CN103937844B

CN103937844B - 一种添加表面活性剂的培养基及其应用

Info

Publication number: CN103937844B
Application number: CN201410120965.4A
Authority: CN
Inventors: 常明; 李婧; 刘睿杰; 王兴国; 金青哲; 黄健花; 邹孝强; 王小三; 刘元法
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-03-27
Filing date: 2014-03-27
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2034-03-27
Also published as: CN103937844A

Abstract

本发明公开了一种添加表面活性剂的培养基及其应用，其中，添加表面活性剂的培养基，以甘油或葡萄糖为主要碳源，浓度为10～120g/L；以酵母提取物和/或谷氨酸钠为主要氮源，浓度为5～50g/L；无机盐组分包括Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O；维生素VB₁、VB₆、VB₁₂；分别添加吐温20、吐温40、吐温60或吐温80。本发明通过在培养基中添加适宜浓度的表面活化剂，来改变微生物细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长；采用本发明所述技术方案，可以提高底物的转化率，且不需要额外的人工或设备投入，从而有效降低裂殖壶菌的发酵成本。

Description

一种添加表面活性剂的培养基及其应用

技术领域

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及添加有表面活性剂的培养基及其在裂殖壶菌发酵中的应用。

背景技术

二十二碳六烯酸（22:6n-3）（DHA）是一种重要的ω-3系列多不饱和脂肪酸（ω-3polyunsaturated fatty acids），具有促进婴幼儿智力和视力发育、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、增强免疫力等功效。深海鱼油是ω-3多不饱和脂肪酸的传统主要来源，但是存在着诸多问题，例如品质不稳定、外源性污染、气味不良、纯化成本高等，鱼油中含有的EPA和胆固醇也使其不适于添加入孕婴食品中。相反，微生物油脂（single cell oils，SCO）不但容易实现大规模生产，同时还克服了传统鱼油普遍存在受地域和气候条件制约的问题，应用前景广阔。

裂殖壶菌（Schizochytrium）属于破囊壶菌科的一类海洋微藻，是目前工业化生产DHA的理想物种之一。裂殖壶菌胞内可积累大量脂肪，且70%以甘油三酯形式存在，其中DHA可以占到总脂肪酸的35～45%。同时，裂殖壶菌油脂还含有许多生理活性物质，如色素（β-胡萝卜素、叶黄素、虾青素等）、角鲨烯和甾醇等。Schizochytrium藻油的安全性已得到美国FDA认可，2012年3月我国卫生部出台了《食品营养强化剂使用标准》GB14880—2012，批准Schizochytrium藻油DHA可用于婴幼儿配方食品。

吐温是山梨醇酐脂肪酸酯的环氧乙烷加成物（加成数为20），化学名称为聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯。吐温作为非离子型表面活性剂，亲水性强，广泛用作乳化剂和油类物质增溶剂等。吐温系列包含有吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，分别为聚氧乙烯山梨醇酐单月桂酸酯、单棕榈酸酯、单硬脂酸酯和单油酸酯。

目前，表面活性剂用于裂殖壶菌培养基添加物的研究未见报道。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有添加表面活性剂的培养基及其应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供添加表面活性剂的培养基，以改变微生物的生理学性质。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种添加表面活性剂的培养基，以甘油或葡萄糖为主要碳源，浓度为10～120g/L；以酵母提取物和/或谷氨酸钠为主要氮源，浓度为5～50g/L；无机盐组分包括Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄·7H₂O；维生素VB₁、VB₆、VB₁₂；添加吐温20、吐温40、吐温60和吐温80中的一种或几种。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基的一种优选方案，其中：所述吐温20添加量体积含量为0.01～2%；吐温40添加量体积含量为0.01～2%；吐温60添加量体积含量为0.01～2%；吐温80添加量体积含量为0.01～2%；混合组分添加量体积总量为0.01～2%。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基的一种优选方案，其中：所述甘油或葡萄糖的浓度为30～100g/L。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基的一种优选方案，其中：所述酵母提取物和/或谷氨酸钠的优化浓度为10～25g/L。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基的一种优选方案，其中：所述无机盐中Na₂SO₄的浓度为7～15g/L；KH₂PO₄的浓度为0～3g/L；K₂HPO₄的优化浓度为0～2g/L；MgSO₄·7H₂O的浓度为2～4g/L；K₂SO₄的浓度为0.5～2g/L。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基的一种优选方案，其中：所述维生素中VB₁的浓度为0.005～0.02g/L；VB₆的浓度为0.001～0.005g/L；VB₁₂的浓度为0.005～0.02g/L。

本发明的另一个目的是提供了添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，通过在裂殖壶菌发酵生产时添加适当浓度的表面活性剂，达到了提高藻油生产效率和DHA产量的目的。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用的一种优选方案，其中：所述裂殖壶菌为裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）SR21，ATCCNo：1381。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用的一种优选方案，其中：所述裂殖壶菌以5～10%的接种量接入所述培养基中。

作为本发明所述添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用的一种优选方案，其中：所述裂殖壶菌的发酵培养温度为20～30℃，pH值为4～8，转速为180～220rpm，振荡培养时间为4～6天。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

（1）本发明通过在培养基中添加适宜浓度的表面活化剂，来改变微生物细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长；

（2）本发明所述表面活化剂分别为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80，它们单独添加或混合添加均能显著提高裂殖壶菌的油脂和DHA产量；

（3）采用本发明所述技术方案，可以提高底物的转化率，且不需要额外的人工或设备投入，从而有效降低裂殖壶菌的发酵成本。

附图说明

图1表明本发明中吐温20添加量对裂殖壶菌生物量的影响示意图；

图2表明本发明中吐温种类对裂殖壶菌生物量的影响示意图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

以下实施例中所用菌种为：裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）SR21，ATCC No：1381。

实施例1：吐温20添加量对裂殖壶菌发酵的影响

裂殖壶菌种子培养基：甘油30g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸钠5g/L、Na₂SO₄15g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O3g/L、K₂SO₄1g/L、VB₁0.005g/L、VB₆0.002g/L、VB₁₂0.005g/L。

裂殖壶菌发酵培养基：甘油100g/L、酵母膏10g/L、谷氨酸钠15g/L、Na₂SO₄15g/L、KH₂PO₄3g/L、K₂HPO₄2g/L、MgSO₄·7H₂O3g/L、K₂SO₄1g/L、VB₁0.008g/L、VB₆0.002g/L、VB₁₂0.008g/L。

然后在裂殖壶菌发酵培养基中加入吐温20，添加量分别0.1%、0.5%和1.0%（V/V）。以不添加吐温作为对照。

种子培养两代，每代在装液量50mL/250mL三角瓶中进行，接种量8%（V/V），25℃、200rpm下摇床培养48h。第二代种子按8%（V/V）的接种量接入装液量50mL/250mL三角瓶中，发酵条件为25℃、200rpm。

实验结果如图1、表1和表2所示：

表1 吐温20添加量对总脂与DHA含量及产量的影响

结果表明：吐温20添加量为0.1%、0.5%和1.0%时，裂殖壶菌生物量分别比对照组的36.34g/L提高了5.16g/L、2.68g/L和3.26g/L。吐温20对总脂积累有明显的提升效果，添加量从0.1%到1.0%时，总脂含量由占细胞干重62.40%分别提高到65.52%、68.01%和73.27%，总脂产量由22.68g/L最大提高到了29.01g/L。吐温20对DHA占总脂肪酸含量没有明显的影响。但鉴于生物量与总脂含量的提高，DHA产量分别比对照组提高了24.49%，23.56%和28.68%。因此1%（V/V）吐温20对裂殖壶菌油脂及DHA产量有显著的提升效果。

吐温20分子上连接有脂肪酸C14:0。从裂殖壶菌脂肪酸分布来看，如表2所示，添加吐温20后，C12:0、C14:0占总脂肪酸的百分含量均有所提高，并随添加量的增加而增大；与此同时C16:0显著降低，由对照组的37.54%降至33%左右；DPA与DHA的百分量基本维持不变。

实施例2：吐温种类对裂殖壶菌发酵的影响

裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。

在裂殖壶菌发酵培养基中分别加入吐温20、吐温40、吐温60或吐温80，添加量均为1.0%（V/V）。以不添加吐温作为对照。

实验结果如图2、表3和表4所示：

表3 吐温种类对总脂与DHA含量及产量的影响

表4 吐温种类对裂殖壶菌脂肪酸组成的影响

结果表明：添加量1.0%（V/V）的吐温20、吐温40对裂殖壶菌生物量的提升有明显促进作用，分别比对照组的36.34g/L提高了3.26g/L和3.53g/L。4种吐温对总脂积累均有明显的提升效果，总脂含量由占细胞干重62.40%均提高到73%左右。1%的吐温20和吐温40使总脂产量由对照组的22.68g/L提高到了29g/L以上。4种吐温对DHA占总脂肪酸含量均没有明显的影响。但鉴于生物量或/和总脂含量的提高，DHA产量分别比对照组提高了28.68%、29.33%、16.29%和20.67%。

吐温20、40、60和80分子上连接的脂肪酸分别是C14:0、C16:0、C18:0和C18:1，如表4所示，不同吐温的添加导致裂殖壶菌中相应的脂肪酸在总脂肪酸中的比例将有所提高。

实施例3：混合组分对裂殖壶菌发酵的影响

裂殖壶菌培养基组成及培养方法如实施例1所述。

在裂殖壶菌发酵培养基中同时加入吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，添加量均为0.25%（V/V）。以不添加吐温作为对照。

实验结果如表5和表6所示

表5 混合组分对发酵参数的影响

表6 混合组分对裂殖壶菌脂肪酸组成的影响

结果表明，将4种吐温混合添加入培养基中，同样可获得提高生物量、总脂含量与DHA产量的效果；脂肪酸分布情况较单一添加时变化幅度小。

由此可见，本发明实际上是通过在发酵培养基中添加表面活性剂，改变微生物的生理学性质，提高代谢产物的合成，促进生长与呼吸，以及改变细胞膜结构和渗透性。具体为通过在裂殖壶菌发酵培养基中添加适宜浓度的表面活化剂，来改变细胞膜渗透性、增强底物与氧气传质、促进生长、提高脂质积累，从而提高藻油生产效率和DHA产量。所述表面活化剂分别为吐温20、吐温40、吐温60和吐温80，它们单独添加或混合添加均能显著提高裂殖壶菌的油脂和DHA产量。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.一种添加表面活性剂的培养基，其特征在于：

以甘油或葡萄糖为主要碳源，浓度为10～120g/L；

以酵母提取物和/或谷氨酸钠为主要氮源，浓度为5～50g/L；

无机盐组分包括Na₂SO₄、KH₂PO₄、K₂HPO₄、K₂SO₄、MgSO₄.7H₂O；

维生素组分包括VB₁、VB₆、VB₁₂；

添加吐温20、吐温40、吐温60和吐温80中的一种或多种；

所述吐温20添加量体积含量为0.01～2％；吐温40添加量体积含量为0.01～2％；吐温60添加量体积含量为0.01～2％；吐温80添加量体积含量为0.01～2％；吐温混合组分添加量体积总量为0.01～2％；

所述无机盐中Na₂SO₄的浓度为7～15g/L；KH₂PO₄的浓度为0～3g/L；K₂HPO₄的浓度为0～2g/L；MgSO₄.7H₂O的浓度为2～4g/L；K₂SO₄的浓度为0.5～2g/L；

所述维生素中VB₁的浓度为0.005～0.02g/L；VB₆的浓度为0.001～0.005g/L；VB₁₂的浓度为0.005～0.02g/L。

2.一种如权利要求1所述的添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)SR21，ATCCNo：1381。

3.根据权利要求2所述的添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌以5～10％的接种量接入所述培养基中。

4.根据权利要求2或3所述的添加表面活性剂的培养基在裂殖壶菌发酵中的应用，其特征在于：所述裂殖壶菌的发酵培养温度为20～30℃，pH值为4～8，转速为180～220rpm，振荡培养时间为4～6天。