CN1916156A - 裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备DHA粉末和油脂中的应用 - Google Patents

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本发明公开了一种裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备DHA粉末和DHA油脂中的应用，本发明裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771从浙江省温州市瓯江口七都岛滩涂苇地里收集的腐叶上采用松树花粉垂钓法分离得到，已于2006年6月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1730，所述裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711在优化的培养基中、以优化的培养条件培养5天，发酵液中细胞干重达到42.5克/升，DHA达到14.1克/升，DHA生产率达到2.76克/(升·天)，比已见报道的DHA生产率将近高出1倍。

Description

裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771及其在制备 DHA粉末和油脂中的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种新的裂殖壶菌(Schizochytrium)及其应用。
背景技术
二十二碳六烯酸(cis-4，7，10，13，16，19-docosahexaenoic acid，简称DHA)俗称脑黄金，是大脑、视网膜的重要结构物质，还能够调节中枢神经系统功能、预防和治疗心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。长期以来，DHA的商业来源是鱼油和微藻。鱼油的产量和DHA含量都不稳定，提取物夹杂鱼腥味。微藻培养需要光照和二氧化碳，生产工艺繁杂，成本高。随着人口的增加，DHA需求量相应增加，需要寻找量大质优的DHA新来源。目前认为具有潜力的候选是海洋异养微生物(包括细菌和真核微生物)。细菌的不饱和脂肪酸含量比不上真核微生物，因为不饱和脂肪酸只存在于细菌的细胞膜，而真核微生物更以不饱和脂肪酸的甘油三酯作为能量储存物质。
破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)是一类类似于微藻但缺乏叶绿体故而不行光合作用的专性海生真核微生物，嗜腐败，广泛存在于有机溶解物多和盐度高的环境中。过去认为破囊壶菌科归属于真菌界(Fungi)、壶菌门(Chytridiomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、水霉目(Saprolegniales)，而分子生物学的研究结果认为它更应该属于原生生物，现归属于管毛生物界(Stramenopila)、不等毛门(Heterokonta)、网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)、破囊壶菌目(Thraustochytriales)(Dick M W.Straminipilois fungi：Systematics of the peronosporomycetes，including accounts of the marinestraminipilous protistes，the plasmodiophorids，and similar organisms.Dordrecht：Kluwer Academic Publishers，2001，269-287)。
破囊壶菌科不致病、不产毒，人类通过食物链中的贻贝和蛤直接摄食之，美国FDA将其列为公认安全级(GRAS，Generally Recognized as Safe)。破囊壶菌科中的破囊壶菌属(Thraustochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)被认为是DHA最好的微生物来源(Ward 0P，et al.Process Biochemistry，2005，40：3628-3652)。自上个世纪九十年代FAO和WHO等机构推荐在婴、幼儿食品配方中添加DHA以来，破囊壶菌科生产DHA受到更加广泛的关注。T.roseumATCC28210在优化培养基中培养5天，DHA生产率为0.2克/(升·天)(Singh A，et al.J Ind Microb，1996，16：370-373)。S.limacinum SR21在含有葡萄糖(9％)或甘油(12％)的培养基中培养5天，DHA生产率为0.8克/(升·天)(Yokochi T，et al.Appl Microbiol Biotechnol，1998，49：72-76)。一株可能是S.mangrovei Raghu Kumar的破囊壶菌以葡萄糖为碳源，培养107小时，DHA生产率为0.5克/(升·天)(Bowles R D，et al.J Biotechnol，1999，70：193-202)。当培养温度为25℃，一株S.mangrovei在葡萄糖-酵母膏培养基中培养52小时，DHA生产率为1.27克/(升·天)(Fan K W，et al.J IndMicrobiol Biotechnol，2001，70：199-202)。T.aureum HO在葡萄糖(3％)培养基中培养4天，DHA生产率为1.55克/(升·天)(黄惠琴等.微生物学报，2002，42：498-501)。T.roseum MF2在葡萄糖(4％)培养基中培养4天，DHA生产率为0.31克/(升·天)(吴克刚等.湛江海洋大学学报，2002，22(4)：24-32)。但是，目前破囊壶菌所达到的DHA生产率都不是很高，其产业化受到很大的限制。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771，从而提高DHA生产率，以利于发酵生产DHA的产业化。
本发明裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771从浙江省温州市瓯江口七都岛滩涂苇地里收集的腐叶上采用松树花粉垂钓法分离得到，已于2006年6月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，保藏编号为CGMCC No.1730。
其具体的筛选步骤如下：
1.初筛培养基(克/升)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，琼脂18，用海水(取自温州海域)配制。另加链霉素和青霉素各250毫克/升和3毫克/升二氧化锗；
2.复筛培养基(克/升)：葡萄糖30，酵母膏2，蛋白胨2，用海水(取自温州海域)配制；
3.初筛方法：取温州沿海滩涂红树林和苇地里的腐叶，用含有链霉素和青霉素的无菌海水洗净，接种在所述的初筛培养基平板上，加适量的无菌海水和无菌松树花粉于平板上，培养数天。挑取松树花粉，观察在松树花粉上粘附生长的培养物，将粘附培养物的松树花粉再转接到新的平板上进行培养，直到得到纯培养物为止；
4.复筛方法：将纯培养物接种到所述的复筛培养基中，在摇床上培养。离心分离得到培养物，干燥至恒重，称量细胞干重；
5.筛选指标：索氏提取法检测细胞干重中的脂肪含量，气相色谱法检测脂肪中的DHA含量，以DHA生产率为指标，筛选得到高产DHA的菌株。
菌株特性：
在扫描和透视电镜下观察所述的高产DHA的菌株的外部形态和超微结构，其特征为：营养菌体为椭圆球形，由不连续的细胞壁包裹着，单核。细胞壁由几层紧压在一起的致密鳞片构成，在细胞壁不连续处可分辨鳞片，鳞片厚约2-3纳米。形成放射状的、根状的外质网依附在底物上，外质网产生于外质网形成体，从细胞壁不连续处长出。行无性繁殖，由营养菌体转化为游动孢子囊，其内有许多游动孢子。在游动孢子生成过程中，细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行，并且形成四倍体细胞。游动孢子侧生着不等长的双鞭毛，前向鞭毛两边排列茸鞭茸毛，后向鞭毛较短。
存在由鳞片构成的细胞壁、外质网形成体和外质网是现行的鉴定破囊壶菌科的标准，这些特点无法在光学显微镜下分辨清楚(Moss S T.The Biology ofMarine Fungi.Cambridge：Cambridge University Press，1986)。破囊壶菌的游动孢子形成机制有两种，即阶段性分裂(细胞核分裂完全完成后进行细胞质分裂)和连续性分裂(细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行)。后者可以形成四倍体细胞。以连续性分裂形成游动孢子，产生四倍体细胞，是裂殖壶菌的特征(Alexopoulos C J，et al.Introductory Mycology(4th ed.).New York：JohnWiley and Sons，1996，743-750)。
因此，所述的高产DHA的菌株鉴定为裂殖壶菌(Schizochytrium)，命名为WZU4771。一般而言，破囊壶菌属的菌体较大，在生产中可能出现聚集和结团，而裂殖壶菌属的生长速率更快(Barclay W R.US Patent，1997，5688500)。
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771适宜于生长在海洋环境里，当培养基的盐度和pH值与海洋相似时，细胞生长和DHA积累情况良好。其适宜温度也较一般微生物低，最佳温度为20-25℃。能够以葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和淀粉为碳源进行细胞生长和DHA积累。有机氮源(蛋白胨、酵母膏和玉米浆等)比无机氮源(尿素、硫酸铵和硝酸钠等)更适宜于细胞生长和DHA积累。
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711通过优化培养基和培养条件，采用传统的发酵方法，经过5天培养，发酵液中的细胞干重达到42.5克/升、DHA含量达到14.1克/升、DHA生产率达到2.76克/(升·天)，比已见报道的菌株将近高出1倍。
发酵技术：
所述裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711的优化培养基是含有5％-12％的碳源和0.5％-1.8％的氮源，海水浓度为25％-100％，pH值为3.5-7.5；优化培养条件是以3％-10％的接种量接入所述的优化培养基，在25-35℃、100-400转/分的条件下，采用传统的发酵方法，培养4-8天。
发酵液以3000-8000转/分离心10-30分钟，得到菌体细胞。
采用传统的发酵方法、在所述的优化培养基中、以所述的优化培养条件所获得的所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771菌体细胞含有35％-76％的油脂和18％-32％的DHA(均以细胞干重为基准)，最高的细胞干重达到42.5克/升、DHA含量达到14.1克/升、DHA生产率达到2.76克/(升·天)，几乎比已见报道的菌株高出1倍。气相色谱显示，该菌的长链多不饱和脂肪酸谱简单，除DHA外，只含有少量的二十二碳五烯酸(cis-7，10，13，16，19-docosapentaenoic acid，简称DPA)，有利于DHA的分离和纯化。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771在制备DHA粉末和DHA油脂中的应用。
DHA粉末的生产：
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711菌体细胞采用传统的食品干燥技术，将菌体水分降低至不高于12％。加入抗氧化剂、抗结块剂和填充剂，混匀，得到应用于食品或饲料的DHA粉末。
所述的DHA粉末为黄色或浅橙色的粗粉，其DHA含量不低于6％，过氧化值不高于6.0毫当量/千克，细菌总数不高于50000个/克，大肠菌群近似数不高于90个/100克，致病菌(指肠道致病菌和致病性球菌)不得检出。
DHA油脂的生产：
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711菌体细胞采用传统的植物油脂生产技术，经过浸出、脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱蜡和过滤，加入抗氧化剂，混匀，得到应用于食品的DHA油脂。
所述的DHA油脂为黄色或浅橙色的澄清、透明的油状液体，其DHA含量不低于20％，酸价不高于1.0毫克氢氧化钾/克，过氧化值不高于6.0毫当量/千克，正己烷不高于50毫克/千克。
本发明的优点在于：采用松树花粉垂钓法，从浙江省温州市瓯江口七都岛滩涂苇地里收集的腐叶上，分离得到一株高产DHA的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771。该菌含有丰富的油脂和DHA。在优化的培养基中，以优化的培养条件，采用传统的发酵方法，经过5天培养，发酵液中的细胞干重达到42.5克/升、DHA含量达到14.1克/升、DHA生产率达到2.76克/(升·天)，比已见报道的菌株将近高出1倍。并且，气相色谱显示，该菌的长链多不饱和脂肪酸谱简单，除DHA外，只含有少量的DPA，有利于DHA的分离和纯化。采用传统的食品干燥技术和植物油脂生产技术，将裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771菌体细胞开发为应用于食品或者饲料的DHA粉末和油脂。
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
实施例1
取浙江省温州市瓯江口七都岛滩涂苇地里的腐叶，剪成直径约为1.5厘米的小圆片或长度为1.5厘米的片段，用含有链霉素和青霉素各1克/升的无菌海水洗净，接种在所述的初筛培养基平板上，加约5毫升无菌海水和少量无菌松树花粉于平板上，在25℃下培养4-5天。挑取松树花粉，观察在松树花粉上粘附生长的培养物，将粘附培养物的松树花粉再转接到新的平板上进行培养，直到得到纯培养物为止。
将纯培养物接种到装有50毫升所述的复筛培养基的250毫升三角瓶中，在150转/分的摇床上培养3天，培养温度为25℃。培养物以3500转/分离心10分钟，水洗后再离心，在105℃干燥3小时，称量细胞干重。
索氏提取法检测细胞干重中的脂肪含量，气相色谱法检测脂肪中的DHA含量，以DHA生产率为指标，筛选得到高产DHA的菌株。
根据在扫描和透视电镜下观察所述的高产DHA的菌株的外部形态和超微结构，鉴定为裂殖壶菌(Schizochytrium)，命名为WZU4771。
所述的初筛培养基含有(克/升)：葡萄糖10，酵母膏1，蛋白胨1，琼脂18，用海水(取自温州海域)配制。另加链霉素和青霉素各250毫克/升和3毫克/升二氧化锗。
所述的复筛培养基含有(克/升)：葡萄糖30，酵母膏2，蛋白胨2，用海水(取自温州海域)配制。
实施例2
分别选取几种不同的碳源，浓度均为10％，以0.8％的蛋白胨为氮源，海水浓度为50％，pH值为6。接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为150转/分，进行裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA发酵。培养5天，结果如
表1所示，葡萄糖为最佳碳源。
表1碳源对DHA生产率的影响
  碳源   DHA生产率/克/(升·天)
  葡萄糖麦芽糖蔗糖淀粉   2.632.451.601.56
实施例3
分别选取几种不同的氮源，浓度均为0.8％，以10％的葡萄糖为碳源，海水浓度为50％，pH值为6。接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为150转/分，进行裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA发酵。培养5天，结果如表2所示，蛋白胨为最佳氮源。
  表2氮源对DHA生产率的影响
  氮源   DHA生产率/克/(升·天)
  蛋白胨酵母膏玉米浆尿素硫酸铵硝酸钠   2.652.271.991.761.470.89
实施例4
培养基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白胨，分别用不同海水浓度的海水配制，pH值为6。接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为150转/分，进行裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA发酵。培养5天，结果如表3所示，50％-100％的海水浓度最适宜。
表3海水浓度对DHA生产率的影响
  海水浓度/％   DHA生产率/克/(升·天)
  1025   0.561.48
  50100150200   2.622.692.402.15
实施例5
培养基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白胨，海水浓度为50％，用盐酸或氢氧化钠调节其pH值。接种量为10％，培养温度为25℃，摇床转速为150转/分，进行裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA发酵。培养5天，结果如表4所示，最佳pH值为6。
   表4pH值对DHA生产率的影响
  pH值   DHA生产率/克/(升·天)
  3.254.035.426.237.35   2.452.592.712.762.70
实施例6
培养基含有10％的葡萄糖和0.8％的蛋白胨，海水浓度为50％，pH值为6。接种量为10％，摇床转速为150转/分，在不同的培养温度下，进行裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771的DHA发酵。培养5天，结果如表5所示，最佳温度为20-25℃。
    表5温度对DHA生产率的影响
  温度/℃   DHA生产率/克/(升·天)
  2025303540   2.462.702.261.501.19
实施例7
裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU47711菌体细胞在105℃干燥至水分不高于12％。加入抗氧化剂、抗结块剂和填充剂，混匀，得到应用于食品或饲料的DHA粉末。
实施例8
裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771菌体细胞在105℃干燥至水分低于12％，用己烷浸出，浸出级数为4，前三级采用浓度渐稀的混合油，最后一级采用新鲜溶剂，总的溶剂比为1∶1。
混合油过滤除去固体悬浮粕末等杂质，在常压下经过2次蒸发和1次汽提，分离去己烷，得到毛油。
毛油在强烈的搅拌下，加入浓度为90％的硫酸溶液(添加量为毛油量的1％)，再加入热水(添加量为毛油量的4％)。静置沉降，取出上层毛油，用热水反复洗涤至pH值呈中性。
毛油在强烈的搅拌下，加入浓度为8％的氢氧化钠溶液(添加量根据毛油的酸值确定，超量0.01％)。加热至90℃，静置沉降，除去皂脚。
毛油用90℃的去离子水洗涤(洗涤水量为毛油量的50％)，然后真空干燥，干燥温度为100℃-105℃，真空度为98.6千帕。
毛油用活性白土进行吸附脱色(活性白土添加量为毛油量的2.5％)，脱色温度为90℃，脱色时间为20分钟。过滤除去活性白土。
毛油用水蒸汽汽提脱臭，脱臭温度为180℃，脱臭时间为2小时，蒸汽用量为毛油量的4％。
脱色毛油在慢速搅拌下，充分冷却至25℃，结晶时间为48小时，过滤除去蜡质。
加入抗氧化剂，得到富含DHA的成品油脂。

Claims (3)

1、裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771 CGMCC No.1730。
2、权利要求1所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771在制备DHA粉末中的应用。
3、权利要求1所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)WZU4771在制备DHA油脂中的应用。
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