再混合培养的单位发酵体系内油脂收获量得到明显提高。同时通过兼性厌氧细菌的发酵水平对比数据可以看出，在微藻细胞存在与否的情况下，克雷伯氏菌进行厌氧发酵生产1,3-丙二醇的水平基本不受影响。说明该发明方法，在实现生物质收集进而获取生物油脂的同时，还可以实现细菌发酵生产其它目标产物，从而提高微生物的利用效率。
Claims (10)
1.一种微生物混合培养生产油脂的方法，其特征在于包括如下内容：
（1）培养兼性厌氧细菌种子液，并扩大培养至生物量OD值为5.0～15.0；
（2）培养自养微藻种子液，并扩大培养至生物量OD值为2.0～10.0；
（3）将扩大培养的兼性厌氧细菌和扩大培养的自养微藻混合，在光照式生物反应器内进行混合培养。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：扩大培养的兼性厌氧细菌培养液和扩大培养的自养微藻培养液，在进行混合培养时的混合体积比为2：1～1：2。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（3）的混合培养过程中，流加补充兼性厌氧细菌生长代谢所需的有机碳源。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：兼性厌氧细菌包括芽孢杆菌、梭形杆菌、双歧杆菌、乳杆菌或克雷伯氏菌。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：有机碳源为葡萄糖、甘油、果糖、淀粉或纤维素水解液。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：自养微藻包括小球藻、葡萄藻、小环藻或硅藻。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：兼性厌氧细菌种子液培养基为兼性厌氧细菌培养基，自养微藻种子液培养基为微藻SE培养基。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：兼性厌氧细菌扩大培养使用混合培养基，自养微藻扩大培养使用混合培养基，混合培养使用混合培养基，混合培养基以兼性厌氧细菌所需基础培养基为基础，同时添加微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素，微藻细胞生长所需的无机盐和微量元素按SE培养基的组成添加相关物质。
9.按照权利要求1或8所述的方法，其特征在于：混合培养过程分批次或连续补充兼性厌氧细菌发酵过程所需的有机碳源。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：混合培养采用光照生物反应器，混合培养的温度为20℃～37℃，pH值为6～9。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |