CN102827775B - 微藻培养固定微生物发酵尾气co2补充发酵原料的方法 - Google Patents

微藻培养固定微生物发酵尾气co2补充发酵原料的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及CO2减排和循环利用的技术，公开一种微藻培养固定微生物发酵尾气CO2作为其发酵补充原料的方法。将微生物发酵罐中的尾气直接引入微藻培养光照生物反应器中，控制光照、温度和通气等条件，添加合适的无机营养盐，以微生物发酵尾气中的CO2为碳源培养微藻积累碳水化合物、蛋白质等生物质，并经过预处理将生物质转化为发酵所需的碳源和氮源等原料，返回到微生物发酵系统中作为其发酵补充原料。本发明实现了微生物发酵尾气CO2的减排和循环利用，同时能减少微生物发酵对粮食类原料的消耗，具有良好的环境效益和社会效益。

Description

微藻培养固定微生物发酵尾气CO2补充发酵原料的方法
技术领域
本发明涉及微藻培养以及微生物发酵产生CO2的减排和循环利用技术，具体的说是利用微生物发酵产生的CO2作为微藻生长的碳源，在光照生物反应器中培养微藻积累碳水化合物、蛋白质等生物质，并通过预处理将其作为补充原料用于微生物发酵。该技术可用于微生物发酵厂的尾气净化，实现CO2减排和循环利用。 
背景技术
微生物发酵生产目标产物(如乙醇、氨基酸、抗生素等)的同时会产生大量的副产物CO2，目前由于没有经济可行的利用渠道而直接排放。这不仅造成了资源浪费，更重要的是，CO2的大量排放会导致温室效应和全球气候变暖。 
微藻能够利用太阳光通过光合作用将CO2转化成生物质并释放氧气，因其生长速度快、CO2固定效率高、环境适应力强、不占耕地、易于人工控制、能实现连续生产等优点，被认为是最有效的CO2生物固定方法。 
利用微藻的光合作用固定微生物发酵产生的CO2，并将其生成的碳水化合物、蛋白质等生物质经过预处理后作为发酵原料的补充，能实现CO2减排和循环利用，同时减少微生物发酵对粮食类原料的消耗，获得良好的环境效益、经济效益和社会效益。 
目前国内外比较关注利用热电和冶金等行业产生的烟道气中的CO2培养微藻，也有一些关于用微藻作为原料发酵生产乙醇的报道，对于微生物发酵系统与微藻培养系统耦联操作实现CO2减排和循环利用的报道尚为空白。 
发明内容
本发明目的是提供一种微藻培养固定微生物发酵尾气CO2作为其发酵补充原料的方法。 
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 
微藻培养固定微生物发酵尾气CO2作为其发酵补充原料的方法所采用的装置包括发酵罐和光照生物反应器；发酵液收集罐顶端通过管线与发酵罐顶端相连，形成密闭系统，保证发酵尾气不泄漏进入空气中；发酵尾气在密闭的环境中达到0.01～0.03Mpa后依靠自身压力从发酵罐顶端经过0.22μm微孔滤膜过滤除菌，通过放气阀控制所需气体流量，进入光照生物反应器供微藻生长积累生物质；培养好的微藻经过水解预处理得到可发酵的预处理液，返回到微生物发酵培养基储存罐中，通过蠕动泵从发酵液进料口泵入发酵罐进行发酵。 
所述光照生物反应器为气升式平板光照生物反应器，压缩空气和发酵尾气均与反应器的曝气管相连；反应器内悬置有两平行挡板，挡板与反应器底部间设有间隙，反应器中藻液没过挡板；压缩空气曝气管置于反应器底部两平行挡板之间，使气体于挡板中间上升，带动反应器中藻液在挡板中间上升，于挡板两侧下降，形成循环，避免死角；发酵尾气曝气管设在两挡板外侧，使发酵尾气从挡板两侧上升，与下降的藻液形成逆流，从而增加气体在反应器中的停留时间，使气体与藻液充分接触，提高CO2吸收率。 
将微生物发酵罐中的尾气直接引入微藻培养光照生物反应器中，控制光照、 温度和通气等条件，添加合适的无机营养盐，以微生物发酵尾气中的CO2为碳源培养微藻并积累碳水化合物、蛋白质等生物质，并经过水解预处理将生物质转化为发酵所需的碳源和氮源等原料，返回到微生物发酵系统中作为其发酵补充原料，从而实现CO2减排和循环利用。可按如下步骤具体操作： 
1)微生物发酵生产目标产物 
按照常规方法进行发酵生产目标产物，同时获得含有CO2的发酵尾气。 
2)培养微藻固定发酵尾气中的CO2
用0.04％～0.1％的NaClO溶液将光照生物反应器灭菌12～24h，无菌水清洗干净，接入用0.3μm孔径的微滤膜过滤后的海水或自来水，添加无机营养盐及其终浓度为：NaNO3 100～300mg/L，NaH2PO4·2H2O 20.0～50.0mg/L，EDTA-Na2 90.0mg/L，H3BO3 67.2mg/L，MnCl2·4H2O 0.72mg/L，FeCl3·6H2O 2.6mg/L，ZnCl2 0.42mg/L，CoCl2·6H2O 0.40mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.18mg/L，CuSO4·5H2O 0.40mg/L；接入终浓度为0.1～0.4g/L微藻，从反应器底部挡板中部通入0.125～0.375VVM的空气，从反应器底部挡板两侧通入0.005～0.02VVM含有30％～50％CO2的微生物发酵尾气，保持温度25～30℃，光照强度100～250μmol E·m-2·s-1，光暗比12∶12～24∶0。微藻培养以间歇或者半连续方式进行。 
本发明所述微藻为固定CO2积累淀粉、纤维素等碳水化合物和蛋白质的海水或淡水微藻。海水藻如亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)、湛江等边金藻(Isochrysis zhanjiangensis)等，淡水藻如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、小球藻(Chlorella vulgaris)等。 
3)微藻生物质的收获和预处理 
微藻培养至稳定期后离心或者过滤收获藻泥。如有必要可以经过冷冻干燥、低温烘箱烘干或室外晾晒等方式除去水分制得藻粉。 
用酸热水解法或超声波-酶水解法处理藻粉或藻泥，释放微藻生物质中的淀粉、纤维素等多糖和蛋白质，得到可用于发酵的葡萄糖等碳源和氨基酸等氮源。 
酸热水解法：以料液比1∶2.5～1∶20向藻粉或藻泥中加入1％～5％(V/V)的硫酸，100～120℃处理15～60min，Ca(OH)2或NaOH调节pH至所需； 
超声波-酶水解法：以料液比1∶2.5～1∶20向藻粉或藻泥中加入去离子水或自来水，400～600W超声处理后调节pH到6.0～6.5之间，加入1～2μL/(g藻粉)液化酶(诺维信公司商品酶制剂，Liquozyme supra NBSSG4163)，80～90℃保温液化1～1.5h；降温到60～65℃，调节pH到4.0～4.5之间，加入2～4μL/(g藻粉)糖化酶(诺维信公司商品酶制剂，Dextrozyme dx NCSP0041)，保温糖化10～12h。该法还可以将藻粉或者藻泥添加到玉米粉等常规粮食类发酵原料中并与之共同处理(如高温蒸煮、液化、糖化等)后供发酵使用。 
4)微藻生物质预处理液的发酵 
微藻生物质预处理液提供发酵所需80％～100％碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖等)碳源和5％～10％氮源，向微藻生物质预处理液中加入另外0％～20％碳水化合物碳源和90％～95％氮源，发酵生产目标产物。 
本发明与现有技术相比具有如下优点： 
1.环境友好：利用微藻的光合作用高效固定微生物发酵产生的CO2，从而实现CO2减排，缓解温室效应。 
2.实现副产物的循环利用，降低生产成本：通过微藻将微生物发酵的副产物CO2转化为碳水化合物、蛋白质等可发酵原料，不仅实现了CO2的循环利用，还降低了发酵生产的原料成本；同时利用微生物发酵的副产物CO2培养微藻， 也解决了大规模微藻培养中的CO2来源问题，降低了微藻培养的成本。 
3.可持续性好：微藻生物质作为微生物发酵的原料补充，可以减少粮食类发酵原料的消耗，有较好的可持续性。 
总之，本发明涉及的微生物发酵与微藻培养耦联技术，可用于微生物发酵厂的尾气净化和微藻培养，实现CO2减排和循环利用，有良好的环境效益、经济效益和社会效益。 
附图说明
图1为本发明耦联系统装置结构示意图；注：1.光照生物反应器主体；2.微生物发酵罐；3.发酵液收集罐；4.培养基储存罐；5.空气压缩机；6.气体流量计；7.气体过滤器；8.光源；9.压缩空气曝气管；10.发酵尾气曝气管；11.挡板；12.微藻放料阀；13.微生物发酵尾气出口；14.气体压力表；15.搅拌器；16.蠕动泵；17.发酵罐与发酵液收集罐气体连通口；18.放气阀；19.发酵液进料口；20.气体分散器；21.藻泥或藻粉；22.微藻预处理液；23.离心或过滤、干燥过程；24.水解预处理过程；箭头代表气体或液体流动方向。 
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。 
实施例1 
培养亚心形四爿藻固定酵母发酵生产乙醇尾气中的CO2，将含有约40％(V/V)CO2的乙醇发酵尾气直接通入光照生物反应器培养亚心形四爿藻，使其固定CO2并积累大量淀粉，经过超声波-酶水解法释放淀粉生成葡萄糖，作为酵母发酵生产乙醇的原料补充。 
所述系统装置如图1所示，包括微生物发酵罐2和光照生物反应器1；微生物发酵罐2设有搅拌桨15，压缩空气经过转子流量计调节流量并经0.22μm微孔滤膜7过滤除菌后通入微生物发酵罐2底部并被气体分散器20分散成小气泡供发酵使用；发酵液收集罐3顶端通过管线与微生物发酵罐顶端气体连通口17相连，发酵尾气在密闭的环境中达到0.012Mpa后依靠自身压力从发酵罐顶端13经过0.22μm微孔滤膜7过滤除菌，关闭放气阀18，气体全部从光照生物反应器1底部两侧曝气管10进入，压缩空气经过转子流量计6调节流量并经0.22μm微孔滤膜过滤除菌后从光照生物反应器1底部中部曝气管9进入，培养微藻积累生物质；培养好的微藻经放料阀12放出，采用超声波-酶水解法得到可发酵的预处理液22，返回到发酵培养基储存罐4中，通过蠕动泵16从发酵液进料口19泵入发酵罐2进行发酵。 
所述光照生物反应器为气升式平板光照生物反应器，其主体1尺寸为照光面长140mm，高120mm，光径100mm，装液量10L；反应器内置两挡板11，高度为100mm，挡板下边缘离反应器底高45mm；压缩空气曝气管9和发酵尾气曝气管10离挡板下沿均为25mm；反应器所用材质为二氯甲烷粘结成的透明有机玻璃。反应器两侧均设白色荧光灯8。 
亚心形四爿藻培养固定乙醇发酵尾气CO2作为其发酵补充原料的具体操作如下： 
1)酵母发酵生产乙醇和副产物CO2
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)用于乙醇发酵。以15％(W/V)葡萄糖、0.5％蛋白胨和0.5％酵母浸粉为培养基，连续恒化培养，控制流加稀释率为0.065h-1，工作体积1.5L，培养温度30℃，pH控制为4.5，发酵罐搅拌速率150r/min，通气量100mL/min，相当于单位体积通气量为0.067VVM，既保持乙醇 发酵的厌氧环境，又提供微量氧促进酵母细胞生长。酵母发酵生产乙醇在180h内基本处于连续稳定操作状态，发酵液中残糖控制在17.8g/L左右，乙醇含量约65.4g/L，酵母细胞干重维持在8.7g/L左右。从乙醇的含量可以推算乙醇的产率为4.25g/(L·h)，CO2的产率为4.07g/(L·h)。 
2)亚心形四爿藻的培养及淀粉积累 
用0.044％NaClO溶液将光照生物反应器灭菌12h，无菌水清洗干净，接入用0.3μm孔径的微滤膜过滤后的海水，添加无机营养盐及其终浓度为：NaNO3200mg/L，NaH2PO4·2H2O 40.0mg/L，EDTA-Na2 90.0mg/L，H3BO3 67.2mg/L，MnCl2·4H2O 0.72mg/L，FeCl3·6H2O 2.6mg/L，ZnCl2 0.42mg/L，CoCl2·6H2O 0.40mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.18mg/L，CuSO4·5H2O 0.40mg/L。以0.1g/L的初始浓度接入微藻，工作体积10L，从反应器底部挡板中部通入100L/h的空气，从反应器底部挡板两侧通入含有40％CO2的乙醇发酵尾气，总流速为165mL/min，保持温度25～30℃，光照强度200μmol E·m-2·s-1，连续光照，间歇培养。 
利用乙醇发酵尾气提供的CO2作为碳源，亚心形四爿藻生长良好，培养7天后开始进入稳定期，细胞干重从初始的0.1g/L达到2g/L，细胞总糖含量略高于淀粉含量，说明细胞中积累的糖类物质主要是淀粉；培养液中淀粉含量从初始的0.01g/L上升到0.78g/L，淀粉占细胞干重的比例从初始的8％上升到40％。用CO2钢瓶和空气配制CO2含量为4％的气体并以此为碳源，在相同的条件下培养亚心形四爿藻，7天内细胞干重从初始的0.1g/L达到1.8g/L，细胞内淀粉含量占细胞干重的45％，说明乙醇发酵尾气提供的CO2与CO2钢瓶配制的气体对亚心形四爿藻的培养效果没有显著差别。 
经元素分析得知，亚心形四爿藻细胞含碳量为细胞干重的40％，由此可以推算亚心形四爿藻固定CO2速率为0.27g/(L·d)，10L亚心形四爿藻培养7天共固定CO2 27.9g，CO2吸收率为2.7％。如要完全吸收1.5L乙醇发酵系统产生的CO2，可培养542.7L亚心形四爿藻与之匹配。 
3)亚心形四爿藻的预处理 
亚心形四爿藻培养到第七天离心收获藻泥，经过冷冻干燥除去水分制得藻粉。 
超声波-酶水解法释放微藻淀粉生成葡萄糖：以料液比1∶20向亚心形四爿藻藻粉中加入去离子水，600W超声处理后调节pH到6.0～6.5之间，加入10μL液化酶(诺维信公司商品酶制剂，Liquozyme supra NBSSG4163)，80～90℃保温液化1～1.5h；降温到60～65℃，调节pH到4.0～4.5之间，加入20μL糖化酶(诺维信公司商品酶制剂，Dextrozyme dx NCSP0041)，保温糖化10～12h，葡萄糖的释放量为71.1％，水解液中葡萄糖含量为18.0g/L。离心取上清调节pH到4.50～4.55之间，供随后发酵使用。 
4)亚心形四爿藻预处理液的发酵 
在含糖量为18.0g/L的亚心形四爿藻预处理液中加入2％蛋白胨和1％酵母浸粉，以10％的接种量接入酿酒酵母菌种，30℃，150r/min摇床培养发酵产乙醇，酵母发酵6h到达终点，生物量由0.825±0.035g/L增加到4.43±0.14g/L，乙醇浓度由接种初始的1.07±0.11g/L增加到9.13±0.18g/L，乙醇对总糖的得率系数为0.448，为理论值0.511的87.7％。在相同条件下以18g/L葡萄糖为碳源进行乙醇发酵实验，乙醇对总糖的得率系数为0.471，为理论值0.511的92.2％，说明亚心形四爿藻超声波-酶水解预处理液作为碳源发酵生产乙醇的能力略低于直接用 葡萄糖为碳源的常规发酵，但仍可以用于酵母发酵生产乙醇。 
本实施例中，连续发酵生产乙醇对葡萄糖的得率系数为0.491，根据乙醇与CO2的质量关系(23∶22)，推算CO2对葡萄糖的得率系数为0.470，即1g葡萄糖能产生0.470g CO2；如果有足够规模的微藻吸收CO2，则此0.470g CO2将全部转化成微藻生物质，亚心形四爿藻含碳量为40％，根据C平衡计算，可获得0.32g微藻生物质，其中淀粉含量50％，则可推算产生的微藻淀粉为0.160g；预处理微藻生物质的葡萄糖释放率为71.1％，则最终能得到0.126g葡萄糖作为发酵原料的补充，即能够减少12.6％的常规发酵原料。 
实施例2 
培养亚心形四爿藻固定酵母发酵生产乙醇尾气中的CO2，将含有约40％(V/V)CO2的乙醇发酵尾气直接通入光照生物反应器培养亚心形四爿藻，使其固定CO2并积累大量淀粉，采用酸热水解法释放淀粉生成葡萄糖，作为酵母发酵生产乙醇的原料补充。 
实验装置、乙醇发酵、微藻培养方法同实施例1。 
酸热水解法释放微藻淀粉生成葡萄糖：以料液比1∶20亚心形四爿藻藻粉中加入3％(V/V)的硫酸，110℃处理30min，水解液中葡萄糖含量为15.0g/L，葡萄糖的释放量为59.2％。离心取上清，用Ca(OH)2调节pH到4.50～4.55之间，供随后发酵使用。 
在含糖量为15.0g/L的亚心形四爿藻预处理液中加入2％蛋白胨和1％酵母浸粉，以10％的接种量接入酿酒酵母菌种，30℃，150r/min摇床培养发酵产乙醇，酵母发酵6h到达终点，生物量由0.625±0.106g/L增加到3.450±0.071g/L，乙醇浓度由接种初始的0.91±0.02g/L增加到6.75±0.71g/L，乙醇对总糖的得率系数为0.491，为理论值0.511的96.0％。尽管酸热水解法对微藻葡萄糖的释放率不如超声波-酶水解法，但是发酵效率却高于超声波-酶水解法和直接用葡萄糖为碳源的常规发酵，可能是由于酸热水解法将微藻细胞中的蛋白质水解为氨基酸，作为部分发酵氮源的结果。酸热水解法可以应用于微藻碳水化合物的释放并对发酵有一定促进作用。 

Claims (4)

1.通过微藻培养固定微生物发酵尾气CO2并补充发酵原料的方法，其特征在于：将以CO2为副产物的微生物发酵过程中的尾气直接引入微藻培养光照生物反应器中，控制光照、温度和通空气的条件，添加无机营养盐，以微生物发酵尾气中的CO2为碳源培养微藻并积累生物质，并经过水解预处理将生物质转化为发酵所需的碳源和氮源，返回到微生物发酵系统中作为其发酵补充原料，获得发酵产物，并实现CO2减排和循环利用；
所述光照生物反应器(1)为气升式平板光照生物反应器，压缩空气和发酵尾气均与反应器的曝气管相连；反应器内悬置有两平行挡板(11)，挡板与反应器底部间设有间隙，反应器中藻液没过挡板；压缩空气曝气管(9)置于反应器底部两平行挡板之间，使气体于挡板中间上升，带动反应器中藻液在挡板中间上升，于挡板两侧下降，形成循环，避免死角；发酵尾气曝气管(10)设在两挡板外侧，使发酵尾气从挡板两侧上升，与下降的藻液形成逆流，从而增加气体在反应器中的停留时间，使气体与藻液充分接触，提高CO2吸收率；
微藻培养的条件为：用0.04％～0.1％的NaClO溶液将光照生物反应器灭菌12～24h，无菌水清洗干净，接入用0.3μm孔径的微滤膜过滤后的海水或自来水，添加无机营养盐及其终浓度为：NaNO3100～300mg/L，NaH2PO4·2H2O 20.0～50.0mg/L，EDTA-Na290.0mg/L，H3BO367.2mg/L，MnCl2·4H2O 0.72mg/L，FeCl3·6H2O 2.6mg/L，ZnCl20.42mg/L，CoCl2·6H2O 0.40mg/L，(NH4)4Mo7O24·4H2O 0.18mg/L，CuSO4·5H2O 0.40mg/L；接入终浓度为0.1～0.4g/L微藻，从反应器底部挡板中部通入0.125～0.375VVM的空气，从反应器底部挡板两侧通入0.005～0.02VVM含有30％～50％CO2的微生物发酵尾气，保持温度25～30℃，光照强度100～250μmol E·m-2·s-1，光暗比12:12～24:0；微藻培养以间歇或者半连续方式进行；
所述水解预处理方法为酸热水解法或超声波－酶水解法；微藻生物质可以单独处理，也可以与粮食类发酵原料混合后共同处理；
所述酸热水解法为：以料液比1:2.5～1:20向藻粉或藻泥中加入按体积比为1％～5％的硫酸，100～120℃处理15～60min，Ca(OH)2或NaOH调节pH至所需；所述超声波－酶水解为：以料液比1:2.5～1:20向藻粉或藻泥中加入去离子水或自来水，400～600W超声处理后调节pH到6.0～6.5之间，每克藻粉加入1～2μL液化酶，80～90℃保温液化1～1.5h，降温到60～65℃，调节pH到4.0～4.5之间，每克藻粉加入2～4μL糖化酶，保温糖化10～12h；
所述的微藻为亚心形四爿藻(Tetraselmis subcordiformis)、湛江等鞭金藻(Isochrysis zhangjiangensis)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)或小球藻(Chlorella vulgaris)。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：以CO2为副产物的微生物发酵过程是指以有机物为原料进行微生物发酵、副产物中含有CO2的生产过程。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
所述微生物发酵过程是指微生物发酵法生产醇类的过程、微生物发酵法生产氨基酸的过程、微生物发酵法生产有机酸的过程、或微生物发酵法生产抗生素的过程。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：
所采用的装置包括微生物发酵罐(2)和光照生物反应器(1)；
发酵液收集罐(3)顶端通过管线与发酵罐(2)顶端相连，形成密闭系统，保证发酵尾气不泄漏进入空气中；发酵尾气在密闭的环境中达到0.01～0.03Mpa后依靠自身压力从发酵罐顶端经过0.22μm微孔滤膜(7)过滤除菌，通过放气阀(18)控制所需气体流量，进入光照生物反应器(1)供微藻生长积累生物质；培养好的微藻经过水解预处理(24)得到可发酵的预处理液(22)，返回到微生物发酵培养基储存罐(4)中，通过蠕动泵(16)从发酵液进料口(19)泵入发酵罐(2)进行发酵。
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