CN1926243A - 含有虾青素的脂质的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是生产虾青素的方法，与以往方法相比，其通过改善绿藻雨生红球藻的培养方法，大大促进营养细胞增殖和虾青素生物合成，由该培养物高效地生产虾青素。具体为，在培养基中，使用AN/TN比为小于等于65％、优选小于等于43％、更优选小于等于35％的有机氮源，培养绿藻雨生红球藻，得到积累了含有虾青素的脂质的藻体，根据需要，进一步从该藻体中提取含有虾青素的脂质，按照要求将其进一步精制。

Description

含有虾青素的脂质的生产方法
技术领域
本发明涉及含有虾青素的脂质的生产方法，其特征在于：培养绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)，从培养物提取含有虾青素的脂质。
背景技术
虾青素是一种在动物界分布极广的红色类胡萝卜素，如存在于甲壳类的壳和卵、鲑鱼肉、红金眼鲷的表皮等，与肉色、体色的呈现有关。虾青素作为红色色素，被用作养殖大麻哈鱼、养殖真鲷的饲料发色剂(生物工学会志71(4)：233-237(1993))，此外，因其强抗氧化作用，人们正在研究其作为医药活性成分的应用(日本国特许第3163127号)。而且，虾青素已被用作健康食品的材料(Food Style 21，5(12)：25-35(2001))。
由于绿藻雨生红球藻在细胞内积累大量虾青素，因此，人们通过培养绿藻雨生红球藻生产虾青素(NatuRose Technical Bulletin #78，CyanotechCorporation(2000)；FoodStyle 21，5(12)：25-35(2001))。雨生红球藻生命周期的特征在于存在营养细胞和孢囊。所谓的营养细胞(vegetative cell)指具有二条鞭毛的卵形游动细胞，有胶状细胞壁。营养细胞的虾青素含量低，为10pg/cell左右(J.Ferment.Technol.74(1)：17-20(1992))。而孢囊(cyst，又名aplanospore，akinete)指球形细胞，其特征在于：在胶质的内侧有坚硬的细胞壁，无鞭毛，通过观察，可清楚地辨别营养细胞和孢囊。刚从营养细胞转变而来的孢囊，其虾青素含量低，呈褐色或红褐色，称为未成熟孢囊(brown-red immature cyst)。未成熟孢囊的虾青素含量为30pg/cell左右(Biotechnol.Lett.19(6)：507-509(1997))。如果具备合适的培养条件，随着培养时间的延长，孢囊细胞内的虾青素含量将会增加，颜色变为红色，这样的孢囊称为成熟孢囊(redmature cyst)。据报道，虾青素含量高的孢囊中虾青素含量高达613pg/cell(Biotechnol.Lett.16(2)：133-138(1994))。
有关通过培养雨生红球藻生产虾青素的生产条件的探讨，几乎集中在伴随光照射的光培养上，例如，采用室外池中利用太阳光培养雨生红球藻的方法、室外拱棚中利用太阳光培养雨生红球藻的方法，进行虾青素的工业生产(FoodStyle 21，5(12)：25-35(2001))。这是因为绿藻类一般通过光合作用获得能量，所以人们一直认为只有在明处才能进行增殖和虾青素的生产(生物工学会志，71(4)：233-237(1993))。就上述利用太阳光的光培养而言，虽然光照射所需能源成本和光照射装置的设备投资费用低，但在室外系统中需要有防止杂菌污染的措施。而在室内进行光培养时，存在光照射所需能源成本和照射设备投资费用高的问题。为了降低成本，人们进行了各种各样的研究。例如，据报道：为了提高光照射效率，采用管式反应器(J.Appl.Phycol.5：593-604(1993))、气升式光反应器(J.Ferment.Bioeng.82：113-118(1996))等进行培养。但这些技术要达到实际应用的程度，还有待改良。
为了解决上述问题，对不依靠光的暗培养进行了研究，发现：即使在暗处，通过以乙酸作为碳源，绿藻以营养细胞的形态增殖，而且，伴随着增殖，虾青素在细胞内积累(J.Ferment.Bioeng.74：17-20(1992))。还发现：采用提高培养基盐浓度的方法(Biotechnol.Lett.19(6)：507-509(1997))、利用通气等手段形成好氧条件的方法(本申请人的日本国特愿2002-294420)，即使暗培养，也能形成孢囊。
另一方面，以生产虾青素为目的培养雨生红球藻时，主要用无机氮作为细胞构建所需的培养基氮源，例如，硝酸盐(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：530-535(2000))、尿素(Appl.Microbiol.Biotechnol.，55：537-540(2001))。与此相反，就有机氮源而言，如脱脂大豆粉之类蛋白质含量高的氮源，由于其发泡性极好且含有较多水不溶性成分，所以在大型室外开放系统反应器等中难以混合均匀，而CSL(玉米浆)是糖精制的液体副产物，因此特别是如微生物混入量等品质不稳定，在培养基杀菌困难的室外开放系统反应器中，易成为微生物污染的原因。为了将成为杂菌污染主要原因的异养微生物的混入和增殖降至最低、而且使能通过光合作用自养增殖的绿藻的增殖处于更有利的优势，采用尽可能使培养基成分处于营养贫瘠状态的方法。由于上述原因，在培养藻类生产虾青素中，很少有关于使用有机氮源的报道。
[专利文献1]日本国特许第3163127号
[专利文献2]日本国特愿2002-294420
[非专利文献1]生物工学会志71(4)：233-237(1993)
[非专利文献2]Food Style 21，5(12)：25-35(2001)
[非专利文献3]NatuRose Technical Bulletin #78，CyanotechCorporation(2000)
[非专利文献4]J.Ferment.Technol.74(1)：17-20(1992)
[非专利文献5]Biotechnol.Lett.19(6)：507-509(1997)
[非专利文献6]Biotechnol.Lett.16(2)：133-138(1994)
[非专利文献7]J.Ferment.Bioeng.74：17-20(1992)
[非专利文献8]J.Appl.Phycol.5：593-604(1993)
[非专利文献9]J.Ferment.Bioeng.82：113-118(1996)
发明内容
本发明的目的在于提供生产含有虾青素的脂质的方法，与以往方法相比，其通过改善绿藻雨生红球藻的培养方法，大大促进营养细胞增殖和虾青素生物合成，由该培养物高效地生产含有虾青素的脂质。
本发明还提供生产虾青素的方法，其避免室外开放系统培养所伴随的杂菌污染问题，利用室内反应器或室外封闭系统培养，使绿藻雨生红球藻高效地增殖。在本专利申请书中，封闭系统指在密闭或半密闭容器内受控制的环境中进行培养，即意味：由于开放系统中绿藻暴露在不受控制的环境中而产生的易受天气(气温、湿度、光量等)、空中浮游微生物等周围环境变化影响的问题较少或可以不考虑。
本发明人等着眼于以往回避使用的有机氮源，对其影响反复进行潜心研究，发现：总氮中所占氨基态氮的比例(AN/TN比)低的有机氮源对绿藻雨生红球藻的细胞增殖及虾青素合成有效，从而完成了本发明。
本发明的方法包括：在培养基中，使用AN/TN比为小于等于65％、优选小于等于43％、更优选小于等于35％的有机氮源，培养绿藻雨生红球藻，得到积累了含有虾青素的脂质的藻体，根据需要，进一步从该藻体提取含有虾青素的脂质，按照要求将其进一步精制。
虾青素
经绿藻雨生红球藻生物合成的虾青素(3，3’-二羟基-β，β-胡萝卜素-4，4’-二酮)以游离型和酯型在细胞内积累。作为酯型，例如，虾青素单脂肪酸酯、虾青素二脂肪酸酯(J.Ferment.Bioeng.71：335-339(1991)；Phytochemistry20：2561-2564(1981))。在本发明中，含有虾青素的脂质意味着上述游离型虾青素和/或酯型虾青素的单品或混合物，还意味着虾青素及含有虾青素的来源于雨生红球藻藻体的脂溶性成分混合物。
绿藻
本发明使用的绿藻雨生红球藻是在淡水中生存的单细胞绿藻类，例如Haematococcus pulvialis ASTB BS2，CALU 9，CALU333，CAUP G1002，CCAO，IBASU 38，IPPAS H-23，MUR 01，02，62，63，64，65，66，67，68，69，71，72，75，76，77，NIES 144，NIVA CHL9，SMBA(″World Catalogue of Algae″p.132-133，Japan Scientific Societies Press(1989))。在Haematococcuslacustris中也存在与雨生红球藻相同的藻类，例如ATCC 30402，SAG 34-1a，1b，1c，1d，1e，1f，1h，1k，1l，1m，1n，UTEX 16(″World Catalogue ofAlgae″p.132-133，Japan Scientific Societies Press(1989))。
绿藻雨生红球藻的营养细胞(vegetative cell)通常具有二条鞭毛，以游动细胞的形态存在，与绿藻衣藻同样，在母细胞的细胞壁内分裂增殖。营养细胞的四周具有胶状细胞壁。如果具备合适的培养条件，营养细胞在胶质的内侧形成坚硬的厚细胞壁，细胞最终停止游动，无性地或有性地形成孢囊(cyst，又名aplanospore，akinete)，该孢囊具有坚硬的细胞壁且能大量积累含有虾青素的脂质，如果具备合适的培养条件，将积累大量虾青素，从未成熟孢囊向成熟孢囊转变(J.Ferment.Bioeng.84(1)：94-97(1997))。如上所述，在绿藻雨生红球藻的生命周期中存在营养细胞和孢囊，两者通过观察即可容易地辨别。培养基
在下述条件下，进行雨生红球藻的培养。
基本培养基：基本培养基可以从BM4培养基(组成参照实施例1)、专利文献1～2、非专利文献4～9、Appl.Microbiol.Biotechnol.，53：530-535(2000)以及Appl.Microbiol.Biotechnol.，55：537-540(2001)中记载的培养基等绿藻类增殖用培养基中适宜地选择。
有机氮源：根据本发明，作为添加于基本培养基的有机氮源，使用总氮中所占氨基态氮的比例(AN/TN比)低的有机氮源。这里所谓的氨基态氮指肽中含有的氨基酸残基的氮以外的氮，主要指游离氨基酸中的氮。理想的有机氮源的AN/TN比为小于等于65％、优选小于等于43％、更优选小于等于35％。
添加于培养基的有机氮源的浓度优选大于等于0.1g/L。
作为AN/TN比小于等于65％的氮源，例如脱脂大豆粉、酪蛋白、CSL(玉米浆)等，可以单独或多种组合使用。而且，脱脂大豆粉分解后生成的大豆肽、酪蛋白分解后生成的蛋白胨、胰蛋白胨、多聚蛋白胨等也可以单独或多种组合使用。只要是AN/TN比小于等于65％的有机氮源均可使用，不受任何限制，优选将脱脂大豆粉或CSL单独使用或与其他氮源组合使用。除上述氮源外，还可以使用已知(日本国特许第3163127号)氮源，例如硝酸盐、尿素、铵盐等无机氮源；天冬酰胺、甘氨酸、谷氨酰胺等氨基酸、或AN/TN比超过65％的酵母提取物等有机氮源。
有机氮源的AN/TN比小于等于65％、优选小于等于43％、更优选小于等于35％的确认可通过下述方法进行，即：用范斯莱克法测定氨基态氮(AN)，用凯氏定氮法测定总氮(TN)，计算AN和TN的测定值之比，求得AN/TN。
碳源：绿藻雨生红球藻是自然界中利用二氧化碳和光能生长繁殖的光合生物。因此，可以进行光培养，使其以二氧化碳为碳源自养增殖。此时，在培养基中不添加碳源也可以使其增殖，或者根据要求也可以在光培养中使用下述碳源作为异养营养。在本专利申请书中所谓的明处，典型的指具有白天亮度的场所，但也包括检查培养设施时所需最低限度亮度以上的场所。
绿藻雨生红球藻也可以进行暗培养。此时，需采用这样的培养基，该培养基含有充足的能代替二氧化碳的异养营养碳源(生物工学会志，71(4)：233-237(1993))。作为碳源，除了已知的乙酸、丙酮酸、乙醇、与TCA相关的有机酸等(日本特开平11-56346)外，还可以使用糖、脂肪酸、脂肪酸酯及油脂等。作为与TCA相关的有机酸，例如柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、延胡索酸、苹果酸等(日本国特许第3163127号)。上述物质均可作为碳源，优选使用乙酸(J.Ferment.Bioeng.74(1)：17-20(1992))。
培养基中使用碳源的量大于等于0.01g/L。
如本领域技术人员所知，本专利申请书中暗培养这一用语，不仅指完全黑暗的场所，还包括所有非有意识的照明且在培养基中添加碳源使其异养增殖的情况。因此，为了检查培养情况而暂时照明或进行持续低强度照明的场合也属于本发明所谓的暗培养。
除上述培养基成分外，为了促进虾青素合成，还可以添加产生二价铁离子(Fe2+)的无机盐类、H2O2等以给与氧化应激(生物工学会志，71(4)：233-237(1993))。
前培养
对雨生红球藻进行液体培养，为了得到其藻体或含有虾青素的脂质，先将保藏藻体接种于少量培养基中，然后，向大容积的培养基中依次接种并放大，主培养意味着以回收藻体或含有虾青素的脂质为目的进行的最终阶段的培养。此外，前培养意味着依次传代的同时进行的放大过程中各个阶段的培养。
作为前培养条件，采用光培养使其自养增殖或异养增殖，或采用暗培养使其异养增殖，任一方法均可。此外，由前培养得到的细胞形态可以是营养细胞或孢囊中的任意一种。向主培养接种的藻体越多越好，因此，在前培养中优选用增殖能力更高的营养细胞进行培养。
就培养温度而言，在前培养和下述主培养中，营养细胞以15℃～25℃为宜，优选20℃左右，而孢囊以25℃～35℃为宜，优选30℃左右。
主培养
向主培养接种的前培养的藻体越多越好。从前培养向主培养接种的细胞形态可以是营养细胞或孢囊中的任意一种，在主培养中，优选诱导孢囊形成以提高虾青素含量。
在暗处进行主培养时，为了诱导孢囊形成以提高虾青素含量，需要好氧的条件。形成好氧的条件的方法有：从培养液上面向液体中扩散氧气、通过振荡或搅拌培养液卷入空气、向培养液中通入空气、向培养液中通入空气并搅拌等方法，上述方法可单独或组合使用。其中，优选向培养液中通气，更优选以大于等于0.01vvm的相对通气量通气，但考虑到通气成本及通气过多引起的发泡问题，进一步优选以0.01vvm～1vvm、更进一步优选以0.1vvm～0.5vvm通气。
在明处进行主培养时，能自然诱导孢囊形成，提高虾青素含量。
本发明的方法采用新的培养基组成进行培养，在主培养中得到更多虾青素含量高的雨生红球藻藻体，使细胞增殖和虾青素合成增加，从而可以得到更多含有虾青素的脂质。与以往使用无机氮源或使用如AN/TN比超过65％的酵母提取物之类有机氮源的方法相比，利用本发明的方法，含有虾青素的脂质的生产效率至少提高1.5倍，例如，约2～4倍。例如，由本发明得到的虾青素量，以单位培养液浓度表示时，至少为10mg/L、优选至少为15mg/L、更优选至少为20mg/L、进一步优选至少为25mg/L，以单位细胞的量表示时，至少为40pg/细胞、优选至少为50pg/细胞、更优选至少为60pg/细胞、进一步优选至少为70pg/细胞、更进一步优选至少为80pg/细胞。如此调节培养基的AN/TN比，能提高含有虾青素的脂质或虾青素的生产效率。这样就使小型反应器的使用成为可能，因此，既可以实现均匀混合，又可以稳定地控制质量。
具体实施方式
作为达到本发明目的的具体例子，例如有暗培养法，但不限于此。首先，将绿藻雨生红球藻接种于前培养培养基。就前培养培养基的组成而言，例如，采用在乙酸钠1.2g/L、氯化镁六水合物0.2g/L、硫酸亚铁七水合物0.01g/L、氯化钙二水合物0.02g/L中添加了CSL 1g/L或脱脂大豆粉1.0g/L的前培养培养基。接种于培养基后，在培养温度20℃下开始前培养(第一阶段)。在前培养中，使其以营养细胞的形态增殖，培养4日。接着，将此培养液接种到下一阶段的前培养(第二阶段)培养基中。可根据主培养液量的要求，确定适宜的前培养阶段数，在前培养的每个阶段，重复同样的接种操作。从前培养向主培养接种时，可以采用直接将前培养液接种于主培养培养基的方法，优选采用下述方法：将前培养液离心并去除上清液后浓缩得到的藻体悬浮液接种于主培养培养基。作为主培养的培养基，例如，初始培养基采用在乙酸钠2.5g/L、氯化镁六水合物0.2g/L、硫酸亚铁七水合物0.01g/L、氯化钙二水合物0.02g/L中添加了CSL 1.0g/L或脱脂大豆粉1.0g/L的培养基，流加培养基采用乙酸钠3.7g/L(单位培养基浓度)。向主培养培养基中接种相当于主培养培养基量10％的前培养液量的藻体后，在培养温度30℃、相对通气量0.5vvm下，培养8日。光培养时，除光照射外，可以用与上述暗培养例相同的方法进行培养。本发明的特征在于：用AN/TN比为小于等于65％的有机氮源作为培养基成分，从而促进细胞增殖和虾青素合成，通过实施本发明的培养方法，可以获得比用以往的培养基培养时更多的含有虾青素的脂质。
藻体的回收
作为含有虾青素的脂质的收集方法，首先，主培养结束后，将培养液直接或实施杀菌、浓缩等处理后，用自然沉降、离心分离、过滤等已知的固液分离方法回收雨生红球藻藻体。为了促进固液分离，可以添加凝集剂、助滤剂。可以用氯化铝、氯化钙、海藻酸钠、壳聚糖等作凝集剂。助滤剂可以使用硅藻土。接着，优选将已回收的藻体破碎，也可以不破碎。藻体破碎可以采用玻璃球研磨破碎法、渗透压法、使用French压力机的方法、使用Manton-Gaulin匀质机(Manton-Gaulin Homogenizer)的方法、冰冻法、使用挤出造粒机的方法、超声波破碎法等已知方法中的任一方法，上述方法也可以组合使用。优选将藻体干燥，也可以不干燥。藻体干燥可以采用流化床干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等已知方法中的任一方法，上述方法也可以组合使用。此外，将培养液直接或先实施灭菌、浓缩等处理后，通过用鼓式干燥机、具有加热功能的造粒机等机器处理，能同时进行藻体回收、破碎、干燥。
可直接将上述回收的藻体(即破碎、干燥前)或将实施破碎、干燥等处理后的藻体作为虾青素使用，用途广泛。例如，可用作养鱼的饲料发色剂。
提取·精制
从上述得到的藻体中，进一步通过甲醇、乙醇、己烷或丙酮等有机溶剂提取、超临界二氧化碳提取或压榨提取，可以回收含有虾青素的脂质。在得到的含有虾青素的脂质中，构成成分的大多数为虾青素单脂肪酸酯，其他的构成成分包括虾青素二脂肪酸酯、游离型虾青素(J.Ferment.Bioeng.71：335-339(1991)；Phytochemistry 20：2561-2564(1981))。
再进一步从含有虾青素的脂质中通过适宜地利用液相色谱法、分子蒸馏等已知的分离精制手段，可以获得虾青素或含有所需纯度虾青素的脂质。
如上所述，随着光照反应器、暗培养法的开发，使室内培养进行生产成为可能。在室内培养及室外封闭系统培养中，能更好地进行培养基杀菌等微生物管理，因此能在更好的管理条件下使用有机氮源，而在以往的室外开放系统培养方法中，由于杂菌污染等制约条件而无法使用有机氮源。
[实施例]
雨生红球藻培养实验
实施例1培养基组成对孢囊生产虾青素的影响
采用绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)NIES-144。前培养的培养基采用在基本培养基(BM4培养基：乙酸钠2.4g/L、氯化镁六水合物0.2g/L、硫酸亚铁七水合物0.001g/L、氯化钙二水合物0.002g/L)中加入酵母提取物2g/L和硝酸钾1g/L、调至pH6.8、在121℃下灭菌20分钟后的培养基。在200mL锥形烧瓶中配制培养基100mL，在20℃下，静置培养4日。然后进行主培养，在200mL锥形烧瓶中配制表1所示的各种培养基100mL，将上述前培养液以10％(v/v)接种，在温度30℃下，在暗处开始振荡培养。在培养第3日和第6日，添加乙酸钠3.7g/L(单位培养液量浓度)，培养8日。
培养基中使用的有机氮源的AN/TN比：酵母提取物为小于等于67％、CSL为小于等于33％，大豆粉为小于等于2％。
将培养液适当稀释悬浮后，用Thoma血球计数板测量细胞数，从而进行细胞浓度的测定。虾青素浓度的测定方法：用玻璃纤维滤纸抽滤回收细胞，将玻璃纤维滤纸和细胞一起在乳钵中破碎后，进行丙酮提取。测定离心得到的丙酮溶液上清液的吸光度(波长480nm、750nm)，求得类胡萝卜素浓度(″A PracticalHandbook of Sea Water Analysis″p.185-206，Fisheries Research Board ofCanada(1968))。已经证实在雨生红球藻的孢囊细胞中积累的类胡萝卜素几乎全是虾青素(J.Ferment.Bioeng.71(5)：335-339(1991))，因此用得到的类胡萝卜素浓度表示虾青素浓度。
培养后，通过离心分离，回收藻体，通过丙酮提取，回收含有虾青素的脂质。
培养的结果：得到的虾青素浓度在各个条件下分别为1-1)6.3mg/L、1-2)10.8mg/L、1-3)25.9mg/L、1-4)21.5mg/L、1-5)26.7mg/L、1-6)19.9mg/L。就细胞形态而言，通过显微镜观察证实在任一条件下均形成孢囊。
以往，在雨生红球藻的培养中使用CSL和大豆粉的培养方法不被人所知。由本实施例可知，使用添加了CSL和/或大豆粉的新型培养基，能使单位细胞的虾青素含量和细胞浓度增加，由于虾青素浓度增加，从而可以回收更多含有虾青素的脂质。
[表1]
条件No. 培养基组成   单位培养液量的虾青素浓度(mg/L)   单位培养液量的细胞浓度(×105cells/mL)   单位细胞的虾青素含量(pg/cell)
1-1)1-2)1-3)1-4)1-5)1-6)   BM4培养基+酵母提取物2g/L+KNO3 1g/LBM4培养基+CSL 0.1g/LBM4培养基+CSL 1.0g/LBM4培养基+大豆粉0.1g/LBM4培养基+大豆粉1.0g/LBM4培养基+CSL 0.1g/L+大豆粉0.1g/L 6.310.825.921.526.719.9 2.02.63.63.44.03.6 31.841.571.963.266.855.3
CSL：玉米浆
大豆粉：脱脂大豆粉
实施例2新培养基组成对营养细胞增殖的影响
采用绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)NIES-144。
在与实施例1相同的条件下，进行前培养。接着进行主培养，在200mL锥形烧瓶中配制表2所示的各种培养基100mL，将上述前培养液以10％(v/v)接种，在温度16℃下，暗处静置培养6日。有机氮源的AN/TN比同实施例1。
培养的结果：得到的营养细胞浓度，在酵母提取物/硝酸钾培养基中为4.46×105cells/mL、在添加CSL的培养基中为7.07×105cells/mL、在添加大豆粉的培养基中为7.45×105cells/mL。
[表2]
条件No. 培养基组成   单位培养液量细胞浓度(×105cells/mL)
1-1)1-2)1-3)   BM4培养基+酵母提取物2g/L+KNO3 1g/LBM4培养基+CSL 1.0g/LBM4培养基+大豆粉1.0g/L 4.467.077.45
CSL：玉米浆
大豆粉：脱脂大豆粉
实施例3新培养基组成对营养细胞增殖的影响
采用绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)NIES-144。
在与实施例1相同的条件下，进行前培养。接着进行主培养，在200mL锥形烧瓶中配制表3所示的各种培养基100mL，将上述前培养液以10％(v/v)接种，在温度20℃下，暗处静置培养5日。
培养基中使用的有机氮源的AN/TN比：酵母提取物为67％、胰蛋白胨为40％、蛋白胨为38％、多聚蛋白胨为42.6％。
培养的结果：得到的营养细胞浓度，在酵母提取物/硝酸钾培养基中为3.4×105cells/mL、在添加胰蛋白胨的培养基中为5.7×105cells/mL、在添加蛋白胨的培养基中为7.4×105cells/mL、在添加多聚蛋白胨的培养基中为4.4×105cells/mL。
[表3]
条件No. 培养基组成   单位培养液量细胞浓度(×105cells/mL)
1-1)1-2)1-3)1-4)   BM4培养基+酵母提取物2g/L+KNO3 1g/LBM4培养基+胰蛋白胨1.0g/LBM4培养基+蛋白胨1.0g/LBM4培养基+多聚蛋白胨1.0g/L 3.45.77.44.4
实施例4培养基组成对光培养中孢囊生产虾青素的影响
采用绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)NIES-144。
前培养的培养基采用在基本培养基(BM4培养基：乙酸钠2.4g/L、氯化镁六水合物0.2g/L、硫酸亚铁七水合物0.001g/L、氯化钙二水合物0.002g/L)中加入酵母提取物2g/L和硝酸钾1g/L、调至pH6.8后的培养基。在200mL锥形烧瓶中配制培养基100mL，在20℃下，静置培养4日。然后进行主培养，在200mL锥形烧瓶中配制表4所示的各种培养基100mL，将上述前培养液以10％(v/v)接种，在温度30℃下，在明处(照度2000勒克司)开始振荡培养。在培养第3日添加乙酸钠3.7g/L(单位培养液量浓度)，培养6日。
培养的结果：得到的虾青素浓度在各个条件下分别为1-1)8.2mg/L、1-2)14.2mg/L、1-3)32.0mg/L、1-4)25.0mg/L、1-5)32.0mg/L、1-6)24.1mg/L。就细胞形态而言，通过显微镜观察证实在任一条件下均形成孢囊。
以往，在雨生红球藻的培养中使用CSL和大豆粉的培养方法不被人所知。由本实施例可知，使用添加了CSL和/或大豆粉的新型培养基，能使单位细胞的虾青素含量和细胞浓度增加，由于虾青素浓度增加，从而可以回收更多含有虾青素的脂质。
[表4]
条件No. 培养基组成   单位培养液量的虾青素浓度(mg/L)   单位培养液量的细胞浓度(×105cells/mL)   单位细胞的虾青素含量(pg/cell)
1-1)1-2)1-3)1-4)1-5)1-6)   BM4培养基+酵母提取物2g/L+KNO3 1g/LBM4培养基+CSL 0.1g/LBM4培养基+CSL 1.0g/LBM4培养基+大豆粉0.1g/LBM4培养基+大豆粉1.0g/LBM4培养基+CSL 0.1g/L+大豆粉0.1g/L 8.214.232.025.034.125.5 2.22.93.93.64.53.9 37.349.082.169.475.865.4
CSL：玉米浆
大豆粉：脱脂大豆粉
实施例5新培养基组成对营养细胞增殖的影响
采用绿藻雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)NIES-144。
在与实施例1相同的条件下，进行前培养。然后进行主培养，在200mL锥形烧瓶中配制表5所示的各种培养基100mL，将上述前培养液以10％(v/v)接种，在温度16℃下，明处(照度1500勒克司)静置培养3日。
培养的结果：得到的营养细胞浓度，在酵母提取物/硝酸钾培养基中为4.3×105cells/mL、在添加CSL的培养基中为6.9×105cells/mL、在添加大豆粉的培养基中为7.3×105cells/mL。
[表5]
条件No. 培养基组成   单位培养液量的细胞浓度(×105cells/mL)
1-1)1-2)1-3)   BM4培养基+酵母提取物2g/L+KNO3 1g/LBM4培养基+CSL 1.0g/LBM4培养基+大豆粉1.0g/L 4.36.97.3
CSL：玉米浆
大豆粉：脱脂大豆粉

Claims (8)

1.含有虾青素的脂质的生产方法，其包括：在培养基中，作为氮源，用AN/TN比为小于等于65％、优选小于等于43％、更优选小于等于35％的有机氮源，培养绿藻，得到积累了虾青素的藻体。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括：从得到的藻体中提取含有虾青素的脂质，根据需要将该脂质进一步精制。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，有机氮源是从由玉米浆、大豆粉、蛋白胨、胰蛋白胨及多聚蛋白胨构成的物质组中选择的至少一种有机氮源。
4.根据权利要求1～3任意一项所述的方法，其中，使用大于等于0.1g/L的有机氮源。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在暗处的反应器内进行培养。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在好氧的条件下进行培养。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，在明处的室内反应器或室外封闭系统中进行培养。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，积累的虾青素至少为单位培养液的浓度10mg/L、或40pg/细胞。
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