CN104789631A - 一种能够提高叶黄素产量的小球藻培养方法及设备 - Google Patents

Abstract

一种能够提高叶黄素产量的小球藻培养方法及设备，所述方法包括1)初异养步骤，发酵罐中加入pH为6～8的异养培养液，将小球藻接种于发酵罐中，培养温度27～32℃，控制pH在6～8范围内，控制DO值在20％～40％范围内，培养至藻细胞密度5-50×10⁶/mL；2)自养-异养循环阶段，将步骤2)获得的初异养培养液转入自养培养，培养温度27～32℃，二氧化碳通气量为0.03-0.05VVM，并控制DO值也在20％～40％范围。培养至叶黄素含量增加幅度低于1.5-3％/h，转入发酵罐中继续进行异养，异养18-36h后，再转入自养培养阶段，如此自养-异养循环。

Description

一种能够提高叶黄素产量的小球藻培养方法及设备

技术领域

本发明涉及一种小球藻培养方法，特别是一种用于生产叶黄素的小球藻培养方法。

背景技术

叶黄素是目前已经发现的六百多种天然类胡萝卜素中的一种，其本身是一种抗氧化物，还可以吸收蓝光等有害光线。小球藻一般是指属于小球藻属(Chlorella属)的藻种，小球藻作为一种真核单细胞淡水微藻，既能够异养，也能够通过光合作用进行自养培养并合成叶黄素，在小球藻属中有多个藻种可以用于生产叶黄素，如原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)等，但是在异养条件下小球藻的叶黄素含量很低，光合自养模式下虽然叶黄素含量较高，但当小球藻生长一段时间后，光线就不容易穿过培养液，光合作用效率降低，生长速率降低，造成小球藻的产量较低，相应的叶黄素的产量也就非常低，因此单纯的异养和自养模式都不适合叶黄素工业化大生产，中国专利CN200610025618.9公开了一种异养-稀释-光诱导串联培养技术。将异养培养后的藻细胞再进行光照诱导可以提高藻细胞中叶黄素的含量，但我们发现异养培养结束后，此时小球藻细胞已经进入了稳定期，有些细胞已经开始衰亡，甚至自溶。因此再对这样的细胞进行光合诱导，叶黄素含量的提升幅度以及效率不高。中国专利CN201410632577.4也公开了一种自养与异养混合培养小球藻的方法，同样也只公开了异养-稀释-光诱导串联培养技术，仅对自养过程中的温度和光照强度等参数进行了调整，并采用补料流加培养的形式，同样存在着前述异养之后再进行自养，叶黄素生产效率偏低的问题，且采用补料流加培养虽然能提高藻细胞密度，但也会显著提高培养时间，且培养液稀释后，会造成整个系统耗，因此提供一种更加优化的小球藻培养方法，进一步提高单位时间内叶黄素的产量，成为现有技术中亟待解决的问题。

发明内容

本发明提供了一种小球藻培养方法，其特征是所述方法包括以下步骤

1)初异养步骤

发酵罐中加入pH为6～8的异养培养液，将小球藻接种于发酵罐中，培养温度27～32℃，控制pH在6～8范围内，通入空气，控制DO值(溶氧量)在20％～40％范围内，培养至藻细胞密度5-50×10⁶/mL；

2)自养-异养循环阶段

将步骤2)获得的初异养培养液转入自养培养，培养温度27～32℃，二氧化碳通气量为0.03-0.05VVM，并控制DO值(溶氧量)也在20％～40％范围。培养至叶黄素含量增加幅度低于1.5-3％/h，转入发酵罐中继续进行异养，异养18-36h后，再转入自养培养阶段，如此自养-异养循环，在藻细胞密度达到500-1000×10⁶/mL的自养培养阶段完成后结束培养。

优选自养-异养循环次数2≤n≤5。

优选自养阶段的光照的光量子通量密度为36-180μmol/(m²·s)。

优选所述小球藻为原始小球藻(Chlorella protothecoides)。

本发明还提供了执行所述小球藻培养方法的设备，所述的设备包括具有搅拌设备的发酵罐、光合反应器，其特征是所述发酵罐底部具有异养出料口，顶部具有循环进料口；光合反应器的底部具有循环出料口和进气口，顶部具有自养进料口和排气孔，

所述发酵罐的异养出料口通过管道与异养循环泵入口相连接，所述异养出料泵出口通过管道与光合反应器的自养进料口相连，位于光合反应器底部的循环出料口与自养循环泵入口相连接，所述自养循环泵出口与位于发酵罐顶部的循环进料口通过管道相连接，所述的设备还包括二氧化碳与空气混合罐，所述二氧化碳与空气混合罐出口通过管道与位于光合反应器底部的进气口相连接。

所述光合反应器具有两端封闭的圆筒状容器和围绕圆筒状容器布置的光源，所述圆筒状容器采用透明材料制作，长径比为3-10。

本发明提供了一种小球藻培养方法及其设备，通过采用自养-异养循环流程，能够在小球藻异养培养的藻含量增长期的各个阶段分别对其进行光自养培养，其效果相当于同时对小球藻进行异养和自养，既能够通过异养快速增加小球藻培养液的藻细胞密度，又能通过自养显著提高小球藻中叶黄素含量，在藻细胞密度达到500-1000×10⁶/mL时，叶黄素含量能达到200-300mg/L，与现有的方法比，在总培养时间增加不多的情况下，既能获得较高的小球藻产量(约30g/L或更高)，还能够显著提高小球藻的叶黄素含量，且该方法适用于对各种小球藻进行叶黄素生产方法的改进，能够显著提高采用小球藻生产叶黄素的工业化前景。

附图说明：

图1为本发明执行本发明具体实施方式小球藻培养方法的设备工艺流程图。

具体实施方式

本发明提供了执行小球藻培养方法的设备，包括具有搅拌设备10的发酵罐1(5L)、光合反应器2，所述发酵罐底部具有异养出料口11，顶部具有循环进料口12，本具体实施方式中，并每套设备中具有两台发酵罐和一台光合反应器。

所述光合反应器2具有两端封闭的圆筒状容器和在圆筒状容器周围布置的光源25，所述圆筒状容器的长径比为5，容积为5L，由透明材料制成，顶部和底部封闭，顶部具有排气孔和自养进料口21，底部具有进气口22、循环出料口23和放料口24，

所述发酵罐的异养出料口11通过管道与异养循环泵3入口相连接，所述异养出料泵出口通过管道与光合反应器的自养进料口21相连，位于光合反应器底部的循环出料口与自养循环泵4入口相连接，所述自养循环泵4出口与位于发酵罐顶部的循环进料口通过管道相连接，所述的设备还包括二氧化碳与空气混合罐5，所述二氧化碳与空气混合罐出口通过管道与位于光合反应器底部的进气口相连接。采用储存在钢瓶51内的液体二氧化碳作为二氧化碳源，以空气压缩机52产生的压缩空气作为空气源，将液体二氧化碳经过减压气化后与压缩空气按照比例在二氧化碳与空气混合罐中混合后从进气口通入光合反应器中。光合反应器的放料口24用于在培养结束后将料液放出。

本发明具体实施例中采用的异养培养液(包括初异养培养液)配方可以参照现有技术中的配方，具体的说异养培养液可采用BG-11培养基为基础的配方，所述BG-11培养基成分为：

NaNO₃ 1.5g/L，K₂HPO₄ 0.04g/L，MgSO₄·7H₂O 0.075g/L，CaCl₂·2H₂O 0.036g/L，Na₂-EDTA 0.001g/L，Na₂CO₃ 0.02g/L，柠檬酸0.006g/L，柠檬酸铁铵0.006g/L，微量元素A5溶液1mL/L；

所述微量元素溶液组成为H₃BO₃ 2.86g/L，MnCl₂·4H₂O 1.86g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L，CuSO₄·5H₂O 0.08g/L，Co(NO₃)₂·6H₂O 0.05g/L。

所述异养培养液还含有葡萄糖40g/L，且配制好的异养培养液用1M的盐酸或氢氧化钠溶液调pH至7.1。

本发明具体实施方式中采用的小球藻为均为原始小球藻(Chlorella protothecoides)，购自中科院水生生物研究所淡水藻种库，编号为FACHB-3。

实施例1

包括以下步骤

1)初异养步骤

发酵罐中加入异养培养液，将小球藻接种于发酵罐中，培养温度28～30℃，控制pH在6.5-7.5范围内，通入空气，控制DO值(溶氧量)在20％～40％范围内，培养至藻细胞密度30×10⁶/mL；

2)自养-异养循环阶段

将步骤2)获得的初异养培养液转入光合反应器自养培养，培养温度28-30℃，二氧化碳通气量为0.04VVM，并控制DO值也在20％～40％范围，自养培养阶段的光合反应器光照的光量子通量密度为36-108μmol/(m²·s)。培养至叶黄素含量增加幅度低于2％/h，转入发酵罐中继续进行异养，异养条件与初异养条件相同，异养持续24h后，再转入自养培养阶段，如此自养-异养循环3次(自养-异养循环次数n＝3)后，在自养培养阶段当藻细胞密度达到1000×10⁶/mL(折合小球藻产量为30g/L)时结束培养，分离小球藻并计算叶黄素含量，小球藻的叶黄素含量达到10mg/g(干重)，。

对比例1，采用现有的异养-自养方式进行培养

步骤1)与实施例步骤1)条件相同，区别在于培养至藻细胞密度最大(约800×10⁶/mL)时停止，

步骤2)，将步骤1)得到的培养液稀释至藻细胞密度500×10⁶/mL，并将其加入光合反应器中进行自养，同样自养培养阶段的光合反应器光照的光量子通量密度也为36-108μmol/(m²·s)，培养至叶黄素含量不再增加时停止培养，此时小球藻的叶黄素含量达到4-5mg/g(干重)

本发明及具体实施方式中，结束培养时的自养培养阶段不计入所述自养-异养循环次数n的计数。

本发明中所述小球藻的拉丁属名为Chlorella。

Claims (6)

1.一种小球藻培养方法，其特征是所述方法包括以下步骤

1)初异养步骤

发酵罐中加入pH为6～8的异养培养液，将小球藻接种于发酵罐中，培养温度27～32℃，控制pH在6～8范围内，通入空气，控制DO值在20％～40％范围内，培养至藻细胞密度5-50×10⁶/mL；

2)自养-异养循环阶段

将步骤2)获得的初异养培养液转入自养培养，培养温度27～32℃，二氧化碳通气量为0.03-0.05VVM，并控制DO值也在20％～40％范围。培养至叶黄素含量增加幅度低于1.5-3％/h，转入发酵罐中继续进行异养，异养18-36h后，再转入自养培养阶段，如此自养-异养循环，在藻细胞密度达到500-1000×10⁶/mL的自养培养阶段完成后结束培养。

2.如权利要求1所述的小球藻培养方法，其特征是自养-异养循环次数2≤n≤5。

3.如权利要求1或2所述的小球藻培养方法，其特征是自养培养阶段的光照的光量子通量密度为36-180μmol/(m²·s)。

4.如权利要求1所述的小球藻培养方法其特征是所述小球藻为原始小球藻。

5.一种执行如权利要求1-4任一所述的小球藻培养方法的设备，所述的设备包括具有搅拌设备的发酵罐、光合反应器，其特征是所述发酵罐底部具有异养出料口，顶部具有循环进料口；光合反应器的底部具有循环出料口和进气口，顶部具有自养进料口和排气孔，

所述发酵罐的异养出料口通过管道与异养循环泵入口相连接，所述异养出料泵出口通过管道与光合反应器的自养进料口相连，位于光合反应器底部的循环出料口与自养循环泵入口相连接，所述自养循环泵出口与位于发酵罐顶部的循环进料口通过管道相连接，所述的设备还包括二氧化碳与空气混合罐，所述二氧化碳与空气混合罐出口通过管道与位于光合反应器底部的进气口相连接。

6.如权利要求1所述的设备，其特征是所述光合反应器具有两端封闭的圆筒状容器和围绕圆筒状容器布置的光源，所述圆筒状容器采用透明材料制作，长径比为3-10。