CN104185678A - 通过裂殖壶菌属物种以兼养方式生产二十二碳六烯酸和虾青素 - Google Patents

通过裂殖壶菌属物种以兼养方式生产二十二碳六烯酸和虾青素 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的属于裂殖壶菌属(Schizochytrium)的原生生物株系，其允许以兼养方式高产率地生产脂质和类胡萝卜素，尤其是二十二碳六烯酸(DHA)和虾青素；以及涉及选择和培养此类株系的方法，通过采用可变地和/或不连续地提供光，尤其是以闪光形式。

Description

通过裂殖壶菌属物种以兼养方式生产二十二碳六烯酸和虾青素
本发明涉及以兼养方式，尤其是在存在光的不连续和/或可变照射的情况下，培养网粘菌纲(Labyrinthulomycete)的，特别是裂殖壶菌属(Schizochytrium)的原生生物的方法。该方法使得能够获得生物质的高产率，和经如此培养的原生生物对于脂质和类胡萝卜素(更特别地，二十二碳六烯酸(DHA)和虾青素)的富集。因此，该方法使得能够选择具有兼养特征且具有脂质和/或类胡萝卜素(更特别地，多不饱和脂肪酸和虾青素)的高产率的裂殖壶菌属株系。本发明还涉及新的属于裂殖壶菌属的原生生物株系，其特别适合于脂质和类胡萝卜素的生产。该新的裂殖壶菌属株系可用于以兼养方式生产二十二碳六烯酸(DHA)和虾青素。
序言
原生生物是具有简单细胞构造的微生物，即它们通常是单细胞的和有时是多细胞的但不呈现特化的组织。它们可以是自养的或异养的。
原生生物目前是许多工业项目的目标，因为某些物种能够积累或分泌大量的脂质，尤其是多不饱和脂肪酸。
裂殖壶菌属物种是破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的原生生物，其是分布非常广泛的一组海洋真菌。破囊壶菌已知产生宽范围的脂质，特别是多不饱和脂肪酸，并且几个物种已知产生类胡萝卜素。
在多不饱和脂肪酸之中，某些ω-3系列的高度不饱和的脂肪酸(PUFA-ω3)，特别是二十碳五烯酸(EPA或C20:5ω3)和二十二碳六烯酸(DHA或C22:6ω3)，以及某些ω-6系列的高度不饱和的脂肪酸(PUFA-ω6)，特别是花生四烯酸(ARA或AA或者二十碳四烯酸C20:4ω6)，具有公认的营养重要性并且在治疗应用方面具有强大的潜力。
被认为是必需营养素的DHA对于细胞的正常的和功能性的发育来说是必需的，并且在各种生物化学过程和功能中发挥关键作用。其多不饱和性质，在植物中以及在动物中，赋予其以对于细胞膜的下列特性来说的至关重要性：流动性、柔性和选择通透性，这些特性允许例如在低温下的有效适应，甚至存活，特别是在鱼类中。
DHA是人脑的主要结构组成部分，并且它是主要的脂肪酸。DHA占大脑皮层的15-20％(成人的脑包含至少20g DHA)和视网膜的30-60％。它通过掺入细胞膜中而对于中枢神经系统的发育和视网膜的功能来说是必不可少的，并且在视觉和记忆的机制的令人满意的取得和维持中发挥首要作用。
目前，来自渔业的鱼油是该类型的脂肪酸的主要商业来源。然而，尽管这些油找到了新的应用(水产养殖中的食物补充剂，整合到人造奶油中)，但是海洋渔业资源由于集约化的捕鱼活动而变得稀少。
因此，应当寻找这些脂肪酸例如EΡΑ、DHA和ARA的新来源以便在未来满足市场对于该类型的多不饱和脂肪酸的日益增长的需求。
除了其从头合成脂肪酸的能力外，原生生物还提供了相对于鱼油而言的几个优点：它们是在受控条件下在体外可培养的，这允许生产具有相对恒定的生物化学组成的生物质，和另一方面，与鱼油相反，它们不具有令人不快的气味并且其脂质不包含或包含很少的胆固醇。
最后，由原生生物产生的脂质具有比鱼油的脂质更简单的脂肪酸谱，这限制了目的脂肪酸的分离步骤。
此外，类胡萝卜素也是目的分子。它们通常用作色素，但它们作为抗氧化剂对于人的健康也具有重要作用。最后，它们具有刺激免疫系统的能力。
为了以工业规模通过原生生物来生产脂肪酸和类胡萝卜素，应当考虑几个因素。例如，可以根据株系、温度、光的条件和发酵罐的大小，在自养、兼养或异养条件下实施培养。例如，还可以在一升的容器中、在实验室中、在光生物反应器中和在100000升的容器中或甚至在开放池(数公顷)中实施培养。然而，在开发理想的培养条件时，应当考虑能量消耗和其他资源例如劳力，和继续培养的容易性。
无论如何，希望的是在对于增加待生产的脂肪酸和类胡萝卜素的产率来说最佳的条件下培养原生生物。因此，优选的是具有可能的最高的产率(例如超过80g/l干物质的生物质，相对于干物质的总重量而言大于25重量％的脂肪酸，和例如相对于干物质的总重量而言大于0.2重量％的类胡萝卜素)。
光对于生长的影响并不是仅仅留给光合生物(植物；蓝细菌、微观藻类和大型藻类)的。某些无叶绿素的生物具有允许其捕获对于其发育来说必需的光信号的光受体。光受体例如植物光敏素为控制具有其的生物的发育的光感受器的典型例子。迄今已经描述了各种不同的光受体，即尤其是辅助色素、隐花色素和向光蛋白。
裂殖壶菌属已知以异养方式产生DHA以及产生虾青素，当将它在连续荧光存在下异养地进行培养时[R.Poontawe等人,(2008),Optimization of DHA and astaxanthin production by Schizochytriumsp.isolated from mangrove forests in Thailand.JSPS-NRCT coreuniversity program on development of thermotolerant microbialresources and their applications,第134-135页]。
然而，从工业开发利用的角度看，这样的培养方式被证明是不合适的。这是因为，为了赢利，生物质的生产应当可以在大尺寸的封闭光生物反应器中实施。然而，这样的培养方式难以实施，因为当培养基中细胞密度增加时，细胞越来越难以捕获来自反应器外部的光。那么就需要活跃地搅拌培养基，这需要大的能量消耗。
可希望的是，能够获得比现有技术中所描述的更大的DHA和虾青素的产率，以为了更有效和可赢利的工业开发利用。
为了改善DHA和虾青素的产率，对于以上面所描述的培养方式进行培养而言的一个备选方法是以兼养方式(即采用较小强度的光提供，和在存在提供有机底物的情况下)实施培养。
应当理解，术语“兼养(的)”通常用于具有叶绿体的、能够在光存在下通过利用两种碳源(有机的和无机的)进行发育的株系。在裂殖壶菌属株系的情况下，未鉴定到这样的叶绿体。然而，由于该株系同时是异养的和对光反应性的，因而术语“兼养(的)”在本发明的范围内将被放宽至该类别的株系。
因此，正是在许多的在不寻常的光条件下和通过添加各种不同底物进行的实验结束之后，申请人终于分离到可以兼养方式进行培养的裂殖壶菌属物种的原生生物株系，其使得能够在本发明的条件下以高产率生产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，尤其是DHA和虾青素。
已经将如此分离和选择出的新的裂殖壶菌属株系的代表性株系(FCC 1104)根据布达佩斯条约的规定以登录号CCAP4087/1保藏于CCAP(藻类和原生动物培养物保藏中心，Scottish Association forMarine Science,Dunstaffnage Marine Laboratory,Oban,ArgyllPA371QA,Ecosse,Royaume-Uni)。
更具体而言，所述培养和选择方法在于，在兼养条件下，在可变的和/或不连续的光照(尤其是以闪光形式)(具有特殊的光强度变化范围和频率)存在下培养原生生物。
光照期与黑暗期(或光强度减弱期)的接近的交替(这通常被视为对于原生生物来说是应激性的)令人惊奇地使得能够获得这样的裂殖壶菌属株系，其具有生物质、脂质和更特别地多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的高产量。根据本发明的株系的这一使用打开了在从减小的光提供中受益的发酵罐中工业化生产多不饱和脂肪酸(特别是DHA)和类胡萝卜素(特别是虾青素)的前景，并因此应当使得能够实现相对于先前所描述的培养方式而言的能量节约。
下面详细说明本发明的各种不同的方面和优点。
发明详述
因此，本发明的目标在于在随时间不连续地和/或可变地进行光照的条件下以兼养方式培养网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科，特别是裂殖壶菌属的原生生物的方法。所述光照具有幅度通常在5μmol.m-2.s-1和1000μmol.m-2.s-1之间，优选地在30和400μmol.m-2.s-1之间的强度变化。这些变化通常可以发生2至3600次/小时，优选地2至200次/小时。这些培养条件使得能够提供确定量的光。该光提供可以包括不连续的和/或可变的光照期，其有着可以具有相同或不同幅度的强度变化。所述光照可以尤其以闪光形式。
该方法所具有的优点在于增加从培养获得的生物质的产率。它所具有的优点还在于使经如此培养的原生生物富含多不饱和脂肪酸(更特别地，二十二碳六烯酸(DHA))和类胡萝卜素(更特别地，虾青素)。该方法还可以用于选择网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科和网粘菌科(Labyrinthulide)，特别是裂殖壶菌属的株系，所述株系具有兼养特征并且具有多不饱和脂肪酸(尤其是DHA)和类胡萝卜素(尤其是虾青素)的高产率。
该原生生物的以兼养方式的培养优选地在100mM至1.5M，优选地300mM至1.2M，更优选地500mM至1M，和更加优选地600mM至900mM的有机含碳底物存在下施行。在培养期间连续地确保底物的提供，以便允许细胞积累重大浓度的脂质和类胡萝卜素。在该培养方法期间向培养基添加额外的底物以维持恒定的浓度。该有机含碳底物优选地包括(以纯的或混合物的形式)：葡萄糖、纤维素衍生物、蔗糖和/或甘油。
包含在培养基中的有机含碳底物可以由复杂的分子或由底物混合物组成。来自淀粉的生物转化(例如从玉米、小麦或马铃薯开始)的产物，尤其是由小尺寸的分子构成的淀粉水解物，例如构成了适合于根据本发明的原生生物的兼养培养的有机含碳底物。
更具体而言，该方法旨在利用网粘菌纲，特别是裂殖壶菌属(门：粘菌门(Myxomycota)，目：水霉目(Saprolegniales)，科：破囊壶菌科)[ITIS Catalogue of Life,2010]的新株系，所述新株系因下列原因而被选择：其兼养特征，和具有多不饱和脂肪酸(尤其是DHA)和类胡萝卜素(尤其是虾青素)的高产率，和尤其是其以高于10μΕ的光提供，在富含有机成分的培养基，例如其中添加了有机含碳底物的经改良的Verduyn培养基(15g/L海盐，3g/L(NH4)2SO4，1g/LKH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，24mg/L Na2EDTA，3mg/LZnSO4·7H2O，3mg/L MnCl2·2H2O，0.04mg/L Na2MoO4·2H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，3.2mg/L泛酸盐，9.5mg/L盐酸硫胺素，0.15mg/L维生素B12，0.1mL/L消泡剂)中进行培养的能力。优选地，所述有机含碳底物包括浓度等于或大于300mM的葡萄糖、甘油。
“株系”不仅是指裂殖壶菌属的天然株系，而且还是指所述天然株系的突变体。
可以按照进一步描述的根据本发明的选择和培养方法来分离和选择出这些新的裂殖壶菌属株系。
根据本发明的裂殖壶菌属株系的代表性株系为由申请人分离并且以编号CCAP4087/1保藏于CCAP的株系FCC1104。当将它们根据本发明在可变地或不连续地提供光的情况下以兼养方式进行培养时，此类株系能够产生显著量的生物质以及脂质和类胡萝卜素，和更特别地DHA和虾青素。
根据现行的分类学分析，株系CCAP4087/1属于裂殖壶菌属。本发明涉及网粘菌纲，特别是裂殖壶菌属的任何这样的株系，其能够在如在本申请中所描述的兼养培养条件下生长，并且能够产生脂肪酸(例如DHA)和/或类胡萝卜素(例如虾青素)。本发明还涉及裂殖壶菌属的任何这样的原生生物物种，其能够在如在本申请中所描述的兼养培养条件下生长，并且能够产生脂肪酸(例如DHA)和类胡萝卜素(例如虾青素)。
根据本发明分离出的裂殖壶菌属株系使得能够在兼养条件下产生显著量的生物质，以及脂质和类胡萝卜素，所述脂质富含DHA，所述DHA可以占在所述原生生物中所包含的总脂质的大于40％，或大于50％，或大于60％；和所述类胡萝卜素富含虾青素，所述虾青素可以相对于干物质的总重量而言占大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％。所述株系可以达到大于0.015mg/L/小时，或大于0.020mg/L/小时，或大于0.025mg/L/小时的生产率水平(所产生的目的产物的量/升培养物/小时)。
在本发明中，在兼养条件下在可变的和/或不连续的光照(尤其是以闪光形式)存在下进行培养的裂殖壶菌属株系(例如，由申请人分离出的株系FCC1104)使得能够生产虾青素。相反地，在异养条件下，检测不到任何虾青素。此外，根据本发明的某些实施方案以兼养方式获得的生物质的量等于或甚至高于(例如，大约10-18％)在异养条件下所获得的量。“异养条件”是指具有相同的培养基但不存在光的培养条件。
因此，本发明的目标在于在存在随时间可变地或不连续地进行光照(例如以闪光形式)的情况下以兼养方式培养网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科，特别是裂殖壶菌属，尤其是所保藏的裂殖壶菌属物种的原生生物株系的方法，尤其为了生产多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，例如DHA和虾青素。
因此，本发明的目标在于在存在随时间可变地和/或不连续地进行光照的情况下选择网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科和网粘菌科，特别是裂殖壶菌属，尤其是所保藏的裂殖壶菌属物种的原生生物株系的方法，所述原生生物株系具有兼养特征，并且具有多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素(例如DHA和虾青素)的高产率。
看来培养物的可变的和/或不连续的光照(特别是在以兼养方式进行培养中)对于原生生物的发育具有有利的影响，并且使得能够增加原生生物的生产率，尤其是关于其产生脂质和类胡萝卜素方面。并不束缚于该理论，发明人估计，向原生生物不连续地和/或可变地提供光的效应在于引起对于生长和对于脂质的合成以及对于类胡萝卜素的合成有利的“应激”。该现象可以部分地通过这样的事实而得到解释：在自然界中，原生生物具有积累脂质和类胡萝卜素储备物以抵抗其环境的限制的倾向。
“不连续的光照”应当理解为由黑暗期隔断的光照。黑暗期可以占超过四分之一的在其期间对藻类进行培养的时间，优选地一半的时间或更多。
根据本发明的一个优选的方面，所述光照是不连续的，和更优选地以闪光形式。在本发明的范围内，“闪光”是具有短的持续时间(即少于30分钟)的光照射。持续时间可以少于15分钟，优选地少于5分钟，或更加优选地少于1分钟。按照本发明的某些实施方案，闪光的持续时间可以少于1秒钟。例如，闪光的持续时间可以为一秒钟的1/10，或一秒钟的2/10，或一秒钟的3/10，或一秒钟的4/10，或一秒钟的5/10，或一秒钟的6/10，或一秒钟的7/10，或一秒钟的8/10，或一秒钟的9/10。光照射，或闪光，通常具有超过15秒钟的持续时间。它通常为5秒钟至10分钟，优选地10秒钟至2分钟，更优选地20秒钟至1分钟。
通常，闪光次数为大约2至3600次/小时。它可以例如为100至3600次闪光/小时。它还可以为120至3000次闪光/小时，或400至2500次闪光/小时，或600至2000次闪光/小时，或800至1500次闪光/小时。它还可以为2至200次/小时，优选地10至150次/小时，更优选地15至100次/小时，和更加优选地20至50次/小时。闪光可以在时间上以规律的或不规律的间隔进行发射。在以规律的间隔进行发射的情况下，那么闪光次数/小时相应于具有时间段(T)的频率(F)，认为F＝1/T。该时间段可以为1秒钟至30分钟，或1秒钟至36秒钟，或者1.2秒钟至30秒钟，或1.44秒钟至9秒钟，或1.8秒钟至6秒钟，或2.4秒钟至4.5秒钟。该频率还可以为18秒钟至30分钟，优选地24秒钟至6分钟，更优选地36秒钟至4分钟，和更加优选地72秒钟至3分钟。根据闪光的强度和持续时间来选择闪光次数/小时(参见下面)。通常，以闪光形式提供的光的强度为5至1000μmol.m-2.s-1，优选地5至500μmol.m-2.s-1，或50至400μmol.m-2.s-1，和更优选地150至300μmol.m-2.s-1。1μmol.m-2.s-1相应于1μΕ.m-2.s-1(爱因斯坦)，这是在文献中经常使用的单位。
根据本发明的一个特别的实施方案，光的强度为50至200μmol.m-2.s-1，闪光频率的时间段为10秒钟至60分钟，对于1秒钟至1分钟的闪光持续时间。
根据本发明的另一个实施方案，所述光照可以是可变的，这意味着光照不被黑暗期间断，但光强度随时间而变化。光强度的该变化是有规律的，并且可以是周期性的或循环的。根据本发明，也可以进行联合了连续的和不连续的光照期的光提供。
根据本发明，无论光照条件是什么，以光子的微摩尔数/秒/平方米(μmol.m-2.s-1)表示的向培养中的藻类提供的光强度在同一个小时内变化至少一次。该光强度变化的幅度通常在5和1000μmol.m-2.s-1之间，或在50和800μmol.m-2.s-1之间，或在100和600μmol.m-2.s-1之间。光的强度还可以在5和400μmol.m-2.s-1之间变化。优选地，光强度变化的幅度在70和300μmol.m-2.s-1之间，和更优选地在100和200μmol.m-2.s-1之间。
在可变的光照的条件下，所述光强度可以连续地达到例如50μmol.m-2.s-1和100μmol.m-2.s-1这些值，或5和400μmol.m-2.s-1这些值，或50和800μmol.m-2.s-1这些值，每个小时数次。优选地，所述光强度可以连续地达到50和200μmol.m-2.s-1这些值。备选地，在不连续的光照的条件下，所述光强度可以连续地达到例如0和50μmol.m-2.s-1这些值，0和100μmol.m-2.s-1这些值，或更加优选地0和200μmol.m-2.s-1这些值，在一小时内数次。它还可以连续地达到例如0和300μmol.m-2.s-1这些值，0和600μmol.m-2.s-1这些值，0和800μmol.m-2.s-1这些值，或者0和1000μmol.m-2.s-1这些值，在一小时内数次。
根据本发明的一个实施方案和无论光照条件是什么，向培养物提供的光的强度随着细胞密度而变化。培养物变得越稠密，光可以越强。细胞密度是细胞数目/ml，并且按照本领域技术人员已知的技术进行测量。
在培养的初始阶段，当细胞密度为大约105至5×105个细胞/ml时，光强度可以为5至15μmol.m-2.s-1，优选地5至10μmol.m-2.s-1。当培养物达到106至107个细胞/ml的密度时，可以增加光强度直至15至200μmol.m-2.s-1，例如，优选地，20至50μmol.m-2.s-1。当培养物在最后阶段达到107至108个细胞/ml的密度时，可以增加光强度直至50至700μmol.m-2.s-1，例如，优选地，50至150μmol.m-2.s-1。
根据某些实施方案，例如，当闪光的持续时间为例如少于一分钟或少于一秒钟时，光的强度可以比上面所提及的值更大。在培养的初始阶段，当细胞密度为大约105至5×105个细胞/ml时，光强度可以为5至200μmol.m-2.s-1，优选地5至100μmol.m-2.s-1。当培养物达到106至107个细胞/ml的密度时，可以增加光强度直至30至500μmol.m-2.s-1，例如，优选地，在50至400μmol.m-2.s-1。当培养物在最后阶段达到107至108个细胞/ml的密度时，可以增加光强度直至100至1000μmol.m-2.s-1，例如，优选地，200至500μmol.m-2.s-1。
根据本发明的一个实施方案，在一小时内向培养物提供的光量保持在某些值之间。它为大约2000至600000μmol.m-2，优选地2000至300000μmol.m-2。它可以为大约4000至200000μmol.m-2/小时。
根据本发明的一个实施方案，用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和10μmol.m-2.s-1的强度。该强度给出9000μmol.m-2的总的光提供/小时。根据本发明的另一个实施方案，用20次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和20μmol.m-2.s-1的强度。该强度给出12000μmol.m-2的总的光提供/小时。根据本发明的另一个实施方案，用45次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有15秒钟的持续时间和5μmol.m-2.s-1的强度，这给出3375μmol.m-2的总的光提供/小时。
根据本发明的另一个实施方案，用120次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有10秒钟的持续时间和200μmol.m-2.s-1的强度，这给出240000μmol.m-2的总的光提供/小时。
如上面对于光强度所描述的，和根据本发明的一个实施方案，每小时向培养物提供的光量可以随着细胞密度而变化。在培养的初始阶段，当细胞密度为105至5×105个细胞/ml时，在一小时内的总的光提供通常为大约1500至8000μmol.m-2，优选地1500至6000μmol.m-2，更优选地2000至5000μmol.m-2。当培养物达到106至107个细胞/ml的密度时，可以增加在一小时内的总的光提供直至例如6000至67000μmol.m-2，优选地6000至50000μmol.m-2，和更优选地12000至45000μmol.m-2。在培养的最后阶段，在107至108个细胞/ml的细胞密度的情况下，可以增加在一小时内的总的光提供直至45000至300000μmol.m-2，例如优选地45000至200000μmol.m-2，和例如更优选地50000至150000μmol.m-2。
根据本发明的一个实施方案，在培养的初始阶段(在105至5×105个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和5至10μmol.m-2.s-1的强度，这给出2250μmol.m-2至4500μmol.m-2的总的光提供/小时。然后，在中间阶段(在106至107个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和15至50μmol.m-2.s-1的强度，这给出13500至45000μmol.m-2的总的光提供/小时。然后，在培养的最后阶段(在107至108个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和50至150μmol.m-2.s-1的强度，这给出45000至135000μmol.m-2的总的光提供/小时。
根据本发明的一个实施方案，例如当闪光的持续时间为例如少于一分钟或少于一秒钟时，在培养的初始阶段(在105至5×105个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有10秒钟的持续时间和50至100μmol.m-2.s-1的强度，这给出15000μmol.m-2至30000μmol.m-2的总的光提供/小时。然后，在中间阶段(在106至107个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用50次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有10秒钟的持续时间和200至300μmol.m-2.s-1的强度，这给出100000至150000μmol.m-2的总的光提供/小时。然后，在培养的最后阶段(在107至108个细胞/ml的细胞密度的情况下)，用120次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有10秒钟的持续时间和350至450μmol.m-2.s-1的强度，这给出420000至540000μmol.m-2的总的光提供/小时。
在培养物中的光提供可以通过分布在发酵罐外壁周围的灯来获得。一个时钟以确定的光照时间开启这些灯。发酵罐优选地位于可以控制其环境温度的避开日光的围壳中。
正如申请人已经能够看到的，如此选择出的株系具有良好的在不连续的和/或可变的光存在下以兼养方式生长的能力这一事实使得所述株系具有更多地产生多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素(尤其是DHA和虾青素)的倾向。
因此，根据本发明的培养方法使得能够选择网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科，特别是裂殖壶菌属的株系，所述株系具有兼养特征，与由申请人分离并以编号CCAP4087/1保藏于CCAP的那种相似，并且具有多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素的高产率。该培养方法的特征在于，所述方法包括下列步骤：
a)在随时间不连续地和/或可变地进行光照的条件下以兼养方式培养网粘菌纲，特别是裂殖壶菌属的一种或多种株系，所述光照具有幅度在5μmol.m-2.s-1和1000μmol.m-2.s-1之间，优选地在5和400μmol.m-2.s-1之间的强度变化，这些变化发生2至3600次/小时，优选地5至400次/小时；
b)在培养基中在有机含碳底物存在下维持所述培养物经过几代的步骤；和任选地
c)回收经如此培养的原生生物的步骤。
更具体地，回收步骤是指分离其细胞数目在所述代期间增长最多的株系。
为了进行株系的选择，可以在同一围壳中的微量培养板上平行地培养网粘菌纲，尤其是破囊壶菌科，特别是裂殖壶菌属的各种不同的株系，其中精确监测条件和不同培养物的发展。因此，容易知道不同株系对于不连续的和/或可变的光照的应答，和在需要时，对于在培养基中添加一种或多种有机含碳底物的应答。对于不连续的和/或可变的光照和对于有机含碳底物有利地作出应答的株系通常在质量(在脂质谱中更丰富的多不饱和脂肪酸，和在类胡萝卜素之中更丰富的虾青素)和数量(脂质包含更高比例的DHA，和干物质包含更高比例的虾青素)方面为类胡萝卜素和脂质的生产提供了更好的产率。
可以用兼养培养的条件，从异质的并且人们寻求从其中选择出通过根据本发明的选择方式(联合了不连续的和/或可变的光，其具有特定的光强度范围和频率)而获益的变体的群体开始，在发酵罐中选择原生生物。在该情况下，通过维持原生生物处于培养状态经过许多代来施行培养，然后在培养结束之后实施变成为在培养基中占多数的组分的分离。
根据本发明的培养方法还使得能够生产脂质和类胡萝卜素。
在该情况下，根据本发明的方法此外还包括下列步骤：
d)回收原生生物的疏水物质的步骤；和任选地
e)从所回收的疏水物质中提取DHA(二十二碳六烯酸)和虾青素。
这是因为，所述疏水物质包含脂质和类胡萝卜素。
根据本发明的培养方法还可以应用于能够在根据本发明的兼养条件下生长并且能够产生DHA和虾青素的裂殖壶菌属的任何物种。
根据本发明的培养方法使得能够优化从培养物获得的生物质的生产。它还使得能够使经如此培养的原生生物富含多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素，更特别地富含二十二碳六烯酸(DHA)和虾青素。
因此，本发明的目标还在于生物质的生产，以及脂质和类胡萝卜素，尤其是脂肪酸的生产，其通过培养具有兼养特征的裂殖壶菌属的原生生物(所述原生生物优选地按照前面所针对的方法进行培养或选择)，然后回收经如此培养的原生生物以从中提取疏水内容物，特别是脂质(包括DHA)和类胡萝卜素(包括虾青素)。
脂质(包括DHA)的选择性提取方法是本领域技术人员已知的，并且例如由[Bligh,E.G.和Dyer,W.J.(1959),A rapid method of totallipid extraction and purification,Can.J.Biochem.Physiol.,37:911-917]作了描述。
类胡萝卜素(包括叶黄素)的提取和分析方法是本领域技术人员已知的，并且例如由Wright等人(1991)(S.W.Wright,S.W.Jeffrey,R.F.C.Mantoura,C.A.Llewellyn,T.Bjornland,D.Repeta,N.Welschmeyer:Improved HPLC method for the analysis ofchlorophylls and carotenoids from marine phytoplankton.Marineecology progress series,第77卷,183-196,1991)作了描述。
本发明还涉及网粘菌纲，尤其是网粘菌科和破囊壶菌科，特别是裂殖壶菌属的原生生物株系，其能够按照前面所描述的本发明的方法来获得。这些原生生物富含多不饱和脂肪酸和类胡萝卜素。此类原生生物的总脂质通常包含大于40％，或大于50％，或大于60％的DHA，相对于脂质的总百分比而言。根据本发明的一个实施方案，此类原生生物所包含的虾青素可以占大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％，相对于干物质的总重量而言。因此，根据本发明的一个实施方案的原生生物可以具有大于0.015mg/L/小时，或大于0.020mg/L/小时，或大于0.025mg/L/小时的虾青素生产率(所产生的目的产物的量/升培养物/小时)。
实施例1
在具有专用的自动装置和经由信息处理站的监管的有用的1-2L的发酵罐(生物反应器)中进行裂殖壶菌属物种的培养。通过添加碱(2N的氢氧化钠溶液)和/或酸(1N的硫酸溶液)来调节该系统的pH。将培养温度固定在26℃。借助于根据Rushton结构安置在枢轴上的3个搅拌活动体(下行式泵送的三桨叶螺旋桨)来进行搅拌。通过搅拌速度(250-600rpm)、空气流量(0.25-1vvm)或甚至氧气流量(0.1-0.5vvm)，在整个培养过程中在培养基中调节溶解氧的压力。整合在监管自动装置中的调节参数使得能够维持15％的恒定的pO2。该生物反应器装配有围绕透明槽的外部照明系统。光的强度以及循环数由专用的自动装置进行控制并且由信息处理站进行监管。
用在恒温的(26℃)且以100至200μE进行光照的围壳中在摇动台(140rpm)上实现的预培养物接种反应器。预培养和在生物反应器中的培养在经改良的Verduyn培养基(15g/L海盐，3g/L(NH4)2SO4，1g/L KH2PO4，0.5g/L MgSO4·7H2O，24mg/L Na2EDTA，3mg/L ZnSO4·7H2O，3mg/L MnCl2·2H2O，0.04mg/L Na2MoO4·2H2O，10mg/L FeSO4·7H2O，3.2mg/L泛酸盐，9.5mg/L盐酸硫胺素，0.15mg/L维生素B12)中进行。用于在生物反应器中以常规的兼养形式、以异养形式和以闪光(可变的/不连续的光)+兼养形式进行培养的含碳底物是浓度为300mM至1M的葡萄糖。
培养物的监测：
总生物质的浓度通过测量干质量(在滤器GF/F,Whatman上进行过滤，然后在称重之前，在105℃下，在烘箱中干燥最少24小时)来进行监测。
关于总脂质的定量，提取108个细胞/mL。脂质的提取方法是本领域技术人员已知的。
为了定量类胡萝卜素(尤其是虾青素)，提取108个细胞/mL。类胡萝卜素(包括虾青素)的提取和分析方法是本领域技术人员已知的。
光照(对于以兼养形式的培养)：
用30次闪光/小时对培养物进行照明，其中每一次闪光具有30秒钟的持续时间和80μmol.m-2.s-1的强度。
在生物反应器中在培养物中的光提供通过分布在发酵罐外壁周围的LED(发光电二极管)灯来获得。一个时钟以光照时间或者脉冲(对于以闪光(具有不连续的光)+兼养形式的培养)开启这些LED。
结果(n＝3)：
PCT/RO/134表

Claims (14)

1.一种方法，其包括下述步骤：
a)在随时间不连续地和/或可变地进行光照的条件下以兼养方式培养裂殖壶菌属(Schizochytrium)的一种或多种株系，所述光照具有幅度在5μmol.m-2.s-1和1000μmol.m-2.s-1之间的强度变化，这些变化发生2至3600次/小时。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述光照具有幅度在5μmol.m-2.s-1和400μmol.m-2.s-1之间的强度变化，这些变化发生2至200次/小时。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于，所述培养在浓度为100mM至1.5M，优选地300mM至1.2M，更优选地500mM至1M，和更加优选地600mM至900mM的有机含碳底物存在下进行，所述有机含碳底物选自蔗糖、甘油、葡萄糖和纤维素衍生物以及这些分子的混合物。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，存在于培养基中的所述有机含碳底物包括至少300mM的葡萄糖和/或甘油。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其特征在于，所述强度变化的幅度在5和1000μmol.m-2.s-1之间，优选地在70和300μmol.m-2.s-1之间，和更优选地在100和200μmol.m-2.s-1之间。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其特征在于，以闪光形式来提供光。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于，所述闪光具有1/10秒钟至10分钟，优选地5秒钟至10分钟，更优选地10秒钟至2分钟，更加优选地20秒钟至1分钟的持续时间。
8.根据权利要求6或权利要求7的方法，其特征在于，所述闪光次数为5至3600次/小时，优选地10至150次/小时，优选地15至100次/小时，和更优选地20至50次/小时。
9.根据权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于，以光子的微摩尔数表示的每小时的总的光提供量为2000至600000μmol.m-2，优选地2000至200000μmol.m-2。
10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其特征在于，所述方法还包含下列步骤：
b)在培养基中在有机含碳底物存在下维持所述培养物经过几代的步骤，和任选地
c)回收经如此培养的原生生物的步骤，和任选地
d)回收疏水物质的步骤，和任选地
e)从所回收的疏水物质中提取DHA(二十二碳六烯酸)和虾青素。
11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌属的原生生物相应于以编号CCAP4087/1保藏于CCAP(藻类和原生动物培养物保藏中心)的株系FCC1104。
12.能够通过根据权利要求1至11中任一项的方法而获得的裂殖壶菌属的原生生物。
13.根据权利要求12的裂殖壶菌属的原生生物，其特征在于，所述裂殖壶菌属的原生生物的总脂质包含相对于脂质的总％而言大于40％，或大于50％，或大于60％的DHA，并且所述裂殖壶菌属的原生生物包含相对于干物质的总重量而言大于0.1重量％，或大于0.15重量％，或大于0.2重量％的虾青素。
14.根据权利要求12或13的裂殖壶菌属的原生生物，其具有大于0.015mg/L/小时，或大于0.020mg/L/小时，或大于0.025mg/L/小时的生产率。
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