CN102333880A - 发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法 - Google Patents
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Abstract
本发明包括在高含氧条件下,通过固态发酵或者分批、半连续或连续的深层发酵,由破囊壶菌(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法。在发酵刚开始时添加大于200g/L和直到450g/L的葡萄糖,进行分批发酵得到产量大于10g/L的DHA。该方法包括保持至少20%~30%的溶解氧,有时高达50%左右或以上。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产二十二碳六烯酸的改进方法。更具体的,其涉及含有豆粕(soybean meal)和其它用于促进脂肪生产的营养成分的培养基组合物,更具体的,涉及在液体以及固体培养基中由破囊壶菌(Thraustochytriales)分批发酵生产的多不饱和脂肪酸。本发明还涉及发酵生产二十二碳六烯酸的新方法。
背景技术
必需脂肪酸是指那些在有机体的健康中必不可少,但动物/人体又不能合成,而必须通过食物来源提供的脂肪酸。ω-6脂肪酸和ω-3脂肪酸即属于这类脂肪酸,它们在大脑功能以及正常生长和发育中发挥着至关重要的作用。这两种必需脂肪酸属于多不饱和脂肪酸(PUFA),在刺激皮肤和毛发生长、维持骨骼健康、调节新陈代谢和保持生殖能力中通常是必需的。
在ω-3的位置具有一个碳-碳双键的多不饱和脂肪酸家族被称为ω-3脂肪酸。分别在18、20或22个碳原子碳链的顺式构型中具有3、5或6个双键的α-亚麻酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸,被认为是对人类营养具有重要作用的ω-3脂肪酸。
在ω-3脂肪酸中,长链-PUFA,也缩写成LC-PUFA,按照定义,是指链长超过18个碳原子且含有两个或更多双键的脂肪酸。一种在婴儿营养中具有重要作用的脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。这种脂肪酸在人类乳汁中存在的浓度很低。
足月儿和早产儿都可以从各自的必需脂肪酸中合成LC-PUFA,但争议集中在母乳喂养的婴儿比配方奶喂养的婴儿具有更高的DHA血浆浓度的事实上。该信息被解读为意味着配方奶喂养的婴儿不能合成足够的DHA以满足持续的需求(参见“A shore-based diet rich inenergy and‘brain-specific’nutrients made human brain evolutionpossible”(“富含能量的岸基饮食和脑特异性营养品使人类大脑进化成为可能”):Proceedings of the Ghent Conference on Water and HumanEvolution by Stephen C.Cunnane Department of Nutritional Sciences,University of Toronto,inhttp://users.ugent.be/~mvaneech/Cunnane.html)。
美国国立健康研究院公布了推荐的脂肪酸每日摄入量。根据公布,EPA与DHA推荐的摄入量为650mg/d,α-亚麻酸为2.22g/d和亚麻酸为4.44g/d,且饱和脂肪推荐摄入量为不超过总热量摄入量的8%或约18g/d。
EPA和DHA的唯一可行的常规来源是鱼,且仅是被称为“油鱼”特定种类的鱼。为了满足推荐的DHA每日需求,美国心脏协会的推荐书(http://www.americanheart.org/presenter.jhtml?identifier=4632)发布了一个科学公告:“我们建议每周至少食用2次鱼(尤其是富含脂肪的鱼)。——富含脂肪的鱼类,如鲭鱼、湖红点鲑、鲱鱼、沙丁鱼、长鳍金枪鱼和鲑鱼富含两种ω-3脂肪酸、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)。——我们还推荐食用豆腐和大豆、油菜籽、核桃和亚麻子等其它形式以及它们的油。它们含有α-亚麻酸(LNA),其可以在体内变成ω-3脂肪酸。然而,这种修饰的程度是适度的并存在有争议。需要更多的研究来表明α-亚麻酸和心脏病之间的因果关系。”然而,几乎没有一个可行的来源以满足潜在的需求,因为需求高于通过食用油鱼获得的补给。极少数美国人能为自己得到这种配额,原因主要有两个,可获得性和成本。因此,从生态可持续性的观点来看,鱼不是膳食DHA的可行供给来源。此外,已知鱼含有高含量的汞,而这也限制了它的摄入量,并禁止儿童和孕妇食用。进一步地,鱼类还含有约六倍量的ω-6脂肪酸,从而抵消了DHA的治疗作用。
鉴于传统的DHA来源不足,海洋原生生物已经成为焦点,通过其异养生产DHA作为DHA的替代来源。因此,改良这些有机体(organism)的异养生产效率来生产DHA是非常理想的。
现有技术
US5340742要求保护一种培养破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)及其混合物的方法,其培养基中含有小于约3克氯化物/升所述培养基、碳源、氮源、微量营养素和非氯化物钠盐,温度约5℃至约48℃,pH值约5.0至约11.0。
Kyle等人在US5407957中描述了一种方法,其中单细胞食用油含有至少约20%甘油三酯形式的二十二碳六烯酸(DHA),该方法包括在含有营养液的通气发酵罐中培养能产生所述单细胞油的沟鞭藻纲(Dinophyceae)异养微藻,所述营养液具有限制性的氮源和至少约10%空气饱和水平的氧水平,并继续培养至每升营养液的细胞密度达到至少约10克生物质(biomass)。
Kumar等人在US 6410282中描述了一种在破囊壶菌属(Thraustochytrid)真菌中能增加二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸水平的方法,其通过在培养基中于25℃~30℃培养破囊壶菌属真菌菌株Ulkenia radiata Gaertner 2至5天,该菌株保藏在日本生物科学与人类技术国立研究所,登记号为No.AB22115;将破囊壶菌属真菌菌株接种于含有0.1至1%聚乙烯吡咯烷酮的培养基中,在25℃至30℃培养3天;离心收集细胞,从细胞中提取含量增加的二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸。
US6451567描述了一种通过在发酵培养基中生长广盐性微生物来生产脂类的方法,其中所述广盐性微生物每天每升发酵培养基能生产约1.08克长链ω-3脂肪酸。培养基由40克糖/升发酵培养基组成,钠离子浓度为发酵培养基中60%海水。该方法进一步公开广盐性微生物的指数增长率在25℃下和30℃下分别为每天至少约5倍和每天7倍。
Barclay在US6566123中报道了包括选自破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物菌群的生物质,其中所述微生物菌群通过如下方法产生:在约5℃至约48℃的温度下,在含有小于约3克氯化物/升所述培养基、碳源、氮源和营养物质以及非氯化物钠盐的培养基中,使所述微生物菌群生长。
Bailey等人在US6607900中描述了以破囊壶菌目的微生物进行补料分批发酵生产含多烯脂肪酸的脂类的方法,产生至少约20%其干细胞重作为脂类,该方法包括向包括所述微生物的发酵培养基中,以足以使所述发酵培养基的生物质密度增加到每升至少约100克于细胞重的速率,加入无酒精碳源和氮源,其中所述方法包括生物质密度增加阶段和脂类生产阶段,其中在所述生物质密度增加阶段,所述发酵培养基中的溶解氧水平在所述发酵培养基中至少约为4%的饱和度,且在所述脂类生产阶段,所述发酵培养基中的溶解氧水平在所述发酵培养基中小于约3%的饱和度。
Barclay在US 7005280中报道了一种用于生产脂类的方法,包括:(a)使破囊壶菌目微生物在发酵培养基中生长;以及(b)从所述微生物中提取脂类,其中所述脂类含有作为C22:6n-3(DHA)的至少94.0%重量的总ω-3脂肪酸。
US7011962描述了一种生产脂类的方法,通过使破囊壶菌目微生物在发酵培养基中生长,并从所述微生物中提取脂类,其中所述脂类至少约49%的总脂肪酸是ω-3脂肪酸;其中所述微生物在下列条件下生长时其指数增长率为每天至少约5.5倍:25℃下在轨道摇床上的摇瓶中于M-5培养基中生长的指数生长期。将12ml含有指数生长期所述微生物的培养基接种到含有50ml M-5培养基的250ml摇瓶中,调整pH至7.0,将所述摇瓶以200rpm的转速在轨道摇床上摇动22.75小时。
Behrens在US7163811中描述了一种通过在培养基中培养沟鞭藻纲的异养微藻生产二十二碳六烯酸(DHA)的方法,其中所述培养基包括:(a)氯离子浓度小于或等于约2g/L;以及(b)钾离子浓度大于或等于约0.25g/L;其中,每109个微藻细胞生产至少约0.04g DHA。
US7022512要求保护一种选自下组的分离的微生物:a)裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC No.20888或其衍生菌株;b)裂殖壶菌ATCC No.20889或其衍生菌株;c)破囊壶菌(Thraustochytrium)ATCCNo.20890或其衍生菌株;d)破囊壶菌ATCC No.20891或其衍生菌株;以及e)破囊壶菌ATCC No.20892或其衍生菌株。破囊壶菌、裂殖壶菌及其混合物生长在含有非氯化物钠盐尤其是硫酸钠的发酵培养基中,并产生细胞集聚体(cell aggregate size)的微生物菌群,用于生产水产养殖用食品和包含破囊壶菌、裂殖壶菌及其混合物的食品,以及一种选自亚麻籽、油菜籽、大豆和鳄梨膳食的成分。这类食品含有均衡的长链和短链ω-3高度不饱和脂肪酸。
US 20060286649指出,生产含有多烯脂肪酸特别是高度不饱和脂肪酸,如C18:4n-3、C20:4n-6、C20:5n3、C22:5n-3、C22:5n-6和C22:6n-3的微生物脂类的成本一直很高,部分原因是含有高多烯脂肪酸的真核微生物的生长密度有限。US 20060286649还指出,试图在分批发酵中获得高密度存在着一些困难。有限的氧供给在这些高细胞浓度和较高的温度下需要实现高生产率是局限性之一。因此,需要一种在高浓度下生长微生物的方法,这种高浓度仍然有利于增加含多烯脂肪酸的脂类的产量。其进一步指出,非常高密度的培养(大于约100g/L的微生物生物质,特别是在商业模式下),不会得到高产量的多不饱和脂肪酸,实际上可能会导致多烯脂肪酸含量的减少,并因此减少多烯脂肪酸的生产率,部分原因是由于几个因素,包括由于发酵培养基中微生物发育的高氧需求,导致保持高溶氧水平存在困难。其指出保持高溶氧水平的方法,包括增加通气率和/或使用纯氧代替空气通气和/或增加发酵罐中的搅拌速率,但是,它也指出,它们可能造成其他问题,包括发酵罐中严重的泡沫问题,微生物细胞破损导致脂类释放到发酵液中,在那里它们可能被氧化和/或被酶降解,最终转化为基本上只含有非常少量多烯脂肪酸的脂类。其图1提供的数据揭示了溶解氧水平在5至40%之间的各种浓度下获得的DHA的生产率,溶解氧水平为5%时生产率为11.3%至溶解氧水平为40%时生产率为5.6。相应的DHA g/L的数据分别为2.0至1.0。因此,US20060286649气馁地使用氧气鼓泡和搅拌的方法提高发酵效率。此外,其还承认(第0029段)当向分批发酵方法中添加基质时,产生了大量碳源(例如每60g/L生物质密度超过200g/L或以上),对微生物有不利的影响。为了规避这些问题,US 20060286649披露了一种新的方法来生产多烯脂肪酸,包括通过补料分批的方法实现干细胞至少100g/L的高细胞密度,以增加生物质密度,向其中增加少量的营养物,发现该方法中不需要提高溶解氧的浓度就能达到高细胞密度,然后通过实际降低氧浓度最好到百分之零,切换到脂类生产阶段,导致增加多烯脂肪酸的产量。分批培养也有明显的局限性,US 20060286649的实施例5得出结论,在一般情况下,多余的氮对发酵性能有负面影响,观察到DHA的生产率显著减少,因为缺乏足够的氮,会对可利用的碳有限制,分批方法限制了DHA的生产率。因此,US20060286649最后决定,排除了分批方法作为可行的方案用于高密度培养和利用破囊壶菌目提高DHA生产系统的生产率。他们发明了分批方法中允许增加增量的营养物,而不需要含量非常高的溶解氧水平。据报道,在生物质密度增加的阶段,通过控制顶空的氧量保持氧浓度约为8%,这已经足够支持干生物质密度的生产量在约100g/L或更多,通过控制发酵培养基的搅拌速度足以支持细胞在补料分批模式下的生长,但避免了细胞破损。特别是避免超过8%的溶解氧,从而避免上述指出的导致DHA产量降低的不利影响。
然而,补料分批发酵方法在实际操作中优化生产率和控制污染方面很繁琐。分批方法比较容易控制和优化,培养基组合物的发酵和接种只涉及一次操作。因此,有必要尽可能克服分批方法的已知限制。此外,还需要探讨可替代的发酵方法。
发明概述
本发明提供了通过培养破囊壶菌(Thraustochytriales)实施异养发酵的新方法。
本发明包括在高含氧条件下,由破囊壶菌生产多不饱和脂肪酸的方法,其是通过(a)固态发酵,其中固体培养基发酵时喷入充足的无菌空气,或通过(b)在深层发酵(submerged fermentation)的整个发酵过程中,通过保持溶解氧的饱和度大于8%,获得大于2g DHA/升发酵培养基。
本发明的各种实施方案概括如下。
在一个深层发酵的实施方案中,本发明可包括分批发酵、半连续发酵或连续发酵。
在另一个方面,本发明的方法包括分批发酵,其中,通过保持培养基中溶解氧水平至少20%,产量高于现有技术中常规分批发酵所获得的产量,即获得的DHA产量为1.3g/L,优选大于3g/L,更优选大于10g/L。
在另一个方面,该方法包括通过采用一种或多种下列方法保持溶解氧水平至少20%:包括(a)向培养基中喷入混有氧的空气,(b)以800rpm的转速搅拌培养基,可包括提高搅拌头(agitation tip)速度至3.2m/sec,(c)切换到气体混合模式,其中将纯氧与空气混合并喷入发酵液中,以保持溶解氧的水平并在需要时阻止溶解氧低于目标水平或者50%左右或以上的饱和度。本发明的一个方面是单独或组合利用上述方法来增加溶解氧的水平,不会对细胞造成不良影响,并有助于保持高细胞密度,不引起细胞破碎。
在另一个方面,本发明包括获得生物质密度为大于100g/L细胞干重,积累的DHA为2g/L或优选大于10g/L的方法。
在另一个实施方案中,获得高产量的DHA,喷入的氧气与空气的比例为1%~60%氧气。本发明中使用的“喷入(sparged)”一词表示在压力下泵入培养基中,形成大量和有力的微小气泡流,使培养液与空气气泡良好地接触,并形成良好的搅拌效果。
在另一个方面,本发明的分批发酵的方法进一步包括在分批发酵开始时,向发酵液中添加还原糖至高达450g/L。
在另一个方面,本发明的分批发酵,其中添加无机氮或尿素氮,并补充添加来自含有氨基化合物的有机氮。所述含肽键的有机氮可以是富含蛋白或富含肽的来源或者氨基酸。所述富含蛋白的来源包括含有脱脂大豆粉的脱脂油渣饼。
在另一个方面,本发明包括辅助添加消泡剂,包括食品级有机硅消泡剂。
在一个方面,本发明的方法可以是半连续方法,包括步骤:(a)在第一发酵罐中,使一批发酵达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,(b)在第一发酵罐中保留一部分发酵液,其体积足以给下一批提供活跃分裂的接种物,无菌转移其余的活性发酵液至第二反应器中,(c)向第一反应器中加入无菌发酵培养基以恢复其体积,并使第一反应器进行步骤(a)并重复该步骤至所需的次数,或任选地(i)允许步骤(d)平衡体积(balance volumn)或(ii)通过向第一反应器中加入无菌发酵培养基恢复其体积,使其完成进一步的生长和脂质生产,所述脂质将在结束该系列半连续生产时收获,(d)为第二发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,(e)回收DHA。
在另一个方面,本发明包括上述连续发酵的方法,包括步骤:(a)在第一发酵罐中,使一批发酵液达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,(b)采取预防措施避免污染物进入,开始向第一发酵罐中加入无菌培养基,并允许无菌排出或移出相同体积的发酵液至第二发酵罐中,移出速率为第一反应器的内容物始终保持在对数生长期,(c)为第二批发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,(d)第二发酵罐达到其发酵能力后,从第二发酵罐中无菌排出或移出超过其能力的培养基,(e)立即回收或隔一段时间后回收DHA。
在另一个实施方案中,本发明包括权利要求所述的固态发酵的方法,包括步骤:(a)通过添加刚够用于湿润的水制备润湿但不流动的固体基质,其包括(i)含量为不抑制渗透压水平的葡萄糖,(ii)用于提供碳水化合物、维生素、微量元素的谷物和来自真核生物的有机蛋白氮,以及(iii)淀粉酶,(b)将无菌混合固体基质平铺到托盘上一薄层,使得该薄层与流经托盘的空气不抑制地接触,(c)在无菌通气的无菌条件下对其进行培养,(d)控制温度低于26℃。(e)根据上述方法,其中所述的薄层约3mm厚。(f)根据上述的方法,其中用于发酵的微生物是破囊壶菌或裂殖壶菌。
在另一个实施方案中,本发明包括向发酵液中喷入氧气以保持高含量的溶解氧。根据需要,可优选将氧气与空气按1%~60%的比例混合喷入。
在一个方面,本发明的方法是分批发酵法,包括在发酵开始加入所有营养物质,得到干生物质密度至少约100g/L发酵培养基,一般约120~130g,DHA产量至少约10g/L,一般每升培养基约12~15g。
在另一个方面,碳水化合物养分可以是能发酵的单糖,在发酵开始时全部加入,加入的量足以获得至少100g/L的细胞干重密度。
发明详述
本发明也包括固态发酵,且为使其区别于液态发酵,后者被称为“深层发酵”。
在本发明的方法中,设计了在整个发酵中提供高浓度溶解氧的方法,可避免已知的保持高浓度溶解氧的不利影响,并获得DHA产率高于已知的在高溶解氧浓度下常规分批发酵法获得的DHA产率,其中这些不利影响涉及细胞的高度破碎,抑制脂类生产阶段的DHA合成等。分批发酵,是目前最简单和最受欢迎的方法,其优化受到进一步关注,并可由以下结果得以反映。作为替代模式的的固态发酵、半连续发酵和连续发酵的结果仅是探索性试验的结果,因为它们的确较常规的分批发酵方法显示出更高的产率,且由于它们存在很大的进一步优化和改善的余地而被报道,随着时间的推移,它们可能显示出比本发明中更高的产率。然而,即使是目前的初步结果,它们已经表现出优于常规的分批发酵法,并的确显示出创造性的方法前景,具有通过发酵提高DHA产率的较大潜力。
为了比较本发明方法的DHA产率,现有技术中常规的分批培养方法有关DHA在各种溶解氧浓度下g/L的DHA产率,如US2006/0286649的图1中公开的有关数据正好合适。该数据涉及的是裂殖壶菌ATCC20888,其中在溶解氧为5~20%范围内,报道的DHA产率为2.0~1.0g/L。在不同菌株之间产率会有差异。然而,该结果可用于比较相同菌株在不同方法中的产率以作为绝对有效的可比标准以及用于与其它裂殖壶菌菌株进行比较的至少相对有效的标准。在此基础上,20%溶解氧,1.3g/L的产率的结果可用作评价本发明方法得到的产率的基准,至少采用20%及更高的溶解氧的分批发酵,以及将约20%或更高的溶解氧用于半连续和连续发酵方法。在固态发酵过程中,虽然没有确定溶解氧的百分数,但可以合理的假设,在深层发酵中微生物可获得的氧气至少为固态发酵中微生物可获得的氧气,其中固体基质以3mm的厚度在托盘中发酵,无菌空气流经基质的表面。
与现有技术知识的启示相反,如在最近的US2006/0286649文献中详细讨论了仅在生物质增加阶段适当增加了溶解氧浓度,在脂类生产阶段减少氧气供应,高浓度还原糖的不利影响,高氮水平的不利影响和可采用的基于脂类和DHA产量的提高溶解氧水平的方法的不利影响,其由细胞破碎、泄漏和脂类氧化引起,完全抛弃了通过发酵提高含氧量作为可行的提高DHA产率的观念。令人惊讶地发现本发明提供了持续、高水平的高于8%,高达20%~30%的溶解氧,在某些情况下甚至可设计高达50%,可从破囊壶菌发酵中获得该明显高的DHA产率为约10g/L或更高。
最令人惊讶的是,分批发酵在发酵刚开始添时加了大于200g/L和直到450g/L的还原糖,其中高浓度还原糖的障碍是可以克服的,用于转换必需的全部氮可在发酵刚开始时加入,氧含量开始迅速下降,细胞密度上升,可维持在20%或高达30~50%,同样没有细胞破碎。这是一个令人惊讶的发现组合的结果,微生物能承受高浓度的还原糖,同时发现在高含量还原糖的每升发酵液中,通过本发明人发现的技术的组合提供对溶解氧的高需求而没有细胞破碎,对氮的高需求可通过有机氮的分批添加来实现,它是来自真核生物蛋白的氨基形式,并不昂贵。在本发明中,脱脂大豆粉因蛋白含量高、成本低和容易获得被用来补充氨基氮。在这方面,可使用其它氮来补充氨基氮,如低成本的肽或氨基酸。
实现还原糖高浓度发酵能力的重要性可以从以下事实看出,一方面,它们不耐受高浓度的还原糖,分批发酵要求所有的碳源在发酵开始时添加,发现这些微生物不直接利用双糖或多糖。采用含双糖的发酵液用于任一微生物,即裂殖壶菌ATCC MYA 1381、裂壶藻ATCC28209、破囊壶菌PRA 148生长,产生很少量的脂类和DHA。单糖是最好的碳源如葡萄糖、果糖等,其似乎没有替代物。如果复合多糖的来源使用如稻谷、手指小米(ragi)、高粱等,避免一开始高浓度的还原糖,随着时间的推移,可加入能水解它们的酶,引起简单糖类的形成,简单糖类可被微生物吸收,高产DHA。然而,该酶的价格昂贵,其性能易于重复。
据发现,通过增加搅拌头速度高达3.2m/sec初始可获得保持溶解氧含量为20~30%且没有细胞破碎。在发酵的高级阶段,溶解氧开始降至低于30%,除了以所述搅拌头速度搅拌外,通过将发酵罐切换至气体混合模式,其中纯氧与空气按比例混合并喷入发酵罐内培养基中,可恢复溶解氧含量且没有细胞破碎,并保持较高DHA产率。混有纯氧的空气可携带1~60%氧气。
增加的超过3.2m/sec的搅拌头速度因细胞裂解而对微生物产生不利影响。气体混合下的空气流动可增加至高达0.7VVM,高于1VVM导致细胞裂解。没有细胞破碎的氧气和空气比例为1%~60%氧气细胞破碎。在本发明的一个实施方案中,通过将提高转速、混合气体下的空气流动以及空气和氧气的比例进行适当组合,有可能维持发酵过程中溶解氧百分数高达30~50%而不导致细胞破碎。
DHA在发酵液中的g/L产率根据使用的菌株而有所不同,结果可见试验7、9和10。然而,从使用裂殖壶菌ATCC 20889的实施例no.7和8得到的结果可以证明,溶解氧供应的增加导致DHA的g/L产率的大幅增加。在实施例7中,溶解氧浓度保持在20%或以上。氧混合物用于保持溶解氧水平为20%或以上。在实施例8中,通过增加空气流通至高达800rpm的转速,保持溶解氧含量为20%。然而,从48小时至发酵结束,溶解氧含量在没有氧气泡的情况下几个小时后跌至低于5%。实施例7的总干生物质积累为84g/L,而在实施例8中总干生物质积累为44.8g/L。相应的DHA分别为实施例7的12g/L和实施例8的4.2g/L。
在另一个实施方案中,本发明发现,可通过无机添加剂安全添加的分批发酵所需的超量的氮,可以含氨基氮的有机化合物的形式加入。
对采用半连续、连续和固态发酵作为在高氧浓度下生产DHA的替代性方法进行了探索。它们在探索性试验中全部产生了令人满意的DHA量,当需要替代分批发酵法时,可进行优化以表现出它们生产DHA的最佳潜力。
通过保持溶解氧含量为30%或更高,在半连续发酵中也可获得100g/L左右的高干生物质细胞密度。
固态发酵是最简单的达到高含量氧的方法。这是作为一种替代性技术而研发,有待进一步优化以充分发挥其潜力。固体基质发酵的探索性试验结果1.5g/kg(试验1)和1.87g/kg(试验2)高于常规的分批发酵如在US2006/0286649中所述的在20%溶解氧发酵下的1.3g/LDHA的分批发酵结果。虽然没有进行固体基质中溶解氧的测定,通过与3mm厚的发酵培养基表面流经的空气中的氧自由接触,其与20%溶解氧的状态是等同的。通过改变发酵条件如培养基组成可能改进固体基质体系的发酵效能,通过引入条件引入发酵固体基质与携带有正常或补充氧的空气的混合。
本发明的深层发酵包括喷入高体积的空气-气体混合物,所产生的泡沫通过向培养基中添加消泡剂来解决。优选的消泡剂是食品级消泡剂。更优选为有机硅消泡剂。然而,其它等效的消泡剂也可用于本发明中。固体基质可由豆粉(soy gritts)、粗小米粉、麸皮等与已知微量的水混合组成,然后进行灭菌。之后用已知量的水稀释制备的种子接种物,再与灭菌的固体基质充分混合,铺于无菌托盘上。随后在最初的48小时内,将托盘置于18~24℃孵育,然后升温至22~26℃,保持该温度直到培育期达到120~150小时。然后将固体基质从托盘中取出,浸渍或研磨,并用合适的溶剂处理用于脂肪酸提取。固体基质浸泡在溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、醋酸乙酯等中16~24小时,接着收集提取物。然后通过气相色谱分析提取物。
在由微生物生产脂类的半连续发酵法中,通过在20~30℃,pH值4.0~7.0以及最初24小时内高于50%氧饱和度,在随后的48小时内高于30%的由PID控制的氧和气体混合的条件下,进行分批发酵产生细胞干重发酵的生物质高达约85g/L,不让其达到发酵液的细胞干重100g/L即排出部分发酵培养基,同时向该分批发酵中补充新鲜的培养基,使发酵在相似的条件下继续进行产生细胞干重的发酵生物质,再次排出部分发酵物质并再次补充培养基。重复该循环。以上描述的半连续发酵法也适合于培养基中细胞干重的发酵培养基生物质密度达到大于100g/L的方法。
将排出的发酵培养基收集于另一个生物反应器中,其中或者立即从该批发酵培养基中提取脂类,或者在20~30℃,pH值3.0~6.0下生产脂类,在一段时间内不让其干重生物质密度超过100g/L,然后回收生产的脂类,接着获取脂类生产的很多生物质。也可使干重生物质密度进一步尽可能地提高,然后回收脂类。在探索性试验中获得18gDHA/L的产率,通过进一步优化可进一步改善。
在另一个实施方案中,从微生物中生产脂类的连续发酵法是在温度20~30℃pH值4.0~7.0的条件下,在最初48小时于发酵罐中以高于50%的纯氧混合空气进行分批发酵,然后以一定的速率持续排出发酵物质,并以约相同速率向第一发酵罐中持续补充新鲜无菌培养基,以这种方式,发酵罐中发酵培养基体积保持基本恒定的培养基生物质密度,没有达到或超过细胞干重100g/L。将排出的培养基收集于第二个生物反应器中,其中或者提取脂类,或者一段时间内在有益于脂类生产的温度下,于pH值3.0~6.0进行进一步的脂类生产步骤,然后回收产生的脂类;将用于排出的培养基的该方法重复应用于随后排出的培养基的分批发酵中。以上描述的连续发酵法可适合于培养基中的细胞干重的发酵生物质密度达到大于100g/L的方法。
下面的实施例不应被解释为限制本发明的范围,而应仅理解为解释说明。在本发明构思内的其它变化,包括新的培养基组成、新的微生物菌株或新的破囊壶菌菌种可用于替代用于本发明这些探索性和示例试验中的破囊壶菌及其菌株,其应形成并被视为本发明不可分割的部分。此外,任何修改、变化和替换对于本领域熟练的技术人员而言是清楚的,这种变化也应包括在本发明的实施方案中。整个发明中,在相关的情况下,提及的单数也包括同类的复数,因而“一种培养基”包括一种或多种具有相同功能的培养基。
整个发明中,使用的表述如干重量、干物质、干生物质是指干物质含量。
实施例1
固态发酵生产DHA
将30ml水与100g粗Ragi(手指小米)粉混合并高压灭菌。将2g葡萄糖、2g甘油和0.02g淀粉酶溶解于100ml水中并高压灭菌。将实施例1制备的10ml种子液接种到100ml含水培养基中,在旋涡混合器中充分混合。将所含物倒入到灭菌后的Ragi粉中,充分混合。将混合固体基质以3mm层厚铺于托盘上。将托盘置于通有无菌气体的培养箱内,控制温度低于26℃,120个小时。
移除托盘,将固体培养基从托盘中散开,充分混合并磨碎。将磨碎的固体装入含有甲醇的柱子内。将固体基质在甲醇中充分浸泡16个小时,收集甲醇。通过浸泡8个小时用甲醇进行再萃取,收集甲醇层。合并甲醇层,然后分析总脂肪和DHA含量,分别为1.5g和0.35g。这相当于产率为1.5g DHA/kg含加入其中的水的固体基质。
实施例2
固态发酵ATCC PRA 148生产DHA
(A)开始种子培养-破囊壶菌(Thraustochytrid)ATCC PRA 148
在含有100ml水、5g葡萄糖、0.5g酵母提取物、3.5g大豆粉和4.0g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。调节pH值至5并高压灭菌。将一满环的破囊壶菌ATCC PRA 148转接到烧瓶中,于22℃、220RPM培养72小时。
(B)固态发酵生产DHA
将50ml水与100g粗水稻粉混合,并高压灭菌。将2g葡萄糖、2g甘油、3g大豆蛋白胨和0.02g淀粉酶溶于100ml水中,并高压灭菌。将10ml实施例1(A)制备的种子液接种到100ml含水培养基中,在旋涡混合器中充分混合。将所含物倒入到灭菌后的米饭中,充分混合。将混合的固体基质以3mm层厚铺于托盘上。将托盘置于通有无菌气体的培养箱内,控制温度在18~20℃之间,144个小时。
移除托盘,将固体培养基从托盘中散开,充分混合。将固体装入含有甲醇的柱子内。将固体基质在甲醇中充分浸泡16个小时,收集甲醇。通过再浸泡8小时用甲醇进行再萃取,收集甲醇层。合并甲醇层,然后分析总脂肪和DHA含量,分别为2.6g和0.5g。这相当于产率为1.87g DHA/kg含加入其中的水的固体基质。
实施例3-蔗糖发酵
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)ATCC MYA1381
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g蔗糖、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠调节pH值至7.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC MYA 1381转接到烧瓶中,于22℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g蔗糖、7g淀粉、2g细菌淀粉酶、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠调节pH值至7.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种于其中。将烧瓶置于摇床中,在24℃下培养58小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、200g蔗糖、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至7.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在22℃12小时。允许温度升至26℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重320g,干物质含量为43%。DHA为6g,即1.2g/L。因此,很明显该微生物不能利用二糖。
实施例4-乳糖发酵
(A)开始种子培养-裂殖壶菌ATCC MYA 1381
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g乳糖、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的液体培养基。用1N氢氧化钠调节pH值至7.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC MYA 1381接种到烧瓶中,于22℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g乳糖、7g淀粉、2g淀粉酶、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠调节pH值至7.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接入其中。将烧瓶置于摇床中,在24℃下培养58小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、20g乳糖、9g酵母提取物、35g甘油、35g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至7.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在22℃12小时。允许温度升至26℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重320g,干物质含量为43%,即生产27.5g/L的干物质生物质。DHA为3.5g,即0.7g/L。这也反映出该微生物不能利用乳糖进行发酵。
实施例5-半连续发酵
在含有250ml水、5g葡萄糖,2g甘油、2.25g酵母提取物、1.25g大豆粉和1.0g海盐的500ml锥形烧瓶中制备种子培养基。调节pH值至5并高压灭菌。将一满斜面的裂殖壶菌ATCC MYA 1381转接到烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
将该种子培养基接种至含有2500ml水、50g葡萄糖、20g甘油、22.5g酵母提取物、12.5g大豆粉、1g尿素和1.0g海盐的2.5L培养基的5L接种物制备发酵罐中。维持温度26℃,转速600RPM下48小时。用混有空气的纯氧将溶解氧维持在50%以上。发酵48小时后,获得的湿生物质的值为160g/L,湿度为70%。
在无菌条件下,将接种物转接至含有20g/L葡萄糖、20g/L乳糖,9g酵母提取物、35g/L甘油、5g/L大豆粉、14g/L磷酸氢二铵和30g/L海盐的250L发酵罐中。260RPM下进行发酵,通过PID控制用氧和空气的混合气体将前24小时的溶解氧维持在饱和度的50%以上,接下来的48小时维持在30%以上。
发酵52小时后,湿生物质为120g/L,湿度为72.5%。通过无菌转移管(transfer line)将200L的发酵液无菌转移至另一个发酵罐中。将200L新鲜的高压灭菌后培养基补入到生物反应器中,在与上述相同的条件下在继续进行发酵。
含有排出的发酵液的发酵罐维持在23℃,pH值调至4.5。通过PID控制,用氧和空气的混合气体将溶解氧维持在饱和度的15%左右。72小时后,收获发酵液,分析脂类产量。总脂肪含量为45g/L,DHA为18g/L。
实施例6:
连续发酵
在含有50ml水、0.25g葡萄糖、0.1g甘油、0.125g酵母提取物、0.12g大豆粉和0.15g海盐的50ml锥形烧瓶中制备种子培养基。将pH值调至5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC MYA 1381接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
将该种子培养基接种至含有2500ml水、50g葡萄糖、20g甘油、22.5g酵母提取物、12.5g大豆粉、1g尿素和1.0g海盐的2.5L培养基的第一5L发酵罐中。维持温度26℃,转速600RPM 48小时。用混有空气的纯氧将溶解氧维持在50%以上。发酵48小时后,湿生物质为200g/L,湿度为74%。将蠕动泵连接至发酵罐的取样管,以5ml/min的流速,无菌转移至第二发酵罐(7L容积)中。以相同的5ml/min的流速将新鲜无菌培养基无菌泵入到第一发酵罐中。
将含有泵入的发酵液的第二发酵罐维持在23℃,将pH值调至4.5。通过PID(潜在积分微分控制器(Potential-Integral-Derivativecontroller))控制,用氧和空气的混合气体将溶解氧维持在饱和度的15%左右。从开始以5ml/min流速通过取样管从第一发酵罐中收集发酵液起16小时以后,从第二发酵罐中连续收获发酵液。分析从第二发酵罐中收获的发酵液的脂类产量。总脂肪含量为20g/L,DHA为6g/L。获得的生物质的湿重为220g/L,干物质含量为34%。
实施例7:使用高溶解氧的分批发酵-ATCC 20889
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC 20889
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g麦芽糖糊精、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC 20889接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g麦芽糖糊精、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种其中。将烧瓶置于摇床中,在26℃下培养48小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、200g麦芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至5.5。通过蠕动泵转移500ml的实施例1的接种物。
将温度维持在26℃12小时。允许温度升至29℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。此外,将发酵罐切换到氧气混合物以维持溶解氧。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重280g/L,湿度为70%,干物质浓度为84g/L。积累的脂肪总量为34g/L,DHA为12g/L。
实施例8:无氧气混合物的分批发酵-ATCC 20889
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC 20889
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g麦芽糖糊精、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC 20889接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g麦芽糖糊精、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种其中。将烧瓶置于摇床中,在26℃下培养48小时。
(B)无氧气混合物深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、200g麦芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至5.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在26℃12小时。允许温度升至29℃,但不应再超过该温度。通过将转速升至800RPM维持溶解氧在20%。此外,当氧气水平下降时,继续发酵并监控溶解氧(DO)的下降。记录下降过程,发现从48小时以后至发酵结束,溶解氧小于5%。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重160g/L,湿度为72%。脂肪总量为18g/L,DHA为4.2g/L。
实施例9:高溶解氧的分批发酵-ATCC 20888
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC 20888
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g麦芽糖糊精、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC 20888接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g麦芽糖糊精、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种其中。将烧瓶置于摇床中,在26℃下培养48小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、200g麦芽糖糊精。15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至5.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在26℃ 12小时。允许温度升至29℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。此外,将发酵罐切换到氧气混合物以维持溶解氧。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重265g/L,湿度68%。积累的脂肪总量为26g/L,DHA为6.7g/L。
实施例10:高溶解氧的分批发酵-ATCC 20891
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC 20891
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g麦芽糖糊精、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC 20891接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g麦芽糖糊精、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种其中。将烧瓶置于摇床中,在26℃下培养48小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将20g葡萄糖、200g麦芽糖糊精、15g酵母提取物、35g甘油、350g大豆粉、14g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至5.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在26℃ 12小时。允许温度升至29℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。此外,将发酵罐切换到氧气混合物以维持溶解氧。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重190g/L,湿度为71%。脂肪总量为21g/L,DHA为3.6g/L。
实施例11-高溶解氧的分批发酵-ATCC 20889
(A)开始种子培养-裂殖壶菌(Schizochytrium)ATCC 20889
在含有100ml水、0.2g葡萄糖、2g麦芽糖糊精、0.25g酵母提取物、4g大豆粉和3.2g海盐的250ml锥形烧瓶中制备100ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将一满环的裂殖壶菌ATCC 20889接种至烧瓶中,于26℃、220RPM培养48小时。
在含有750ml水、1.5g葡萄糖、15g麦芽糖糊精、1.125g酵母提取物、30g大豆粉、1.125g磷酸氢二铵和24g海盐的1000ml锥形烧瓶中制备750ml的种子培养基。用1N氢氧化钠将pH值调至5.5并高压灭菌。将从100ml种子烧瓶中制备的7.5ml种子液接种其中。将烧瓶置于摇床中,在26℃下培养48小时。
(B)深层分批发酵
将5000ml水加入到5L的发酵罐中。将350g葡萄糖、8g酵母提取物、20g大豆粉、2.5g磷酸氢二铵和160g海盐加入到发酵罐中,溶解所有组分。用稀HCl将发酵罐所含物质的pH值调至3.5。对培养基组分进行灭菌后,用1N氢氧化钠将pH值调至5.5。通过蠕动泵转移500ml实施例1的接种物。
将温度维持在26℃ 12小时。允许温度升至29℃,但不应再超过该温度。溶解氧不应低于20%,搅拌器RPM升至800RPM。此外,将发酵罐切换到氧气混合物以维持溶解氧。培养基的pH值不应低于5.0。间歇性取样,分析生物质和DHA含量。
120小时后,停止发酵,并获得下述结果。积累的总生物质为湿重295g/L,湿度68%,即干物质浓度为94g/L。积累的脂肪总量为37g/L,DHA为13.2g/L。
本领域技术人员可在250~400g/L范围内改变葡萄糖的添加量,在120~140小时范围内改变发酵时间,以及在一定范围内合理地改变培养基的其它组分,表1和表2所示为用约350g葡萄糖,并且整个发酵过程中维持溶解氧水平为30%或更高的分批发酵结果。
表1
表2
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.在高含氧条件下,由破囊壶菌(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法,包括(a)固态发酵,其中固体培养基发酵时喷入充足的无菌空气,或(b)在深层发酵的整个发酵过程中通过保持溶解氧的饱和度大于8%,获得大于2g DHA/升发酵培养基。
2.根据权利要求1所述的方法,(b)包括分批发酵,半连续或连续发酵。
3.根据权利要求2所述的方法,包括分批发酵,其中通过保持培养基中的溶解氧为至少20%,获得DHA的产量大于1.3g/L,优选大于3g/L,更优选大于10g/L。
4.根据权利要求3所述的方法,包括向培养基中喷入混有氧的空气。
5.根据权利要求4所述的方法,包括用搅拌器搅拌培养基。
6.根据权利要求4所述的方法,包括增加搅拌头速度直到3.2m/sec,切换到气体混合模式,其中将纯氧与空气混合并喷入发酵罐的发酵液中,以保持溶解氧的水平并在需要时阻止溶解氧低于目标水平或者50%左右或以上的饱和度。
7.根据权利要求6所述的方法,获得的生物质密度为大于100g/L细胞干重,积累的DHA为2g/L。
8.根据权利要求7所述的方法,其中氧气与空气的比例为1%~60%氧气。
9.根据权利要求8所述的方法,其包括在分批发酵开始时向发酵液中添加还原糖至高达400g/L。
10.根据权利要求1或8所述的方法,其中添加无机氮或尿素氮,并补充添加来自含氨基化合物的有机氮。
11.根据权利要求1或10所述的方法,其中所述含肽键的有机氮是富含蛋白或富含肽的来源或者氨基酸。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述富含蛋白的来源包括脱脂大豆粉。
13.根据权利要求1、8和10的任一项所述的方法,其包括添加消泡剂,所述消泡剂包括有机硅消泡剂。
14.根据权利要求2所述的方法,其中半连续发酵包括下述步骤:
a.在第一发酵罐中,使一批发酵液达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,
b.在第一发酵罐中保留一部分发酵液,其体积足以给下一批提供活跃分裂的接种物,无菌转移其余的活性发酵液至第二反应器中,
c.向第一反应器中加入无菌发酵培养基以恢复其体积,并使第一反应器进行步骤(a)并重复该步骤至所需的次数,或任选地(i)允许步骤(d)平衡体积或(ii)通过向第一反应器中加入无菌发酵培养基恢复其体积,使其完成进一步的生长和脂质生产,所述脂质将在结束该系列半连续生产时收获,
d.为第二发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,
e.回收DHA。
15.根据权利要求2所述的方法,其中所述连续发酵包括下列步骤:
a.在第一发酵罐中,使一批发酵液达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,
b.采取预防措施避免污染物进入,开始向第一发酵罐中加入无菌培养基,并允许无菌排出或移出相同体积的发酵液至第二发酵罐中,移出速率为使第一反应器的内容物始终保持在对数生长期,
c.为第二发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,
d.第二发酵罐达到其发酵能力后,从第二发酵罐中无菌排出或移出超过其能力的培养基,
e.立即回收或隔一段时间后回收DHA。
16.根据权利要求1所述的方法,其中所述固态发酵包括下列步骤:
a.通过添加刚够用于湿润的水制备润湿但不流动的固体基质,其包括(i)含量为不抑制渗透压水平的葡萄糖,(ii)用于提供碳水化合物、维生素、微量元素的谷物和来自真核生物的有机蛋白氮,以及(iii)淀粉酶,
b.将无菌混合固体基质平铺到托盘上一薄层,使得该薄层与流经托盘的空气不抑制地接触,
c.在无菌通气的无菌条件下对其进行培养,
d.控制温度低于26℃。
17.根据权利要求16所述的方法,其中所述的薄层约3mm厚。
18.根据权利要求1所述的方法,其中用于发酵的微生物是破囊壶菌或裂殖壶菌(Schizochytrium)。
19.根据权利要求1所述的方法,其包括向发酵液中喷入氧气以保持高含量的溶解氧。
Claims (19)
- 在高含氧条件下,由破囊壶菌(Thraustochytriales)生产多不饱和脂肪酸的方法,包括(a)固态发酵,其中固体培养基发酵时喷入充足的无菌空气,或(b)在深层发酵的整个发酵过程中通过保持溶解氧的饱和度大于8%,获得大于2g DHA/升发酵培养基。
- 根据权利要求1所述的方法,(b)包括分批发酵,半连续或连续发酵。
- 根据权利要求2所述的方法,包括分批发酵,其中通过保持培养基中的溶解氧为至少20%,获得DHA的产量大于1.3g/L,优选大于3g/L,更优选大于10g/L。
- 根据权利要求3所述的方法,包括向培养基中喷入混有氧的空气。
- 根据权利要求4所述的方法,包括用搅拌器搅拌培养基。
- 根据权利要求4所述的方法,包括增加搅拌头速度直到3.2m/sec,切换到气体混合模式,其中将纯氧与空气混合并喷入发酵罐的发酵液中,以保持溶解氧的水平并在需要时阻止溶解氧低于目标水平或者50%左右或以上的饱和度。
- 根据权利要求6所述的方法,获得的生物质密度为大于100g/L细胞干重,积累的DHA为2g/L。
- 根据权利要求7所述的方法,其中氧气与空气的比例为1%~60%氧气。
- 根据权利要求8所述的方法,其包括在分批发酵开始时向发酵液中添加还原糖至高达400g/L。
- 根据权利要求1或8所述的方法,其中添加无机氮或尿素氮,并补充添加来自含氨基化合物的有机氮。
- 根据权利要求1或10所述的方法,其中所述含肽键的有机氮是富含蛋白或富含肽的来源或者氨基酸。
- 根据权利要求11所述的方法,其中所述富含蛋白的来源包括脱脂大豆粉。
- 根据权利要求1、8和10的任一项所述的方法,其包括添加消泡剂,所述消泡剂包括有机硅消泡剂。
- 根据权利要求2所述的方法,其中半连续发酵包括下述步骤:a.在第一发酵罐中,使一批发酵液达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,b.在第一发酵罐中保留一部分发酵液,其体积足以给下一批提供活跃分裂的接种物,无菌转移其余的活性发酵液至第二反应器中,c.向第一反应器中加入无菌发酵培养基以恢复其体积,并使第一反应器进行步骤(a)并重复该步骤至所需的次数,或任选地(i)允许步骤(d)平衡体积或(ii)通过向第一反应器中加入无菌发酵培养基恢复其体积,使其完成进一步的生长和脂质生产,所述脂质将在结束该系列半连续生产时收获,d.为第二发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,e.回收DHA。
- 根据权利要求2所述的方法,其中所述连续发酵包括下列步骤:a.在第一发酵罐中,使一批发酵液达到其中微生物在对数生长期处于活跃分裂状态的点,b.采取预防措施避免污染物进入,开始向第一发酵罐中加入无菌培养基,并允许无菌排出或移出相同体积的发酵液至第二发酵罐中,移出速率为使第一反应器的内容物始终保持在对数生长期,c.为第二发酵罐中的发酵液提供培养条件,发挥其由于养分供给而受到限制的分裂潜力,从而生产DHA,d.第二发酵罐达到其发酵能力后,从第二发酵罐中无菌排出或移出超过其能力的培养基,e.立即回收或隔一段时间后回收DHA。
- 根据权利要求1所述的方法,其中所述固态发酵包括下列步骤:a.通过添加刚够用于湿润的水制备润湿但不流动的固体基质,其包括(i)含量为不抑制渗透压水平的葡萄糖,(ii)用于提供碳水化合物、维生素、微量元素的谷物和来自真核生物的有机蛋白氮,以及(iii)淀粉酶,b.将无菌混合固体基质平铺到托盘上一薄层,使得该薄层与流经托盘的空气不抑制地接触,c.在无菌通气的无菌条件下对其进行培养,d.控制温度低于26℃。
- 根据权利要求16所述的方法,其中所述的薄层约3mm厚。
- 根据权利要求1所述的方法,其中用于发酵的微生物是破囊壶菌或裂殖壶菌(Schizochytrium)。
- 根据权利要求1所述的方法,其包括向发酵液中喷入氧气以保持高含量的溶解氧。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014101857A1 (zh) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | 厦门金达威集团股份有限公司 | 一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产dha的方法 |
CN105829540A (zh) * | 2013-12-19 | 2016-08-03 | 罗盖特兄弟公司 | 用于富集具有dha的破囊壶菌属微藻的生物质的方法 |
CN105934519A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-09-07 | 普莱瑞阿夸泰克公司 | 用于生产高质量蛋白浓缩物和脂类的固态发酵系统和方法 |
CN106333062A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-18 | 通威股份有限公司 | 一种裂殖壶菌固态发酵饲料原料提高附加值的方法 |
CN106604998A (zh) * | 2014-10-16 | 2017-04-26 | 玛拉可再生能源公司 | 重复补料分批培养方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8207363B2 (en) | 2009-03-19 | 2012-06-26 | Martek Biosciences Corporation | Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof |
CA2787344C (en) | 2010-01-19 | 2018-03-20 | Dsm Ip Assets B.V. | Eicosapentaenoic acid-producing microorganisms, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof |
CN108771240A (zh) | 2011-07-21 | 2018-11-09 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | 脂肪酸组合物 |
KR102501031B1 (ko) * | 2014-10-16 | 2023-02-16 | 마라 리뉴어블즈 코퍼레이션 | 반연속적 배양 방법 |
CN110699393B (zh) * | 2019-11-12 | 2023-10-24 | 嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司 | 一种制备多不饱和脂肪酸的方法及其产品 |
CN111378699A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-07-07 | 嘉必优生物技术(武汉)股份有限公司 | 一种裂殖壶菌发酵产dha的方法 |
CN113005154B (zh) * | 2021-03-22 | 2023-03-21 | 华南理工大学 | 一种提高裂殖壶菌中二十碳五烯酸产量的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1416320A (zh) * | 2000-01-28 | 2003-05-07 | 奥米加技术公司 | 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生 |
CN1916156A (zh) * | 2006-07-10 | 2007-02-21 | 温州大学 | 裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备DHA粉末和油脂中的应用 |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6451567B1 (en) | 1988-09-07 | 2002-09-17 | Omegatech, Inc. | Fermentation process for producing long chain omega-3 fatty acids with euryhaline microorganisms |
US5340742A (en) | 1988-09-07 | 1994-08-23 | Omegatech Inc. | Process for growing thraustochytrium and schizochytrium using non-chloride salts to produce a microfloral biomass having omega-3-highly unsaturated fatty acids |
US5407957A (en) | 1990-02-13 | 1995-04-18 | Martek Corporation | Production of docosahexaenoic acid by dinoflagellates |
US5658767A (en) * | 1991-01-24 | 1997-08-19 | Martek Corporation | Arachidonic acid and methods for the production and use thereof |
US20050027004A1 (en) * | 1993-06-09 | 2005-02-03 | Martek Biosciences Corporation | Methods of treating senile dementia and Alzheimer's diseases using docosahexaenoic acid and arachidonic acid compositions |
DE69637953D1 (de) * | 1995-04-17 | 2009-07-30 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Hoch ungesättigte fettsäurenproduzierende mikroorganismen und verfahren zur herstellung von hoch ungesättigten fettsäuren durch verwendung dieser mikroorganismen |
TW533235B (en) * | 1997-06-11 | 2003-05-21 | Idemitsu Petrochemical Co | Method for extracting fat-soluble components from microbial cells |
US6783951B2 (en) * | 2000-02-24 | 2004-08-31 | Long, Ii Thomas Veach | Process for production of carotenoids, xanthophylls and apo-carotenoids utilizing eukaryotic microorganisms |
US6410282B1 (en) | 2000-03-30 | 2002-06-25 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid fungi |
US20040203120A1 (en) * | 2002-03-22 | 2004-10-14 | Council Of Scientific And Industrial Research | Method for enhancing levels of polyunsaturated fatty acids in thraustochytrid protists |
JP4280158B2 (ja) * | 2002-12-27 | 2009-06-17 | 富士フイルム株式会社 | ドコサヘキサエン酸生産能を有する微生物及びその利用 |
US7125672B2 (en) * | 2003-05-07 | 2006-10-24 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Codon-optimized genes for the production of polyunsaturated fatty acids in oleaginous yeasts |
MX338455B (es) | 2003-10-02 | 2016-04-18 | Dsm Ip Assets Bv | Produccion de altos niveles de dha en microalgas usando cantidades modificadas de cloruro y potasio. |
DE10352837A1 (de) * | 2003-11-10 | 2005-07-07 | Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh | Prozess zur Kultivierung von Mikroorganismen der Gattung Thraustochytriales |
CN1264967C (zh) * | 2004-12-08 | 2006-07-19 | 中国海洋大学 | 海洋真菌裂殖壶菌ouc88的工业应用 |
ES2909600T3 (es) * | 2005-06-07 | 2022-05-09 | Dsm Nutritional Products Ag | Microorganismos eucarióticos para producir lípidos y antioxidantes |
CN101370929A (zh) * | 2005-12-16 | 2009-02-18 | 阿维沙基因有限公司 | 生产二十二碳六烯酸(dha)的破囊壶菌菌株-sc1 |
WO2009035551A1 (en) * | 2007-09-12 | 2009-03-19 | Martek Biosciences Corporation | Biological oils and production and uses thereof |
US8207363B2 (en) * | 2009-03-19 | 2012-06-26 | Martek Biosciences Corporation | Thraustochytrids, fatty acid compositions, and methods of making and uses thereof |
-
2010
- 2010-02-24 WO PCT/IN2010/000108 patent/WO2010097809A2/en active Application Filing
- 2010-02-24 EP EP15150341.4A patent/EP2883958B1/en active Active
- 2010-02-24 EP EP10745894A patent/EP2401386A4/en not_active Withdrawn
- 2010-02-24 US US13/203,116 patent/US20110306102A1/en active Pending
- 2010-02-24 CN CN2010800094475A patent/CN102333880A/zh active Pending
- 2010-02-24 CN CN201711379908.8A patent/CN108034680A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1416320A (zh) * | 2000-01-28 | 2003-05-07 | 奥米加技术公司 | 通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生 |
CN1916156A (zh) * | 2006-07-10 | 2007-02-21 | 温州大学 | 裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备DHA粉末和油脂中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
ANITA N. JAKOBSEN等: "Endogenously Synthesized (-)-proto-Quercitol and Glycine Betaine Are Principal Compatible Solutes of Schizochytrium sp. Strain S8 (ATCC 20889) and Three New Isolates of Phylogenetically Related Thraustochytrids", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 * |
陈丽珠等: "流加培养裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸", 《厦门大学学报(自然科学版)》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2014101857A1 (zh) * | 2012-12-31 | 2014-07-03 | 厦门金达威集团股份有限公司 | 一种固料培养裂殖壶菌液体发酵生产dha的方法 |
US10006067B2 (en) | 2012-12-31 | 2018-06-26 | Xiamen Kingdomway Group Company | Method for producing DHA through solid culture and liquid fermentation of Schizochytrium |
CN105934519A (zh) * | 2013-08-06 | 2016-09-07 | 普莱瑞阿夸泰克公司 | 用于生产高质量蛋白浓缩物和脂类的固态发酵系统和方法 |
CN105829540A (zh) * | 2013-12-19 | 2016-08-03 | 罗盖特兄弟公司 | 用于富集具有dha的破囊壶菌属微藻的生物质的方法 |
CN105829540B (zh) * | 2013-12-19 | 2019-11-22 | 罗盖特兄弟公司 | 用于富集具有dha的破囊壶菌属微藻的生物质的方法 |
CN106604998A (zh) * | 2014-10-16 | 2017-04-26 | 玛拉可再生能源公司 | 重复补料分批培养方法 |
CN106604998B (zh) * | 2014-10-16 | 2021-03-30 | 玛拉可再生能源公司 | 重复补料分批培养方法 |
US11827918B2 (en) | 2014-10-16 | 2023-11-28 | MARA Renewables Corporation | Repeated fed-batch culture methods |
CN106333062A (zh) * | 2016-08-31 | 2017-01-18 | 通威股份有限公司 | 一种裂殖壶菌固态发酵饲料原料提高附加值的方法 |
Also Published As
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