CN1276073C - 微生物及其类胡萝卜素化合物类产品 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种从易得原料中简便、有效地制备大量虾青素和角黄素的方法。一种能制备虾青素和角黄素的微生物Thraustochytrium sp.CHN-3(FERM P-18556)，属于Labyrinthula属Thraustochytrium种，将其进行培养，虾青素和角黄素在微生物细胞内积聚。然后从培养液中分离出细胞，通过溶剂提取从分离出的细胞收集虾青素和角黄素。

Description

微生物及其类胡萝卜素化合物类产品
技术领域
本发明涉及到一个属于Labyrinthula属Thraustochytrium种的新微生物菌株，及一种使用微生物制备虾青素(astaxanthin)和角黄素(canthaxanthin)之类天然类胡萝卜素化合物的方法。
背景技术
虾青素和角黄素属于染料化合物，广泛分布于微生物细胞、巨藻、微藻和多种动植物体内，常用作抗衰老药、解毒药、抗癌药及鱼苗的颜色改进剂。
已经从甲壳类动物的壳里提取出天然类胡萝卜素中的虾青素，但这些动物体内此类化合物的含量相当低，而且提取相当困难。此外，甲壳类动物作为生物资源存在于有限的海域且难于保证其稳定的供给，这类资源不适于工业化生产。
利用红色酵母菌Phaffia rhodozyma可制得虾青素，但该类酵母菌的生长速度慢，虾青素的产率很低。此外，由于该类酵母菌具有坚硬的细胞壁，制备出的虾青素很难提取出来。另外，由于一种化学结构上与天然虾青素取向相反的异构体(3R，3R’)的含量很高，虾青素的产率不可避免的变低。
已知Haematococcus pluvialis可用于制备虾青素。但由于该藻类的生长速度缓慢而且细胞壁坚硬，虾青素的产率也很低。此外，该藻类的生长受很多限制易被细菌污染，要求采用特殊的培养设备在强光照射条件下进行培养，因而，虾青素的工业生产涉及很多的问题。
角黄素分布于某些种类的蘑菇、鱼和甲壳类动物中，已知可通过Brevibacterium属和Rhodococcus属的某些微生物来制备。化学合成角黄素的方法也在发展，但由于产率低而无法在工业上应用。
发明内容
基于以上情况，本发明的目的是提供一种能够从容易获得的原料中简单、有效、大规模地制备虾青素和角黄素的方法，克服了常规方法的弊端。
本发明的发明人对从日本内海收集的海里微生物的生态学进行了大量的研究，发现了新的微生物，在这些微生物的细胞内虾青素和角黄素有较高的产率。通过培养这些微生物能有效制备虾青素和班蟊素，基于这一点完成了本发明。
因而，本发明提供了一种新分离出的Labyrinthula属Thraustochytrium种的微生物——Thraustochytrium sp.CHN-3(FERM P-18556)，可用于制备虾青素和角黄素，本发明还提供了一种制备虾青素和角黄素的方法，包括下述步骤：微生物培养；使虾青素和角黄素在微生物细胞内积聚；从培养基中分离出微生物细胞；通过溶剂提取从分离出的细胞中得到虾青素和角黄素。
附图说明
图1是本发明的微生物在电子显微镜下的照片。
图2显示了Thraustochytrium种微生物的生命周期。
图3是实施例1中培养物的高效液相色谱。
图4是一张图表，显示了虾青素的产量和培养基的pH值之间的关系。
图5图示了例6中虾青素的产量和生物量和培养基的pH值之间的关系。图中，AX表示虾青素，BM表示生物量，下列各图中的含义与之相同。
图6图示了虾青素的产量和氮源种类之间的关系。在该图中，CX表示角黄素，PX表示酚黄素。下列各图中的含义与之相同。
图7图示了类胡萝卜素的产量和光的有/无以及光源的种类之间的关系。
图8图示了类胡萝卜素的产量和碱的浓度之间的关系。在该图中，CT表示胡萝卜素。
图9图示了类胡萝卜素的产量和盐的浓度之间的关系。
图10图示了类胡萝卜素的产量和加入的硫胺素的量之间的关系。在该图中，ES表示虾青素脂肪酸酯。
本发明的具体实施方式
下面将参照附图详细描述本发明。
图1是电子显微镜下的照片，显示了本发明的微生物的形状。如图所示，本发明的微生物有细胞组成，具有Thraustochytrids Thraustochytrium微生物特有的球形或椭圆体的细胞外网(net)。细胞只在一个位点上有sagenogenetosome，并且通过细胞外网的扩增侵入或粘着于底物上。参照这一特征，断定该微生物属于Thraustochytrids。
确立图2所示的生命周期，阿米巴样细胞在培养基中出现，该培养基富含糖类，如葡萄糖和果糖，富含有机质，如蛋白质类的酵母提取物和玉米浸泡液。由于该微生物的上述特征极大不同于Ulkenia属的微生物，在形成有两种鞭毛的游动孢子上也不同于Schizochytrium种的微生物，因此认定其属于Thraustochytrium种。在基于18SrDNA的进化树中，进一步确认了该微生物属于Thraustochytrium种。
本发明的微生物之所以被分到Labyrinthula属Thraustochytrium种，是因为本发明的微生物的营养细胞是卵形或球形的，很容易与纺锤形的Labyrinthula种的微生物区别开来。这一类型的微生物广泛分布于海洋环境，是已知的所谓的异养增殖的海里微生物。
从下述微生物特征看，本发明的微生物很容易与已知的微生物区别开。
I.形态学特征
(1)胞呈卵形，直径10μm。
(2)10μm的卵形游走孢子，有不等鞭毛以便运动。
II.培养的特点
(1)细胞呈粉色，表面光滑，在糖类琼脂培养基中迅速生长。
(2)液体培养基在24小时内变浑浊，且培养基变成粉色。
从每公升培养基中至少获得30g生物量。
III.生理学特征
(1)含有虾青素和角黄素，细胞呈粉色。
(2)细胞增殖使用有机或无机氮源。
(3)最佳生长条件包括使pH值在5-9之间，温度在15-35℃之间。
(4)细胞使用葡萄糖和果糖制备出大量的DHA和EPA。
迄今为止，已知Labyrinthula属Thraustochytrium种的菌株都不含有高浓度的DHA和染料。细菌学上的测试结果都是阴性的，进一步确认了本发明的微生物不属于细菌。
本发明的微生物，或Thraustochytrium sp.CHN-3，已在国际专利生物保藏单位，独立行改法人产业技术综合研究所(Central 6，1-1-1 Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，305-8566，Japan)进行了保藏，保藏号FERM P-18556。
本发明的微生物是一种在海中生存的单细胞微生物，约10μm大小，从海水，如日本内海(Inland Sea)的海水中，很容易收集到。为了收集这些细胞，应使黑松树(Pinus thunbergii)的花粉悬浮于海水中，保持几天，然后从海水中分离出花粉并收集沉积于花粉上的微生物体。
上述方法收集到的花粉应进行纯化培养，可以用糖类培养基或者也可以用富含糖和蛋白胨的培养液(例如，每升海水中含30到50g葡萄糖和1g蛋白胨的培养基)。纯化培养优选在通风、搅拌、有持续光照(优选波长420-470nm的蓝光)的条件下进行。波长600-700nm的红光可与蓝光同时作为照射光源。
按该方法，将培养所得的Thraustochytrium细胞置于研钵研磨中，用100％的丙酮对这些研磨细胞进行提取。提取物通过装备有ODSC18柱的高效液相色谱分离，通过液质联用加以鉴定。所得液相色谱的色谱见图3(参见例1)。分析结果显示染料由α-和β-胡萝卜素，海胆酮，角黄素、酚黄素和虾青素组成。
本发明的Thraustochytrium sp.CHN-3产生α-和β-胡萝卜素，海胆酮，角黄素、酚黄素和虾青素，并在细胞中通过积聚大量的虾青素和角黄素产生红色。现在已知的Thraustochytrium种所属的Labyrinthula属的微生物都不具有这种能力。
Thraustochytrium sp.CHN-3，归类为Labyrinthula属Thraustochytrium种的微生物——可以在含有糖、有机氮和无机盐的培养基(培养液)中进行培养。
糖的例子包括葡萄糖、蔗糖、果糖和那些含有它们的，如浓麦芽糖汁。有机氮的例子包括蛋白胨和酵母提取物，无机盐的例子包括氯化钠、氯化钾和无机磷酸盐。
微生物Thraustochytrium sp.CHN-3的生长要利用到葡萄糖、有机氮、光能和无机磷，光照强度、温度、培养基中的营养组合物及供氧量应适当控制以使产率最高。
在含有高浓度盐的强碱性培养基中进行培养可以得到最佳结果。
纯化培养条件包括，如搅拌通风，照度为1000lux或更高的蓝光照射，以及在20-30℃之间、优选约28℃的温度。培养基中磷的供应源优选KH2PO4，且其浓度在0.1到3g/L之间。细胞在特定的培养基中进行培养，该培养基含有一定范围内允许Labyrinthula属微生物生长的组合物(每升海水中含60g葡萄糖、1g蛋白胨和1g KH2PO4或每升海水中含30g葡萄糖、1g蛋白胨和1g酵母提取物)。在细胞生长末期，通过把培养基中营养成分的浓度调至给定范围内，虾青素或角黄素的产率均可有选择性的提高。
本发明的方法中使用的无机盐包括氯化钠和氯化钾，且盐的浓度按重量比优选在4至10％之间。
本发明的方法中使用的碱性物质的例子包括碳酸钾和碳酸钠。培养基的pH值希望为9或更高，优选约为10。当培养基的适宜pH值在4到12之间，或优选6到10之间时，pH值提高，产率提高。在添加维生素化合物，尤其是硫胺素时，虾青素的收率显著提高，而且在加入上述添加剂时硫胺素在培养基中的浓度高达5mg/升。当加入大量的硫胺素时会生成虾青素的脂肪酸酯，尽管产物脂肪酸酯的量很小。
如上所述，通过改变培养条件，尤其是改变氮源组合物，强烈刺激Thraustochytrium种微生物的增殖，虾青素和角黄素的产率能进一步提高。例如，本发明所使用的氮源的包括尿素、铵盐(アンモニア)和硝酸钾，它们的加入量按重量比高达2％，优选不超过1％。
相应地，使得微生物生产虾青素和角黄素的能力最大化是相当有利的，可通过把Thraustochytrium种微生物的生长环境维持在一种高盐浓度的最终条件下，以获得较高产率的虾青素和角黄素。将酵母提取物的最终浓度调低对于该目标而言是有效的。
通过还原培养基中作为氮源的一定量的酵母提取物，每克干燥的细胞中虾青素的含量提高至1.537mg。当虾青素的含量提高时，培养基变为不含酵母提取物的培养液。这时，因为培养基中不含已被引入Thraustochytrium种微生物细胞中的氮，每克干燥的细胞中虾青素的含量提高至大约2mg。
按本发明的方法制备虾青素时，在最初阶段，细胞在添加了酵母提取物的培养基中进行培养，而在酵母提取物消耗完之后不再补充氮源，在不含氮源的培养基中继续培养。如上述方法在不含氮源的介质中培养使得虾青素的产率成五倍或更多倍的提高，相对在培养基中加入氮源所获得的收率。在富含氧的通气条件下培养细胞，虾青素的收率可以进一步提高。
为了制备角黄素，最初阶段微生物在添加了酵母提取物的培养基中培养，在酵母提取物消耗完之后补充氮源以维持培养条件，在该条件下氮源一直存在且呈弱酸性。在加入无机氮如硝酸钾作为氮源的培养基中培养，角黄素的产率提高(参见图6)。角黄素的收率成四、五倍或更多倍的提高，如同细胞在不含氮介质中培养所获得的收率。
为了从含有大量虾青素和角黄素的微生物细胞中有效提取所得的虾青素和角黄素，对细胞进行提取时优选使用丙酮、氯仿、甲醇和正己烷或它们的混合物。
于是，制得的虾青素和角黄素从细胞中分离至提取物中。接着，提取物上硅胶柱吸附类胡萝卜素，以甲醇或正己烷/氯仿混合溶剂洗脱，得到收率为100％的虾青素和角黄素。所用的甲醇混合溶剂含有90至95％体积比的甲醇，其余为氯仿。当正己烷-氯仿混合溶剂用于洗脱时，该混合溶剂包括60至65％体积比的氯仿，其余为正己烷。
下面参照实施例详细描述本发明，但本发明绝不限于这些实施例。
实施例1
从日本内海沿岸Nagahama区的海岸取样的海水，使Pinus Thunbergii的花粉悬浮于其中，以该方式从Thraustochytrium sp.CHN-1中纯化得到纯Thraustochytrium sp.CHN-3微生物，将其接种于糖类培养基(pH5.0)，该培养基是含60g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的磷酸二氢钾和1g/L的磷酸盐离子形式的磷的海水。细胞在28℃、通风、搅拌、以1000lux的白光照射的条件下培养6天(光来自荧光灯)。所得培养液离心分离收集微生物细胞。上述细胞的电子显微照片见图1。
细胞用丙酮、氯仿和甲醇提取，提取物过硅胶柱(商品名Wako gel，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.制造)以吸附产物。接着，硅胶柱以正己烷和甲醇成功洗脱，每升培养液得到8.8mg的虾青素和6.5mg的角黄素。每克干燥的细胞中虾青素和角黄素的含量分别是2.8mg和2.0mg。图3显示例1所得类胡萝卜素的高效液相色谱图。图中指示的数字相应于下列化合物。
1：虾青素，2：酚黄素，3：角黄素，4：海胆酮，5：α-胡萝卜素，6：β-胡萝卜素。
实施例2
Thraustochytrium sp.CHN-3微生物在23℃培养6天，培养基是含有50g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的磷酸二氢钾的海水，依下述条件培养；(a)照度1000lux的白光照射并旋转振动，转速100rpm，(b)在黑暗条件下旋转振动，转速100rpm，(c)照度1000lux条件下静态培养，和(d)照度1000lux条件下通风搅拌。结果见表1。
表1
  培养条件
  (a)   (b)   (c)   (d)
  产物   虾青素(mg/g干燥的细胞)   0.8-1.0   0.2-0.5   0.1＞   1.0-1.8
  生物量(g干燥的细胞/升)   2.01-2.62   1.37-1.46   0.26-0.39   2.46-3.10
表1充分显示了静态培养不能制得虾青素。在旋转振动培养时光照产出更多虾青素。通过通风提高氧的浓度，虾青素的产率可提高1.8倍。采用通风条件，或增加培养基中氧的浓度，使得虾青素的产率提高。
实施例3
通过相同试验，培养方式同实施例1，继续培养14天，除了所用富含糖的培养基的pH用盐酸水溶液和氢氧化钠水溶液调节改变，虾青素的产率在每一pH时是一定的。结果见图4的表。图表显示pH值提高，虾青素的产率提高。
实施例4
富含糖的培养基(以下称作糖培养基)是含有30g/L的葡萄糖、1g/L的蛋白胨、1g/L的酵母提取物的海水(氯化钠浓度3.2％)，在其中加入氯化钠制备各种培养液，各培养液在氯化钠浓度级上都不相同，接着，实施例1所用的Thraustochytrium sp.CHN-3微生物接种引入培养液，在通风搅拌、28℃和1000lux的白光照射下培养6天。接着，离心分离每一培养液收集微生物细胞。所得生物量和类胡萝卜素分别为2到5g/L和0.5-1mg/g。
所得细胞用丙酮提取、氯仿和甲醇，提取物用装备有ODSC18柱的高效液相分析。细胞中虾青素和角黄素的含量(干燥的细胞中的含量)是每1g干燥的细胞中分别含1.0-2.0mg和0.3-0.5mg。
实施例5
Thraustochytrium sp.CHN-3微生物使用每一升海水含50g葡萄糖、1g蛋白胨和1g磷酸二氢钾的培养基培养，以100rpm的转速摇动加入空气搅拌介质，在23℃条件下，以荧光灯白光或1000lux的蓝光(波长470nm)照射或在黑暗中进行培养。结果见图7。
该图显示黑暗中产生少量的虾青素。通过兰光照射得到的虾青素比在光照下旋转振动培养中的照射白光更多。这表示提高照射到培养基的蓝光强度可以增强虾青素产率。
实施例6
除了糖培养基的pH被改变，在与实施例4相同的条件下继续培养14天。结果见图5。显示在pH值4到10内虾青素的产率随pH值提高而提高。
实施例7
除了糖介质中Na2CO3的加入量被改变，在与实施例4相同的条件下继续培养7天，测定生物量、虾青素、角黄素的产率。结果见图8的表。表格显示当Na2CO3的浓度提高至1.6％时生物量和虾青素的产率提高。
实施例8
除了糖介质中NaCl的加入量被改变，在与实施例4相同的条件下继续培养7天，测定生物量、虾青素、角黄素的产率。每一次NaCl浓度增加时的产率见图9。显示在NaCl的浓度提高至6％时生物量和虾青素的产率提高。
实施例9
继续进行培养试验7天，培养条件同实施例4，测定生物量、虾青素、角黄素的产率，除了在糖介质中加入作为维生素化合物的硫胺素并改变其加入量。结果见图10的表。表格显示硫胺素的加入量提高，生物量和虾青素的产率提高。还显示作为副产物的虾青素的脂肪酸酯(以ES表示)随着硫胺素浓度的提高而提高。
工业实用性
本发明提供一种大规模培养纯Thraustochytrium种微生物尤其是含有高浓度虾青素和角黄素的微生物的方法，和一种简单的提取和分离虾青素和角黄素的方法。本发明能用来提供高收率和高浓度的虾青素、角黄素或含有预期比例的虾青素和角黄素的混合物。

Claims (10)

1.一种Labyrinthula属Thraustochytrium种微生物菌株Thraustochytriumsp.CHN-3，保藏编号为FERM P-18556。
2.制备虾青素和角黄素的方法，其中包括下述步骤：
在培养基中培养权利要求1所述的微生物菌株，使虾青素和角黄素在微生物细胞内积聚，
从培养基中分离出微生物细胞，和
分离出的微生物细胞经溶剂提取法回收虾青素和角黄素。
3.根据权利要求2的制备方法，其中培养基的pH值维持在4到12，且微生物细胞在通气条件下培养。
4.根据权利要求2的制备方法，其中培养基含糖，其选自蔗糖、葡萄糖或果糖。
5.根据权利要求2的制备方法，其中微生物细胞在光照条件下培养。
6.根据权利要求5的制备方法，其中用来的照射的光是波长420到470nm的蓝光。
7.根据权利要求5的制备方法，其中用来照射的光是蓝光和红光的混合光，蓝光波长420-470nm、红光波长600-700nm。
8.根据权利要求2的制备方法，其中培养基含有维生素化合物。
9.根据权利要求8的制备方法，其中维生素化合物是硫胺素。
10.根据权利要求2的制备方法，其中培养基含有选自尿素，铵盐或硝酸钾的氮化合物。
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