CN108431203A - 使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸，更特别地ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，以及用于产生这些脂质的其实施 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸(PUFA)，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述方法包括在包含含硒化合物的培养基中培养原生生物；以及通过该方法获得的富集了富含PUFA的脂质的原生生物。本发明还涉及产生富含PUFA的脂质的方法，其包括，在根据本发明的富集方法之后，通过从生物质中提取富含PUFA的含硒脂质来处理原生生物的方法。最后，本发明涉及任何这样的食品、美容品或药品，其包含要么经如此提取的含硒脂质，要么来自所述富集方法的含硒生物质。

Description

使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸，更特别地ω3类别的多 不饱和脂肪酸的脂质的方法，以及用于产生这些脂质的其 实施
本发明涉及使原生生物(优选地微观藻类)富集富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述方法包括在包含至少一种含硒化合物的培养基中培养原生生物；和如此获得的经历富集的原生生物；以及通过实施根据本发明的富集方法来产生富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法。
本发明涉及由微生物(特别是原生生物，十分特别地微观藻类)来产生脂肪酸的总的领域。
术语“原生生物”是指除了动物、真菌和植物之外的真核生物。该组是非常异质的，并且将具有所谓简单的单细胞的(最常见的情况)或者多细胞的但没有特化组织的细胞构造的生物汇集在一起。某些原生生物是自养的，而另一些是异养的(例如吃微观藻类的原生动物，或者例如裂殖壶菌属(Schizochytrium)或隐甲藻属(Crypthecodinium)的微观藻类)。
多不饱和脂肪酸(PUFA)是在生物系统中的脂质的主要组分的一部分。PUFA由包含至少18个碳原子/分子且以羧基基团结束的烃链构成，并且包含至少两个碳-碳双键。
PUFA按照其碳数目、其不饱和度(或碳-碳双键)数目和从羧基基团对面的基团开始的其第一个不饱和度的位置来进行分类。因此，多不饱和脂肪酸C X:YωZ为这样的脂肪酸，其包含X个碳原子，Y个不饱和度，并且其第一个不饱和度在第Z位(即位置Z)处，其中X、Y和Z各自为整数，X大于或等于18。
PUFA的两个最重要的类别为ω3和ω6的类别。
在ω3类别的PUFA中包括α-亚麻酸(C 18:3ω3)、二十碳五烯酸(或EPA)(C 20:5ω3)和二十二碳六烯酸(或DHA)(C 22:6ω3)。
DHA在位置3、6、9、12、15和18处具有总共六个不饱和度。
通常，PUFA对于所有生物的生长和存活来说是必不可少的，在维持膜的完整性方面、在维持膜的渗透性方面和在碳的细胞储存方面。因此，不具有对于其合成来说必需的酶的哺乳动物必须在其食物中找到它们。
在人中，PUFA在脑、心脏和许多其他器官和组织的发育和最佳机能中发挥不可或缺的作用。特别地，ω3类别的PUFA作为长期地看对于人的健康最有益的化合物而存在，因为它们降低心血管疾病以及免疫性和炎性病症的风险。它们还作用于脑系统、激素系统和炎症系统。DHA尤其允许在视觉和神经学水平上的良好的胎儿和幼儿发育，这在几年以来赋予它在食品(尤其是婴儿食品)的各种不同配方中愈来愈大的关注。
因此，ω3类别的PUFA的市场在2014年超过了20亿美元。根据市场研究“Omega-3PUFA Market by Type(DHA,EPA,ALA),Source[Marine(Fish,Algal,Krill,Others),Plant(Flaxseed,Chia Seed,Others)],Application(Dietary supplement,FunctionalF&B,Pharma,Infant Formula,Others)&Geography-Global Trend&Forecast to 2019”，该市场在2019年将会超过40亿美元。某些食物天然地富含它们，例如脂肪多的鱼(鲱鱼、沙丁鱼、鲭鱼...)和某些植物油(油菜籽、坚果、大豆…)。然而，虽然鱼油目前是PUFA的主要工业来源，但是它们不再能够持久地应对需求的增长，特别是对于DHA。这是因为，对于高质量鱼油的持久需求与过度捕捞的背景相重合，这导致越来越严格的对于捕捞的规章的建立，和鱼油的总产量的减少。鱼油的生产还提出了精炼的问题，尤其是由于这些鱼油的不太令人愉快的味道和气味、其低的氧化稳定性以及其胆固醇和毒性产物的含量。因此，其使用是受到限制的，尤其是在食品补充剂的市场上。
因此，开始使用备选来源用于该繁荣的关于PUFA生产的市场：微生物，尤其是微观藻类。这是因为，后者由于其非凡的多样性和其代谢可塑性而对于许多工业(尤其是食品工业和制药工业)来说是有重要意义的PUFA来源。在这些微生物之中，尤其包括原生生物界的微观藻类，例如破囊壶菌科(Thraustochytrides)，其包括裂殖壶菌属(Schizochytrium)，和沟鞭藻科(Dinoflagellata)，其包括隐甲藻属(Crypthecodinium)。
微观藻类的脂肪酸组成常常比鱼油的脂肪酸组成简单，这减少了对于浓缩所寻求的脂肪酸来说必需的步骤的数目。裂殖壶菌属和隐甲藻属的微观藻类能够以下述变化的量产生脂质：直至其干生物质的40-50％，和在总脂质中直至30-40％的PUFA。这些PUFA大多数地以甘油三酯的形式进行储存。此外，这些海洋微观藻类不具有令人不快的气味，因为它们不包含胆固醇，并因此不具有鱼油所呈现出的缺点。它们还很好地被消费者视为植物来源的天然产品。此外，可能的是，通过控制所有的培养参数来在生物反应器中大规模地生产微观藻类。因此，作为鱼油的替代物，微观藻类今后算得上处在PUFA来源的首要地位。
特别地，在用于婴儿和早产儿的配方产品中和在食品补充剂中使用DHA。它们可以来自通过使用隐甲藻属和裂殖壶菌属的海洋异养微观藻类来进行的水产养殖。
微观藻类的培养条件对于PUFA的产率具有很大的影响。然而，尽管所获得的生物质的量变化很大，但是观察到EPA和DHA相对于该生物质而言的比例总体上保持不变。为了改善生长以及微观藻类中的高附加值分子(例如脂质和类胡萝卜素)的产生而探索的途径之一是给这些微观藻类的培养基补充化学化合物。
因此，专利申请US 2013/0217085教导，向培养基添加外源的甜菜碱或海藻糖可以显著地增加裂殖壶菌属，特别是蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)的不饱和脂肪酸的发酵产率；在寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的培养基中添加正十二烷(氧的转运体)使得能够改善DHA的产生从而达到51％的总脂质，如在出版物Da Silva等人,“Effect of n-dodecane on Crypthecodinium cohnii fermentations and DHAproduction”,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.33pp 408-416,2006中所报道的。
然而，除了由这些非生物来源的(即不是植物来源的)化学化合物的使用对于消费者所给出的负面印象之外，这些化合物的添加(除了其是昂贵的外)还提出了纯化微观藻类的问题，因为它们存在于最终的生物质中。
另一方面，专利申请WO 2015/150716描述了在几乎没有氯化物和几乎没有钠的培养基中培养橙壶菌属(Aurantiochytrium)的微观藻类，特别是红树橙壶菌(Aurantiochytrium mangrovei)这一种类的原生生物以产生DHA的方法。所涉及的株系为破囊壶菌科的红树橙壶菌和蛞蝓橙壶菌(Aurantiochytrium limacinum)这些种类的株系。在许多其他元素中，硒作为任选地可以在培养基中以非常低的量存在(不多于1mg/L的亚硒酸钠，即不多于0.46mg/L的硒)的钠的运载体而被提及。此外，应当指出，裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)的株系并不明确地构成本发明的一部分。
最后，文献WO 2013/010090描述了具有高脂质含量的组合物，以及其制备方法。所述脂质含量为相对于干物质而言至少67％。所述藻类优选地为小球藻属(Chlorella)、裂殖壶菌属或隐甲藻属的株系或物种。无论培养基是什么，它都包含酵母(优选地酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的提取物，其优选地富集了硒。在这种情况下，所述培养基包含含硒化合物。所述培养基的硒含量是非常高的，即对于在培养基中7.5g/L的酵母来说10-100％，即75-750mg/L的硒。
因此，存在增加通过微观藻类来进行的PUFA(特别是ω3类别的PUFA)的产生的需要，同时简化从生物质开始的提取。
本发明旨在减轻现有技术的缺点，这通过提出下述方法来进行：通过在培养基中使用含硒化合物来增加富含多不饱和脂肪酸(PUFA)(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸，十分特别地DHA)的脂质的产生的方法。
根据本发明，“富含PUFA”意指包含55重量％至80重量％，优选地60重量％至75重量％(的PUFA，相对于总脂质而言)。
事实上，令人惊讶地，申请人已观察到，在原生生物的培养基中添加含硒化合物可以改善富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸，十分特别地DHA)的脂质的产生，同时减少在生物质的这些脂质中存在的饱和脂肪酸的量。
因此，本发明的目标为优化通过原生生物(优选地通过微观藻类，更加优选地通过异养海洋微观藻类)来进行的富含PUFA(特别是ω3类别的PUFA，更特别地DHA)的脂质的产生，从而获得对于由现有技术所提出的解决方案来说备选的，但相比于由现有技术所提出的解决方案而言花费更少且在实施方面更简单的解决方案。
因此，在第一个方面，本发明的目标在于使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸(特别地且优选地ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的方法，所述方法包括在包含至少一种含硒化合物的培养基中培养原生生物，所述含硒化合物在培养基中的浓度是这样的，即使得硒以1-8mg/L的浓度存在。
所述含硒化合物优选地选自由下列各项组成的组：2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸、硒酸盐、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和Se-腺苷硒代甲硫氨酸。
所述含硒化合物更加优选地选自由下列各项组成的组：2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸和硒代甲硫氨酸。
所述2-羟基-4-甲基硒代丁酸通常以L、D或D,L的形式。
所述2-羟基-4-甲基硒代丁酸的盐优选地为钙盐、锌盐或镁盐。
特别有利地，根据本发明，所述富含多不饱和脂肪酸的脂质特别地富含二十二碳六烯酸(DHA)。
根据本发明，“富含DHA”意指包含45重量％至70重量％，优选地48重量％至60重量％(的DHA，相对于总脂质而言)。
除非有相反指示，所有的百分比在本文中均以“重量％”给出。
根据本发明，所述原生生物优选地为色囊泡生物界(Chromalveolata)的微观藻类。
本发明的优点之一为，PUFA的富集伴随有由相对于其中除了培养基不包含含硒化合物外所有事情相等的情况而言具有相同或更高的总脂质含量的原生生物所产生的饱和脂肪酸的贫化(换言之，减少)。这意味着，与用根据现有技术的富集了PUFA的原生生物而获得的饱和脂肪酸含量相比，本发明的原生生物通常包含减少的饱和脂肪酸含量，即通常在相对于总脂质而言40％至68％的区间内。
在不希望被任何理论束缚的情况下，申请人认为饱和脂肪酸含量的减少有益于不饱和脂肪酸的产生。
依照根据本发明的产生方法的第一个实施方案，这些微观藻类属于麦秆毛生物门(Stramenopiles)，优选地破囊壶菌科(Thraustochytrides)或网粘菌科(Labyrinthulides)，更加优选地裂殖壶菌属(Schizochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。优选地，在该情况下，这些微观藻类属于麦秆毛生物门，优选地破囊壶菌科，更加优选地裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属或破囊壶菌属。
依照根据本发明的产生方法的第二个实施方案，这些微观藻类属于囊泡生物门(Alveolata)，优选地沟鞭藻科(Dinoflagellata)，更加优选地隐甲藻属(Crypthecodinium)。
根据一个十分特别地优选的实施方案，所述微观藻类为蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)或红树裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)这些物种的异养海洋微观藻类，或者寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)这一物种的微观藻类，优选地蛞蝓裂殖壶菌这一物种的异养海洋微观藻类，或者寇氏隐甲藻这一物种的微观藻类。但是，在本发明的范围内也可以使用塞特隐甲藻(Crypthecodinium setense)、聚集裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、深吾肯氏壶菌(Ulkenia profunda)、放射吾肯氏壶菌(Ulkenia radiata)、威瑟氏吾肯氏壶菌(Ulkenia visurgensis)、红树橙壶菌(Aurantiochytrium mangrovei)、蛞蝓橙壶菌(Aurantiochytrium limacinum)、球形破囊壶菌(Thraustochytrium globosum)、金色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、厚皮破囊壶菌(Thraustochytrium pachyderma)、聚集破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)和/或纹带破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)这些物种，优选地塞特隐甲藻、聚集裂殖壶菌、深吾肯氏壶菌、放射吾肯氏壶菌、威瑟氏吾肯氏壶菌、金色破囊壶菌、厚皮破囊壶菌、聚集破囊壶菌和/或纹带破囊壶菌这些物种的异养微观藻类。
根据本发明，“A和/或B”意指A，或者B，或者A和B。
除了存在根据本发明的含硒化合物之外，培养基是本领域技术人员已知的，特别是对于所涉及的物种，即它在营养培养基中包含对于原生生物的生长来说必需的化学元素(氮；矿物盐；碳；等等)。
在2-羟基-4-甲基硒代丁酸的特别情况下，关于该酸的使用条件可以参考申请人的专利US9017985，其涉及该酸用于使光合作用微生物富集硒的用途。
根据本发明的富集方法是这样的，从而所述含硒化合物在培养基中的浓度是这样的，即使得硒以在1-8mg/L，例如5mg/L的浓度存在。当存在数种含硒化合物时，这适用于培养基的总硒含量，其中考虑它们中的每一个。
所述富集方法通常在96小时至200小时的持续时间内，例如在等于187小时的持续时间内进行。
本发明还涉及根据本发明的富集方法获得的富集了富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的原生生物。
特别有利地，根据本发明，这些原生生物还富集了硒，即它们包含相对于其总质量而言5至800ppm(以重量计)的硒。
通过根据本发明的富集方法获得的富集了富含PUFA，特别是ω3类别的PUFA的脂质的原生生物作为美容试剂或营养试剂也是有用的。有利地，可以提高富集了富含PUFA(特别是ω3类别的PUFA)的脂质的该含硒物料的身价，十分特别地在人或动物的(优选地动物的)营养中。
因此，本发明还涉及通过根据本发明的富集方法获得的这些富集了富含PUFA，特别是ω3类别的PUFA的脂质的原生生物在营养或美容中的用途。作为必然结果，本发明涉及任何这样的食品或美容品，其包含通过根据本发明的富集方法获得的富集了富含PUFA，特别是ω3类别的PUFA的脂质的原生生物。
因此，十分特别地，通过根据本发明的富集方法获得的富集了富含PUFA，特别是ω3类别的PUFA的脂质的原生生物可以在人或动物营养中使用。
然而，这样的用途也可以在从生物质中提取富含PUFA的脂质或甚至从生物质中提取富含PUFA的脂质并纯化经如此提取的脂质这样的处理后施行。
该另一种用途是更令人感兴趣的，因为本发明的另一个优点是，令人惊讶地，所述脂质还富集了硒，即它们包含相对于其总质量而言多于1ppm，更加优选地多于2ppm(以重量计)的硒。在所有情况下，它们通常包含相对于其总质量而言少于30ppm的硒。在脂质中该相对高的硒含量的存在是根据本发明的方法的另一个特征。因此，可以用“含硒微观藻类脂质”或“含硒脂质”这样的词语。
所述提取可以通过本领域技术人员已知的任何提取方法来进行，例如用至少一种有机溶剂来进行的提取或者用处于超临界状态的二氧化碳来进行的提取。
因此，在第二个方面，本发明的目标在于产生富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的方法，其依次包括：
-根据本发明的使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的方法，以便获得富集了富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的原生生物；和
-通过从生物质中提取富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质来处理所述富集了富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的原生生物的方法，以便获得富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的(含硒)脂质和耗竭了脂质的含硒生物质。
有利地，还可以使用在该提取后获得的耗竭了富含PUFA的脂质的含硒生物质，尤其在通常地人或动物的(优选地动物的)营养中。
因此，所述处理富集了富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质的原生生物的方法在于从生物质中提取富含多不饱和脂肪酸的脂质，最经常地和优选地，随后为纯化经如此提取的(与生物质分开的)富含多不饱和脂肪酸(特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸)的脂质。通常，接着该处理方法之后为分析如此获得的脂质的特性谱。
从生物质中提取脂质的方法是本领域技术人员已知的，并且例如在下面的实施例中明确说明。
因此，在第三个方面，本发明的目标在于根据本发明的产生方法获得的富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质，其有利地还富集了硒并因此被称为“含硒脂质”。
所述脂质可以就这样地进行使用，最经常地在人或动物营养中。
因此，根据本发明的产生富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法包括实施根据本发明的富集方法，该富集方法具有与上面所阐述的那些相同的特征。
最后，本发明涉及任何这样的食品或美容品，其包含通过根据本发明的产生方法获得的富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质。
通过阅读下面的实施例并参照附图，本发明将会被更好地理解，在所述附图中：
-图1是给出了关于蛞蝓裂殖壶菌在187小时的温育后在总脂质中多不饱和脂肪酸(PUFA)的重量百分比的图；
-图2是给出了关于蛞蝓裂殖壶菌在187小时的温育后在总脂质中二十二碳六烯酸(DHA)的重量百分比的图；
-图3是给出了关于蛞蝓裂殖壶菌在187小时的温育后在总脂质中饱和脂肪酸(SFA)的重量百分比的图；和
-图4是给出了关于寇氏隐甲藻在187小时的温育后在总脂质中多不饱和脂肪酸(PUFA)的重量百分比、在总脂质中二十二碳六烯酸(DHA)的重量百分比和在总脂质中饱和脂肪酸(SFA)的重量百分比的图。
图1至4在下面的实施例1和2中进行阐述。
实施例
下面的实施例举例说明本发明，但并不因此限制其范围。
实施例1.在分开地包含2-羟基-4-甲基硒代丁酸(HMSeBA)、亚硒酸盐、硒酸或硒代 甲硫氨酸的培养基中培养裂殖壶菌属原生生物
该培养导致多不饱和脂肪酸(特别是DHA)的产生的改善。
裂殖壶菌属物种是原生生物，更准确而言异养的破囊壶菌科微观藻类。
从ATCC储库(www.atcc.org)获得蛞蝓裂殖壶菌株系ATCC-MYA1381。
在不同形式的硒存在下测量了蛞蝓裂殖壶菌的生长特征以及脂质的产生，并且在此类添加剂不存在下(在图上被标注为“无Se”的对照)进行比较。
蛞蝓裂殖壶菌株系ATCC-MYA1381的预培养在标准液体培养基(其组成在表1中给出)中进行。为此，从在633M3壶菌琼脂(www.atcc.org)上分离出的菌落开始在250mL的Erlen容器中投入50mL的起始培养物，并且在该标准液体培养基中在25℃±1℃下以异养方式培养48小时。然后，从具有1.0×106个细胞/mL的初始浓度的这些起始培养物开始在与所述起始培养物相同的培养条件下在500mL的Erlen容器中投入100mL的接种物4天。通过100rpm(“转/分钟”)的轨道式搅动来使所述培养物连续地进行通气。
对于400mL的最终体积，从具有1.0×106个细胞/mL的初始浓度的接种物开始，在25℃±1℃下以异养方式在2.0L的Erlen容器中投入用于富集含硒化合物的培养物187小时。通过100rpm的轨道式搅动来使所述培养物连续地进行通气。所述富集在T0时通过添加浓缩的硒溶液(0.0125g/L的2-羟基-4-甲基硒代丁酸溶液，其由Tetrahedron公司销售，在图1至3上被标注为“HMSeBA”；0.0110g/L的亚硒酸钠，在图1至3上被标注为“亚硒酸盐”；0.0082g/L的硒酸，在图1至3上标注为“硒酸”；和0.0124g/L的硒代甲硫氨酸，在图1至3上被标注为“SeMet”)来进行，对于在培养基中5mg硒/L的最终浓度，无论含硒化合物的来源是什么。
然后，在72小时和187小时的温育后，收获蛞蝓裂殖壶菌的生物质。
表1.构成标准液体培养基的每种试剂的浓度的概要
试剂 最终浓度(g/L)
人工海水 33
酵母提取物 8.7
一水合葡萄糖(G8270Sigma) 17.0
所述人工海水是平常的商业产品，在该情况下，它是AQUARIUM SYSTEMS公司的产品“Instant Ocean Salt”。其组成作为信息在下面给出：Na+(0.35g/L)；K+(0.01g/L)；Mg2+(0.04g/L)；Ca2+(0.01g/L)；Sr+(0.00054g/L)；Cl(0.641g/L)；S(SO4 2-)(0.07g/L)；P(PO4)(0.000157mg/L)；N(NO3)(0.002mg/L)；N(NH4)(0.006mg/L)；Si(SiO3)(0.0105mg/L)；Li(0.0124mg/L)；Si(0.0148mg/L)；Mo(0.0057mg/L)；Ba(0.00385mg/L)；V(0.0048mg/L)；Ni(0.00329mg/L)；Cr(0.0129mg/L)；Al(0.214mg/L)；Cu(0.00377mg/L)；Zn(0.00108mg/L)；Mn(0.00218mg/L)；Fe(0.000442mg/L)；Cd(0.000890mg/L)；Pb(0.0144mg/L)；Co(0.00253mg/L)；Ag(0.00819mg/L)；Ti(0.00106mg/L)。
所述酵母提取物是由Merck公司提供的商业产品。
培养物的监测
通过测量干物质(在GFC过滤器(Whatman)上进行过滤，然后在真空中在70℃和-0.8巴(80kPa)下在炉中干燥最少24小时，然后进行称重)来监测总生物质的浓度。
提取107个细胞/mL以用于对总脂质进行定量。脂质的提取方法是本领域技术人员已知的，并且由出版物“Bligh E.G.&Dyer W.J.,A rapid method of total lipidextraction and purification,Can.J.Biochem.Physiol 37 1959 911-917”进行了描述，该方法已经为了微观藻类细胞而进行了轻度改动。因此，对于每次测量，用软化水洗涤大约10mL的新鲜抽取的培养物(生物质和培养基)以便在冻干前去除细胞外的盐，然后放置在玻璃管中并在4℃下以3600g离心10分钟。在离心后，去除上清液，并且冻干包含细胞的粒状沉淀。所述提取用6mL的以2/1(V/V)比例的CHCl3/MeOH(氯仿/甲醇)单相混合物来进行。为了确保脂质的完全提取，将管在黑暗中在摇移器上在搅动下维持6小时，然后在通过GC-FID(具有火焰离子化检测的气相色谱法)进行分析以测定所提取的总脂肪酸的量和特性谱之前储存于-20℃。
所获得的结果通过图1、2和3来图解说明，所述图1、2和3对于在横坐标上所指出的每个含硒来源在纵坐标上分别给出了在总脂质中PUFA的百分比、在总脂质中DHA的百分比和在总脂质中SFA的百分比，关于蛞蝓裂殖壶菌，在187小时的温育后。
观察到，在培养基中以5mg/L的含硒化合物的存在使得能够获得明显高于对照的PUFA的百分比(最少67％对53％)，无论所使用的含硒种类是什么，其中最令人感兴趣的结果由亚硒酸盐给出(73％)。
还观察到，在培养基中以5mg/L的含硒化合物的存在使得能够获得明显高于对照的DHA的百分比(最少50％对41％)，无论所使用的含硒种类是什么，其中最令人感兴趣的结果由亚硒酸盐给出(54％)。
最后，观察到，在培养基中以5mg/L的含硒化合物的存在使得能够获得明显低于对照的SFA的百分比(最少31％对44％)，无论所使用的含硒种类是什么，其中最令人感兴趣的结果由亚硒酸盐给出(26％)。
实施例2.在包含硒代甲硫氨酸的培养基中培养寇氏隐甲藻原生生物
该培养导致多不饱和脂肪酸(特别是DHA)的产生的改善。
这以与在实施例1中相同的方式来进行，除了下述方面之外：原生生物为寇氏隐甲藻而非蛞蝓裂殖壶菌，并且使用了单一的硒来源即硒代甲硫氨酸(“SeMet”)。
寇氏隐甲藻是原生生物，更准确而言异养的微观藻类。从NCMA储库(https://ncma.bigelow.org)获得寇氏隐甲藻株系CCMP 316。
所获得的结果通过图4来图解说明，所述图4对于在横坐标上所指出的每种化合物(PUFA、DHA和SFA)在纵坐标上给出了在硒代甲硫氨酸存在下(标注为“具有SeMet”)或在含硒化合物不存在下(标注为“无Se”)在总脂质中化合物的百分比，关于寇氏隐甲藻，在187小时的温育后。
观察到，在培养基中以5mg/L的硒的硒代甲硫氨酸的存在使得能够获得明显高于对照的PUFA的百分比(35％对25％)。
还观察到，在培养基中以5mg/L的硒的硒代甲硫氨酸的存在使得能够获得明显高于对照的DHA的百分比(34％对24％)。
最后，观察到，在培养基中以5mg/L的硒的硒代甲硫氨酸的存在使得能够获得明显低于对照的SFA的百分比(53.5％对64％)。
此外，由于使用硒代甲硫氨酸，观察到了在干生物质中总脂质含量的增加。这是因为，通过采用在含硒培养基中进行的培养，获得了相对于对照培养基而言多34％的总脂质的量。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.使原生生物富集包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述方法包括在包含至少一种含硒化合物的培养基中培养原生生物，所述含硒化合物在培养基中的浓度是这样的，即使得在培养基中的硒浓度为1-8mg/L。
2.根据权利要求1的方法，其中所述含硒化合物选自由下列各项组成的组：2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸、硒酸盐、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和Se-腺苷硒代甲硫氨酸。
3.根据权利要求1或2之一的方法，其中所述含硒化合物选自2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸和硒代甲硫氨酸。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类属于麦秆毛生物门(Stramenopiles)，优选地破囊壶菌科(Thraustochytrids)或网粘菌科(Labyrinthulids)，更加优选地裂殖壶菌属(Schizochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。
5.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类属于囊泡生物门(Alveolata)，优选地沟鞭藻科(Dinoflagellata)，更加优选地隐甲藻属(Crypthecodinium)。
6.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类为蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)或红树裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)这些物种的异养海洋微观藻类，或者寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)这一物种的微观藻类。
7.根据权利要求5或6之一的方法，其中所述异养微观藻类为蛞蝓裂殖壶菌这一物种的微观藻类或者寇氏隐甲藻这一物种的微观藻类。
8.通过根据权利要求1至7之一的富集包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法获得的原生生物。
9.包含根据权利要求8的原生生物的食品或美容品。
10.产生包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述方法依次包括：
-根据权利要求1至7之一的使原生生物进行富集的方法，以便获得富集了包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质的原生生物；和
-通过从生物质中提取包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质来处理所述经历富集的原生生物的方法，以便获得包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质和耗竭了脂质的含硒生物质。
11.根据权利要求10的产生包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，其中接着所述提取之后为纯化经如此提取的包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸的脂质。
12.通过根据权利要求10或11之一的方法获得的脂质，所述脂质包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸。
13.根据权利要求12的脂质，从而其包含相比于其总质量而言多于1ppm，更加优选地多于2ppm的硒，以重量计。
14.包含根据权利要求13的含硒脂质的食品或美容品。
15.根据权利要求14的食品，其用于人或动物营养。
说明或声明(按照条约第19条的修改)
根据PCT第19条的规定，用新的权利要求1-15项替换原权利要求1-15项。
新的权利要求的修改基础如下：
1、新的权利要求1
-新的表述“包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸”，可参见例如说明书第5页第2-3行。
-其余表述的修改未改变其原始含义。
2、新的权利要求9
新的权利要求9为增加的权利要求，其修改基础可参见例如说明书第8页第4-6行。
3、新的权利要求8和10-12
新的表述“包含相对于总脂质而言55重量％至80重量％的多不饱和脂肪酸”，可参见例如说明书第5页第2-3行。
4、新的权利要求14
基于说明书第8页第5段进行了简化。
附件：1、新的权利要求书共2页(共15项)
2、权利要求书的修改手稿共2页
3、申请人的声明
我们援引于2016年12月13日提交的我们关于可专利性的非正式的意见(其分析了D1和D2)，并且增加补充的意见。
权利要求的修改目前消除了关于清楚性的反对意见。
1.在ISR中所引用的被认为相关的现有技术文献
我们想要强调，在本申请的权利要求1中，在培养基中的含硒化合物浓度明确地表示为硒的水平：“硒以1-8mg/L的浓度存在”。
·WO 2015/150716(D1)
在D1中，硒的含量为0-0.46mg/L。
因此，即使以其最低的含量，根据本发明的含硒化合物的含量也大大高于在D1中 所指出的最大含量。
·WO 2013/010090(D2)
在培养基中，对于7.5g/L的酵母(权利要求3)，酵母的硒含量为10－100％(第9页第5-6行)，即0.75-7.50mg/L的硒代甲硫氨酸/L培养基。这相应于0.00382-0.0382mol/L的硒代甲硫氨酸(M硒代甲硫氨酸＝196.1g/mol)，等于说0.00382-0.0382mol/L即0.302-3.02g/L的硒(M硒＝79g/mol)，也就是说302-3020mg/L的硒。
因此，即使以其最高的含量，根据本发明的含硒化合物的含量也大大低于在D2中 所指出的最小含量。
2.所要求保护的发明相对于D1和D2而言的可专利性
如前面所证明的，权利要求1-15相对于D1和D2而言具备新颖性。
D1描述了硒在特定微生物的培养基(所述培养基具有低的氯化物和钠的含量)中的用途，以便改善多不饱和脂肪酸的产生。
D1既没有表明也没有暗示由于在培养基中硒盐的存在而引起的ω3类别的多不饱和脂肪酸的富集效应。
此外，D4(Gennity等人,(1985))描述了通过在真核微观藻类(绿色微观藻类Dunaliella primolecta或红色微观藻类紫球藻(Porphyridium cruentum))的培养基中添加亚硒酸盐而减少的脂质含量。特别地，描述了二十碳五烯酸(EPA)(其是ω3类别的多不饱和脂肪酸)(C 20:5ω3)的总脂质含量减少30％(第2823页，最后一段)。
因此，D4绝没有激励本领域技术人员去在产生ω3类别的多不饱和脂肪酸的微观藻类株系的培养基中使用硒以便增加其产生。相反地，它表明，在培养基中使用硒减少了微观藻类的多不饱和脂肪酸的含量。
因此，权利要求1-15的主题是可赋予专利权的。
* *
*
总之，ISR的缺乏新颖性和创造性的反对意见应当被撤销：权利要求1-15是可赋予专利权的。

Claims (15)

1.使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸的脂质的方法，所述方法包括在包含至少一种含硒化合物的培养基中培养原生生物，所述含硒化合物在培养基中的浓度是这样的，即使得硒以1-8mg/L的浓度存在。
2.根据权利要求1的方法，其中所述含硒化合物选自由下列各项组成的组：2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸、硒酸盐、硒代半胱氨酸、硒代甲硫氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和Se-腺苷硒代甲硫氨酸。
3.根据权利要求1或2之一的方法，其中所述含硒化合物选自2-羟基-4-甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸和硒代甲硫氨酸。
4.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类属于麦秆毛生物门(Stramenopiles)，优选地破囊壶菌科(Thraustochytrides)或网粘菌科(Labyrinthulides)，更加优选地裂殖壶菌属(Schizochytrium)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)、橙壶菌属(Aurantiochytrium)或破囊壶菌属(Thraustochytrium)。
5.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类属于囊泡生物门(Alveolata)，优选地沟鞭藻科(Dinoflagellata)，更加优选地隐甲藻属(Crypthecodinium)。
6.根据权利要求1至3之一的方法，其中所述微观藻类为蛞蝓裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)或红树裂殖壶菌(Schizochytrium mangrovei)这些物种的异养海洋微观藻类，或者寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)这一物种的微观藻类。
7.根据权利要求5或6之一的方法，其中所述异养微观藻类为蛞蝓裂殖壶菌这一物种的微观藻类或者寇氏隐甲藻这一物种的微观藻类。
8.通过根据权利要求1至7之一的方法获得的富集了富含多不饱和脂肪酸，特别是ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的原生生物。
9.产生富含多不饱和脂肪酸的脂质的方法，其依次包括：
-根据权利要求1至7之一的使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸的脂质的方法，以便获得富集了富含多不饱和脂肪酸的脂质的原生生物；和
-通过从生物质中提取富含多不饱和脂肪酸的脂质来处理所述富集了富含多不饱和脂肪酸的脂质的原生生物的方法，以便获得富含多不饱和脂肪酸的脂质和耗竭了脂质的含硒生物质。
10.根据权利要求9的产生富含多不饱和脂肪酸的脂质的方法，其中接着所述提取之后为纯化经如此提取的富含多不饱和脂肪酸的脂质。
11.通过根据权利要求9或10之一的方法获得的富含多不饱和脂肪酸的脂质。
12.根据权利要求11的脂质，从而其包含相比于其总质量而言多于1ppm，更加优选地多于2ppm的硒，以重量计。
13.包含根据权利要求11或12之一的富含多不饱和脂肪酸的脂质的食品或美容品。
14.根据权利要求13的食品，其用于人或动物营养。
15.根据权利要求9获得的耗竭了脂质的含硒生物质在人或动物营养中的用途。
CN201680072941.3A 2015-12-14 2016-12-13 使原生生物富集富含多不饱和脂肪酸，更特别地ω3类别的多不饱和脂肪酸的脂质的方法，以及用于产生这些脂质的其实施 Active CN108431203B (zh)

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