CN104232720A - 一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：营养生长阶段将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养；持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为20～200μmol·m^-2·s^-1；诱导阶段向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为0.5～3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.5-1％；向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1-3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2～0.4L/min。本发明方法可以诱导雨生红球藻快速积累虾青素，方法简单，产量高，效果好。

Description

一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法

技术领域

本发明涉及微生物应用技术领域，主要涉及到一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法。

背景技术

虾青素(3，3′-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，C40H52O4)是一种广泛存在于自然界中的一种类胡萝卜素。与其它类胡萝卜素一样，它有一个很长的共轭双键，双键末端还含有不饱和的α-羟基酮，使得虾青素比普通类胡萝卜素具有更强的抗氧化活性，高于β-胡萝卜素10倍以上，是维生素E的550倍；其次，虾青素是唯一能够穿透血脑屏障的类胡萝卜素，因而在抗衰老、抗肿瘤、提高免疫力、预防心脑血管疾病方面有着显著作用，有被开发成为抗肿瘤药物的潜能。对天然虾青素生物学功能和药理药效研究表明它是一种安全健康的天然色素，在日本、美国、欧盟、加拿大，虾青素已被批准为安全的人类食品添加剂，用于食品的着色、保鲜、营养补充及用作珍贵鱼类和甲壳类动物和家禽的饲料添加剂，并且已经取得相应的商业化成功。

虾青素广泛存在于海洋环境生物中，如新鲜的大马哈鱼、虾以及蟹类中，然而在动物中并不能实现虾青素的从头合成，都是通过食物链从摄取的食物中获得。之前天然虾青素来源于磷虾油、小龙虾油和红法夫酵母，这些来源的虾青素含量只在0.15％到0.4％之间，不能满足市场高效利用的需求。然而，雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)藻源的虾青素是100％左旋(3S-3′S)结构，具有最强的生物学活性。其积累量最高可达藻细胞干重的4.0％，因此被认为是自然界中天然虾青素浓缩的工具。

在大规模开放系统生产利用雨生红球藻生生产虾青素时，一般把生产过程分为两步：营养生长，通过严格控制pH、温度和营养水平通过有利环境使雨生红球藻进行营养生长；得到足够的营养细胞后，改变培养条件，使藻细胞受到环境和营养胁迫，当雨生红球藻细胞受到氧化胁迫压力时，就开始积累虾青素，形成雨生红球藻囊胞。当积累足够量虾青素之后通过自然沉降和随后的离心进行采收。目前，文献报道关于雨生红球藻诱导虾青素主要集中于营养胁迫，光照以及部分植物激素。

鉴于此，本发明通过对雨生红球藻生产虾青素的过程深入研究，提出了一种利用乙醇、海水晶等诱导条件的刺激下致使雨生红球藻快速生产虾青素的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，用于高效生产虾青素。本发明对微生物的代谢规律进行研究，根据雨生红球藻的藻体快速生长期和藻体稳定期生长状况的不同对环境条件比如光照强度、温度、培养基中二氧化碳含量等进行调整，达到提高虾青素产量的目的。

为了达到上述目的以及一些其它目的，本发明采用的技术方案为：

一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为20～200μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为0.5～3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为1％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1-3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2～0.4L/min。

优选的是，所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法包括以下步骤：

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为22～28℃、持续光照强度为20～50μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1-3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2～0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、积累虾青素：将所述藻种接种于生产培养基中，在温度为22～28℃下进行生产虾青素；

步骤三、在积累虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

优选的是，向生产培养基或繁殖培养基中通入的经过滤的混合有二氧化碳的空气中二氧化碳的体积浓度为3％。

优选的是，藻种大量诱导积累虾青素过程中光照强度为200μmol·m^-2·s^-1。

优选的是，在积累虾青素过程中向所述生产培养基中加入乙醇和海水晶，

其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为3％，向所述

生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为1％。

优选的是，所述繁殖培养基为BG11培养基。

优选的是，所述生产培养基为不含硝酸钠的BG11培养基。

本发明的有益效果：

(1)在向生产培养基或繁殖培养基中通入的经过滤的混合有二氧化碳的空气可以提高生产培养基或繁殖培养基中二氧化碳含量，给雨生红球藻代谢生长提供充足的碳源，同时，气体的通入对培养基起到了一定的搅拌作用，使雨生红球藻接收到的光照强度更均匀，缩短生产虾青素的时间。

(2)在向生产培养基中加入乙醇和海水晶对雨生红球藻起到诱导其生产虾青素的作用。

(3)生产培养基为不含硝酸钠的BG11培养基，加之充足的光照条件、通入含二氧化碳的空气以及乙醇的诱导作用的综合影响，放大了单一条件下刺激雨生红球藻生产虾青素的产量，达到协同诱导效果。

(4)本发明方法简单易行、成本低廉、添加乙醇和海水晶后能很好的诱导雨生红球藻生产虾青素，使虾青素的产量显著增加，从而大大加快雨生红球藻虾青素积累过程，提高虾青素生产的效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明所用雨生红球藻藻株NIES-144购于日本筑波国家环境研究所，藻种保藏号为：NIES-144

实施例1

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为22℃、持续光照强度为20μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为22℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为20μmol·m^-2·s^-1；同时向营养培养基中加入乙醇，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为0.5％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.5％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

实施例2

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为24℃、持续光照强度为60μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为24℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为60μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为1％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.5％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

实施例3

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为26℃、持续光照强度为100μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.3L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为26℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为100μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为2％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.8％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.3L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

实施例4

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为26℃、持续光照强度为140μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.3L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为26℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为140μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为2％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.8％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.3L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

实施例5

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为28℃、持续光照强度为170μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为28℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为170μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为0.8％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.4L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

实施例6

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为28℃、持续光照强度为200μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为28℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为200μmol·m^-2·s^-1；同时向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为1％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.4L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

虾青素含量测定方法采用改良的Boussiba的虾青素测定方法：取1ml上述各实施例中的含有完全变红的藻种细胞的生产培养基于5000r/min离心5min，弃上清液得到藻细胞沉淀。加入5mL5％KOH和30％CH3OH的混合液于70℃水浴5min破坏叶绿素。5000r/min离心5min，弃上清液得到藻细胞沉淀。加入25μl冰醋酸和1ml DMSO(二甲基亚砜，上海生工)70℃水浴10min，期间不断摇匀，5000r/min离心5min，取上清液。重复抽提藻细胞沉淀3次直至藻体发白。虾青素DMSO抽提液用DMSO稀释一定倍数至合适OD范围，于492nm下测定虾青素含量OD492nm。单位体积雨生红球藻虾青素含量(C)按下列公式计算：C(mg/L)＝(4.5×A492×Va)/Vb计算公式中，A表示OD492值，Va表示二甲基亚砜的体积(稀释倍数*DMSO抽提次数)

对照组1

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为22℃，向所述繁殖培养基中通入经过滤的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、诱导虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为22℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为20μmol·m^-2·s^-1；其并向生产培养基中持续通入经过滤的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

对照组2

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为24℃、持续光照强度为60μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为24℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为60μmol·m^-2·s^-1；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

对照组3

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为26℃、向所述繁殖培养基中通入经过滤的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.3L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为26℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为100μmol·m^-2·s^-1；向生产培养基中持续通入经过滤的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.3L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

对照组4

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为26℃、持续光照强度为140μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.3L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为26℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为140μmol·m^-2·s^-1；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为2％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.3L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

对照组5

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为28℃、持续光照强度为170μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为28℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为170μmol·m^-2·s^-1；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.4L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

对照组6

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为28℃、持续光照强度为200μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、生产虾青素：将雨生红球藻接种于生产培养基，在温度为28℃下进行生产虾青素，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为200μmol·m^-2·s^-1；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.4L/min；

步骤三、在生产虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

检测结果为：

从上述结果可以看出，乙醇和海水晶的添加可以明显促进雨生红球藻中虾青素的积累，并且虾青素含量随着添加乙醇和海水晶量而提高，最高虾青素的产率达到12.66mg/L/day，最佳添加浓度为乙醇3％(v/v)，海水晶1％(m/v)。综上所述，通过在生产培养基中添加诱导剂乙醇和海水晶可以加速诱导雨生红球藻生产虾青素。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (7)

1.一种诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将雨生红球藻接种于营养培养基中进行培养，其中，在培养过程中持续保持对雨生红球藻的光照，并且保证到达雨生红球藻细胞表面的光照强度为20～200μmol·m^-2·s^-1；诱导阶段向生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为0.5～3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为1％；以及向生产培养基中持续通入经过滤的混合有体积浓度为1-3％的二氧化碳的空气，其通入量为每1L生产培养基中通入0.2～0.4L/min。

2.如权利要求1所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、藻种大量繁殖：将雨生红球藻接种到繁殖培养基中，在温度为22～28℃、持续光照强度为20～200μmol·m^-2·s^-1且同时持续向所述繁殖培养基中通入经过滤的混合有体积浓度为1-3％的二氧化碳的空气条件下进行繁殖，其通入量为每1L繁殖培养基中通入0.2～0.4L/min，直至到达雨生红球藻的对数生长期结束，获得大量藻种；

步骤二、积累虾青素：将所述积累藻种转移至生产培养基下，在温度为22～28℃下进行诱导虾青素积累；

步骤三、在诱导虾青素过程中，每隔24小时取样进行显微观察，直至所述藻种细胞内完全变红时结束。

3.如权利要求2所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，向生产培养基或繁殖培养基中通入的经过滤的混合有二氧化碳的空气中二氧化碳的体积浓度为3％。

4.如权利要求3所述的诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，藻种大量积累虾青素过程中光照强度为200μmol·m^-2·s^-1。

5.如权利要求4所述的诱导雨生红球藻积累虾青素的方法，其特征在于，在积累虾青素过程中向所述生产培养基中加入乙醇和海水晶，其中向所述生产培养基中加入的乙醇按体积百分比浓度计为3％，向所述生产培养基中加入的海水晶按质量百分比浓度计为1％。

6.如权利要求1～5中任一项所述诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述营养培养基为BG11培养基。

7.如权利要求1～5中任一项所述诱导雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述生产培养基为不含硝酸钠的BG11培养基。