CN109576205A - 一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类、制品和制备方法 - Google Patents

一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类、制品和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类、制品和制备方法。本发明公开的富硒富多不饱和脂肪酸藻类的制备方法包括发酵步骤：往接种有藻类的发酵培养基中添加硒盐。该制备方法通过对发酵工艺的优化，可有效提高藻类体内的硒元素含量，制得富含硒元素和多不饱和脂肪酸的藻类。

Description

一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类、制品和制备方法
技术领域
本发明涉及富硒发酵技术领域，具体而言，涉及一种富硒富多不 饱和脂肪酸藻类、制品和制备方法。
背景技术
硒对人体的好处：硒(Se)被世界卫生组织和中华医学会定为21 世纪继碘、锌后必补的第三大微量营养保健元素，它对人体具有抗氧 化、防癌变、排毒、提高免疫力等作用。目前，市面上的富硒藻类， 多为富硒螺旋藻和小球藻，因为这两种藻类对于硒的耐受性能较高， 其他藻类的富硒产品极少看到。
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)是指含有两个 或两个以上双键且碳链长为18～22个碳原子的直链脂肪酸，是研究 和开发功能性脂肪酸的主体和核心，主要包括亚油酸(LA)、γ-亚麻 酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸 (DHA)等。多不饱和脂肪酸是所有细胞膜的重要成分，对机体的激素 代谢和许多酶的活性起调控作用。
在ω3类别的PUFA中包括α-亚麻酸(C 18:3ω3)、二十碳五烯酸 (或EPA)(C 20:5ω3)和二十二碳六烯酸(或DHA)(C 22:6ω3)，主要可 来源于鱼油和藻油。ω3类别的PUFA中的重要成员DHA，对人体 有多种特殊生理功能。DHA是人脑的重要组成部分，能够维持脑的 功能、延缓脑的衰老。补充DHA在一定程度上可以起到预防、治疗 老年性痴呆的目的。此外，DHA还具有降血脂、预防和治疗动脉硬 化、抗癌、抗炎、保护视力等作用。人体中合成的DHA极其有限， 必须通过食物摄取来提供。
藻油的脂肪酸组成常常比鱼油的脂肪酸组成简单，所以是现在非 常流行地ω3脂肪酸来源，现有的用于发酵生产多不饱和脂肪酸的藻 类包括，例如破囊壶菌科(Thraustochytrides)，其包括裂殖壶菌属 (Schizochytrium)，和沟鞭藻科(Dinoflagellata)，其包括隐甲藻属 (Crypthecodinium)。
但是，这些藻类在发酵生产多不饱和脂肪酸时，藻类富集的硒元 素含量较低。现有的富硒藻类的制作方法是在发酵开始的时候便进行 加硒，然而硒通常对藻类具有一定的毒性，在发酵的一开始直接投入 会严重减少生物量，使得油脂的得率受到影响，为了降低硒对藻类的 毒性，其硒添加量最高只有8mg/L，使得藻类的富硒量受到局限。
鉴于此，本发明希望通过一种改良富硒工艺来提高藻类的富硒能 力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类的制备 方法。利用该制备方法，可以制得富含硒元素和多不饱和脂肪酸的藻 类。
本发明的另一目的在于提供一种富硒藻类。该藻类富含硒元素和 多不饱和脂肪酸。
本发明的另一目的在于提供一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类制 品。该制品中富含硒元素和多不饱和脂肪酸，可高效、安全地被人体 吸收利用。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类的制备方 法，其包括：
发酵步骤：往接种有藻类的发酵培养基中添加硒盐，
优选的，所述硒盐的添加浓度为9-50mg/L；
优选的，所述硒盐的添加浓度为10-40mg/L。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-80h添加 所述硒盐。
需要说明的是，在接种藻类的时候记为第0h。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，其中，发酵步骤中的发 酵条件如下：温度27-29℃，搅拌速度200-240转/分钟，通气量1-3 vvm。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐的添加方式是 一次性加入、分批加入或流加；
优选的，在发酵第18-36h，以一次性加入方式添加所述硒盐，或 者，在发酵第18-36h之内分两次添加所述硒盐，或者，在第18h-第 36h期间，以流加方式添加所述硒盐。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵第18-36h，从所 述发酵培养基中富集藻类，向富集的藻类中加入所述硒盐。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在第18-36h之内进行 富集藻类。再向所富集的藻类中加入硒盐。
由于硒盐存在于液体培养基中，而菌体的富硒能力又有限，大量 的硒盐存在于菌体的生长环境中，硒盐的毒性对菌体的代谢和生物量 都造成较大影响。在加入无机硒前将菌体进行富集，在保证高富硒能 力的同时，能够减少单位细胞接触的硒量，进而降低无机硒对菌体的 毒性。
富集藻类的方法包括：可以通过离心，通过过滤，如陶瓷膜等来 获得高浓度菌体。其中，富集时可以保留原体积五分之一的培养基， 也可以加入新鲜的为原体积五分之一的培养基，在培养基中加入所述 硒盐，后续的培养中根据耗糖速度进行补料。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，在发酵的第0-80h往所 述发酵培养基中添加富硒助剂，富硒助剂主要为SDS(十二烷基磺酸 钠)或环己氨基磺酸钠(甜蜜素)；
优选的，助剂的添加量为0.1-1.5g/L；优选为0.2-0.8g/L。
优选的，助剂的添加方式是随着硒盐的添加，一次性加入、分批 加入或流加；
优选的，从所述发酵培养基中富集藻类，向所富集的藻类中加入 硒盐，随着硒盐的添加向富集的藻类中加入富硒助剂；
优选的，在发酵的第18-36h内，添加富硒助剂。
富硒助剂在富硒的过程中主要起到提供了有机硫来源的作用，从 而能够提高甲硫氨酸的表达量，进一步提高硒与甲硫氨酸的结合，进 而提高富硒效果。
我们选择的助剂主要为十二烷基磺酸钠和环己氨基磺酸钠。环己 氨基磺酸钠作为食品生产中常用的添加剂，具有较高的安全性；十二 烷基磺酸钠除了具备有机硫来源的作用还能够解决供氧问题。在我们 的所研究的几种菌中，发现藻类比霉菌对SDS的耐受程度要高，并 且富集时候菌体密度的增大容易使得供氧不足，添加SDS可以利用 其作为氧载体，加强供氧，从而提升藻类的生长状况。进一步地，在 本发明的一些实施方案中，所述藻类选自破囊壶菌科、沟鞭藻科和网 粘菌科；
优选的，所述藻类选自裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属、橙壶菌属、 破囊壶菌属和隐甲藻属；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻，其保藏编号为CCTCC NO: M2012494。此菌株为产DHA油脂的菌株。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，所述硒盐选自2-羟基-4 甲基硒代丁酸或其盐、亚硒酸盐、硒酸、硒酸盐、硒代半胱氨酸、硒 代甲硫氨酸、硒代胱硫醚、硒代高半胱氨酸和Se-腺苷硒代甲硫氨酸 中的任意一种或几种的组合，优选的，硒盐为亚硒酸钠。
本发明提供的富硒藻类的制备方法，其通过优化、改变藻类发酵 过程中的工艺条件和参数，提高藻类的硒转化能力，得到富含硒元素 和多不饱和脂肪酸的藻类产品。藻类在发酵过程中吸收利用了硒，使 硒与体内的蛋白质和多糖有机结合转化为生物硒，从而消除了化学硒 (如亚硒酸钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更 安全地被人体吸收利用。
另一方面，本发明提供了一种富硒藻类，其由如上述的方法制得。
本发明提供的富硒藻类，其体内含有丰富的有机硒，消除了化学 硒(如亚硒酸钠)对人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、 更安全地被人体吸收利用。
另一方面，本发明提供了一种富硒富不饱和脂肪酸藻类制品其含 有多不饱和脂肪酸和硒元素。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，每克藻类制品生物质中 硒含量至少为0.042mg。
优选的，每克藻类制品生物质中硒含量至多为0.123mg。
优选的，每克制品中多不饱和脂肪酸含量至少为0.21g，优选的， 多不饱和脂肪酸为ω3类别的多不饱和脂肪酸，进一步优选地，多不 饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)。
优选的，每克制品中多不饱和脂肪酸含量可以达到0.26g/g。
该制品可以视为放罐后发酵液中的菌体，更优的也可以为干燥得 到的含油干菌体。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，藻类选自破囊壶菌科、 沟鞭藻科和网粘菌科；
优选的，所述藻类选自裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属、橙壶菌属、 破囊壶菌属和隐甲藻属；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻，其保藏编号为CCTCC NO: M2012494。
该菌于2012年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址： 中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO:M2012494，分类学命 名：裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，多不饱和脂肪酸选自亚 油酸(LA)、γ-亚麻酸(GLA)、花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA) 和二十二碳六烯酸(DHA)中的任意一种或多种的组合。
优选的，多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸(DHA)。
本发明提供的富硒富不饱和脂肪酸藻类制品，不仅富含多不饱和 脂肪酸，且富含有机硒，该藻类制品消除了化学硒(如亚硒酸钠)对 人体的毒副反应和肠胃刺激，使硒能够更高效、更安全地被人体吸收 利用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对 本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明 具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪 器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法如 下：
菌种：裂殖壶藻保藏编号为CCTCC NO:M2012494。
1种子活化培养：
将裂殖壶菌突变株CCTCC NO:M2012494接种到活化培养基中 培养，培养温度25-28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h， 以得到一级种子活化培养液。
所用活化培养基包括：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸 膏10g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
2种子扩大培养：
种子活化培养液菌浓达到8％(体积浓度)时，按照10％(体积 比)接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时 间48h，摇床振摇转速为220转/分钟，得到二级种子活化培养液。
所用扩大培养基包括：葡萄糖30g/L，谷氨酸钠20g/L，酵母浸 膏10g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钙0.5g/L， pH自然。
3发酵培养：
将二级种子活化培养液菌浓达到8％(体积浓度)时，接种到发 酵罐中进行发酵培养(接种时记为发酵第0h)，接种量20％(体积比)， 发酵罐温度28℃，搅拌速度220转/分钟，通气量2vvm(L/L.min) 即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为2L，罐压0.08Mpa，培养120h，并在发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓 度在10g/L。
发酵罐中的发酵培养基包括：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷 氨酸钠20g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，氯化钾0.5g/L， pH自然。
4添加硒盐
在发酵过程中的第36h，将菌体过陶瓷膜，得到菌泥，往菌泥中 添加原体积五分之一(即初始发酵培养基体积的五分之一)的新鲜培 养基，与25mg/L的亚硒酸钠(即每升发酵培养基中添加25mg亚硒 酸钠)，后续的发酵中根据耗糖速率进行补料。
5添加SDS
在发酵过程中的第36h，往发酵培养基中一次性添加SDS(随亚 硒酸钠的添加一起添加)，添加量为0.2g/L，继续发酵。
6发酵培养结束后，收集发酵后得到的裂殖壶菌菌体，将菌体过 滤清洗后烘干，得到干重，即可作为富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品。
7检测
7.1多不饱和脂肪酸的检测：方法参考国标GB 5413.27-2010。
7.2硒元素含量的检测：
(1)硒标准溶液
准确称取2.19g干燥的亚硒酸钠(优级纯)，溶于蒸馏水中，添 加80mL 48％的HBr，用蒸馏水稀释至1L，制备成含硒1g/L的标 准硒配备液或直接购买1g/L的硒标准液。
(2)样品消化
精确称取0.1～0.2g干菌体于150mL高脚烧杯中，加少量水湿 样，加消化液(双氧水∶高氯酸∶硫酸＝3∶3∶1)，摇匀，待气泡平 息后加盖表面皿，置通风橱内的电炉上消化至终点，若消化不完全可 稍冷后补加双氧水，继续加热消化至完全。置冷后用少量水冲洗表面 皿及瓶壁，加氢氧化钠调pH值为7.0，摇匀，用甲酸调pH值为2.0～3.0，加入4mL 40％盐酸羟胺,然后定容至50mL，同法做空白溶 液。
(3)样品总硒测定
取消化液10mL于125mL分液漏斗中，另取7个分液漏斗，分 别加入与消化液等量的空白溶液及标准硒工作液0.0、2.0、4.0、6.0、 8.0、10.0mL，加水适量，各加入5％EDTA-2Na溶液4mL，0.5％的 3，3-二氨基联苯胺溶液2mL，摇匀，置暗处反应30min，用氨水溶 液调pH值6.5～7.0，加入甲苯4mL，猛烈振摇萃取3min，静置分层， 取甲苯层滤液于1cm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用 标准硒工作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出与消化液的 吸光度对应的硒含量。
(4)样品无机硒测定
取样品1.0g左右干菌体于50mL蒸馏水中，置于超声波震荡仪 中超声震荡30min,小火微沸30min,过滤，定容50mL,吸取10mL上 清液，精确加入甲苯4mL，猛烈振摇萃取3min，静置分层，取甲苯 层滤液于lcm比色皿中，在波长425nm处测定吸光度。用标准硒工 作液的吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上查出对应的无机硒含量。
(5)样品有机硒含量测定
有机硒含量用测定的总硒含量减去样品中无机硒的含量即可得 到。
8结果
本实施例得到的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品中的硒元素含 量为：
富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品含量为：
DHA含量为30.45g/L，生物量(即每升液体发酵培养基的干菌 体重量)为130.8g/L，有机硒含量为7.75mg/g。
实施例2-18
实施例2-18的制备方法与实施例1基本相同，各实施例的主要 不同之处见表1。
表1
实施例17、18是采用的CCTCC NO:M2012494的出发菌株 CCTCCNO：M2012074，专利CN107523504A公开了CCTCC NO:M2012494由CCTCCNO：M2012074作为出发菌株的突变筛选过程。
对比例1
本对比例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法与 实施例10基本相同，不同的是使用0.25g/L的吐温代替富硒助剂。
对比例2
本对比例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法与 实施例10基本相同，不同的是使用0.25g/L的CTAB代替富硒助剂。
对比例3
本对比例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法与 实施例10基本相同，不同的是在第100h添加硒盐。
对比例4
本对比例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法与 实施例1基本相同，不同的是，本对比例中在发酵过程中不加硒盐。
对比例5
本对比例提供的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品的制备方法与 实施例1基本相同，不同的是：用保藏编号为CCTCCNO：M2012074 的裂殖壶藻的菌株代替实施例1的菌株；且在发酵过程中不加硒盐。
各实施例和对比例的检侧结果见表2。其中经过富集操作的实施 例结果是根据原培养基体积进行换算。DHA含量和每克干菌体的富 硒量与体积无关。
表2
表中：DHA含量(g/g)是指每g干菌体中的DHA含量。
通过表2结果可以看出，添加硒盐的实施例1-18与对比例4、5 相比，每克干菌体的DHA含量都不同程度的提高。加硒量、时间在 优选范围的实施例比大范围的实施例效果要好，因为添加硒过量、过 早都会影响生物量和有机硒含量，从而影响油脂的含量和产量。
由于硒对细胞具有一定的毒性，而菌体的富硒能力又有限，大量 的硒盐存在于菌体的生长环境中，硒盐的毒性对菌体的代谢和生物量 都造成较大影响。在加入无机硒前将菌体进行富集，在保证高富硒能 力的同时，能够减少单位细胞接触的硒量，进而降低无机硒对菌体的 毒性，同时单位体积内所富集的硒有所增加，能够看到当硒盐浓度大 于25mg/L之后，未富集的实施例生物量大幅下降，并且硒盐的利用 率也非常低，而富集的实施例能够在保证生物量的基础上实现生物硒 的大量富集转化率高，硒盐浓度达到50mg/L后，硒的吸收受到裂殖 壶藻细胞自身转化的限制，部分细胞受到过量硒盐的影响，即使是富 集后实施例(实施例15)的生物量明显下降。
添加硒过晚则会影响富硒效果(对比例3)，因为培养基中开始 富集细胞裂解后的代谢物，使得细胞的生长代谢受到抑制，菌体生长 趋于衰亡期，我们所期产物富含DHA的油脂不再积累，且很有可能 开始被分解代谢。同样富硒过程为裂殖壶藻将无机硒通过一定的生化 反应将其转变为利于吸收的有机硒，这个过程需要细胞具有较强的活 力，趋于衰亡期并不利于富硒工艺。
经富集加硒的操作，菌体克服硒盐对细胞的毒性，生物量保持稳 定，所以使得DHA油脂产量和富硒量有所提升，在添加高浓度硒盐 时，能够得到生物量、富硒量、油脂均较好的产品。
在未加入富硒助剂前，添加硒的含量达到20mg/L时已显现出转 化限制，但在加入富硒助剂促进甲硫氨酸等代谢后，得到了富硒量更 高的产能品，并且在更高浓度的硒盐条件下，如40mg/L的浓度下， 菌体生物量、油脂产量和有机硒含量与加入富硒助剂的实施例相比都 得到了一定的提升，而富硒助剂的效果用其他表面活性剂无法达到， CTAB甚至起了反作用严重影响了裂殖壶藻的生物量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，藻类的发酵工艺比较相 似，本发明的主体思想并不用应该限制本发明，对于本领域的技术人 员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之 内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护 范围之内。

Claims (10)

1.一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类的制备方法，其特征在于，其包括：
发酵步骤：往接种有藻类的发酵培养基中添加硒盐；
优选的，所述硒盐的添加浓度为9-50mg/L；
优选的，所述硒盐的添加浓度为10-40mg/L。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在发酵的第0-80h添加所述硒盐。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，发酵步骤中的发酵条件如下：温度27-29℃，搅拌速度200-240转/分钟，通气量1-3vvm。
4.根据根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述硒盐的添加方式是一次性加入、分批加入或流加；
优选的，在发酵第18-36h之内，以一次性加入方式添加所述硒盐，或者，在发酵第18-36h之内分两次添加所述硒盐，或者，在第18h-第36h期间，以流加方式添加所述硒盐。
5.根据根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，从所述发酵培养基中富集藻类，向富集的藻类中加入所述硒盐；
优选的，在第18-36h之内进行富集藻类。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，在发酵的第0-80h往所述发酵培养基中添加十二烷基磺酸钠或环己氨基磺酸钠作为富硒助剂；
优选的，助剂的添加量为0.1-1.5g/L，优选为0.2～0.8g/L；
优选的，助剂的添加方式是一次性加入、分批加入或流加；
优选的，从所述发酵培养基中富集藻类，向富集的藻类中加入助剂；
优选的，在发酵的第18-36h内，添加助剂。
7.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述藻类选自破囊壶菌科、沟鞭藻科和网粘菌科；
优选的，所述藻类选自裂殖壶菌属、吾肯氏壶菌属、橙壶菌属、破囊壶菌属和隐甲藻属；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻；
优选的，所述藻类为裂殖壶藻，其保藏编号为CCTCC NO:M2012494。
8.一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类，其特征在于，其由权利要求1-7任一项所述的方法制得。
9.一种富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品，其特征在于，其含有多不饱和脂肪酸和硒元素。
10.根据权利要求9所述的富硒富多不饱和脂肪酸藻类制品，其特征在于，每克藻类制品生物质中硒含量至少为0.042mg；
优选的，每克制品中多不饱和脂肪酸含量至少为0.21g；
优选的，多不饱和脂肪酸为ω3类别的多不饱和脂肪酸；
进一步优选的，多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸。
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