CN1648233A - 海洋真菌裂殖壶菌ouc88的工业应用 - Google Patents

Abstract

本发明是海洋裂殖壶菌OUC88的工业应用。该裂殖壶菌具有富产二十二碳六烯酸(DHA)的能力，其菌种保藏号：CGMCC No.1240，保藏日期：2004.10.27。该裂殖壶菌是以裂殖壶菌SR21的菌株为出发菌种，通过化学诱变和物理诱变相结合而得到的新菌种。该高DHA含量的突变菌株OUC88，通过优化菌株培养条件，培养后期补加碳源，使细胞干重高达25g/L，DHA产量达8.27g/L。该菌体作为面包等食品或乳制品，尤其是婴儿奶粉的添加剂，可以促进身体发育。整个菌体发酵工艺简单，不需增加额外的设备和人工，提高了生物的利用率，获得了较高产量的目的产物，降低了发酵成本。

Description

海洋真菌裂殖壶菌OUC88的工业应用

技术领域

本发明涉及海洋微生物应用技术的改进，具体讲是一种海洋真菌裂殖壶菌OUC88的工业应用。其属于微生物应用技术领域。

背景技术

近年来，多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对人类健康的重要作用已愈来愈受到人们的重视。其中，作为重要的ω-3PUFAs之一的二十二碳六烯(以下简称：DHA)[docosahexaenoic acid(22：6，n-3)]因其在人体和动物体内的重要生理功能而倍受人们的青睐。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分；对婴儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用；还具有降低胆固醇、抗凝血、预防癌症等药理作用；另外，DHA还是鱼苗生长发育所需的一种必需脂肪酸，可以提高鱼苗的成活率和降低其白化病。传统上DHA从深海鱼油中获得，但从鱼油中提取的PUFAs存在着产量不稳、得率低、成本高及含有其它的ω-6PUFAs等问题，且随着渔业资源的日益紧张，传统的DHA资源已无法满足日益增长的市场需求。因此，开发DHA的新生资源已成为新的研究热点。

裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)为一种海洋真菌，其属于真菌中的卵囊菌纲、水霉目、脆霉壶菌科、裂殖壶菌属、limacinum种。该菌中DHA含量丰富，还含少量的DPA，而其它的不饱和脂肪酸含量却很低。该菌使用安全，Hammond等人用其对白鼠、兔子进行了一系列的安全性检测，没有发现任何毒副作用(Hammond，2001)。因此，是一种优良的DHA的潜生资源。目前，国际上对该菌的研究较少。T.Yokocki等在摇瓶中采用多种碳源和氮源对裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21进行优化培养，得到的DHA最高产量为4g/L。Kw Fan等人以葡萄糖和酵母提取物为碳、氮源培养裂殖壶菌mangrovei，DHA的产量仅为2.79g/L。以上培养中DHA的产量都不是很高，这除了与所选用的菌株有关外，与培养工艺也有直接的关系。因此，如何选育出更优良的裂殖壶菌品系以及如何优化该菌的培养工艺以近一步提高DHA的产量是一个值得研究的课题。

发明内容

本发明的发明目的是针对现有技术的缺陷：在该菌的筛选培养中DHA产量低的问题，拟从原出发菌种出发，通过人工诱变，选育出DHA含量较高的裂殖壶菌新品种；并对影响裂殖壶菌生长的各因素及该菌的生长特点进行研究，在传统培养工艺的基础上进一步改进，建立了一套制备工艺简单、高DHA含量的裂殖壶菌的培养工艺，开发裂殖壶菌新品种的工业应用。

本发明的任务是由以下技术方案实现的，研制了一种海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工业应用。该裂殖壶菌具有富产二十二碳六烯酸(以下简称：DHA)的能力，其菌种保藏号：CGMCC No.1240，保藏日期：2004.10.27。

所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的诱变方法，其菌株是以裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21其菌种保存号为：IFO 32693的菌株为出发菌种，通过化学诱变和物理诱变相结合而得到的新菌种。新菌种的诱变步骤如下：

(1)挑取裂殖壶菌SR21单菌落于液体培养基中，在18--30℃条件下，100--250rpm振荡培养1--3天后；

(2)于无菌条件下加入0.05--0.1mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，并使其终浓度为0.05--0.1mol/L，不断摇动处理10--50分钟；

(3)离心(2)步培养液并洗涤菌体后，将离心洗涤菌液使菌液的OD₆₅₀达0.3---0.8后，转入培养皿，使该离心洗涤菌液成为厚度为：1--5mm的薄层菌液；

(4)再将(3)步的薄层菌液在10--30W的紫外灯下30--40cm的距离处，经紫外光线(UV)照射诱变10--60秒；

(5)将诱变的薄层菌液离心后，制成液体培养基的菌细胞悬浮液，再涂布于固体培养基平板，并于暗处18--30℃条件下，培养1--3天，培养长出单菌落；

(6)计算不同时间条件下的菌株诱变致死率，确定致死率在80％--90％的诱变时间40秒的菌株，挑取其单菌落，重新对该菌进行诱变，诱变条件同上述(2)，(3)，(4)和(5)；将重新进行诱变的菌株培养后，再挑取长出的单菌落，再分别接入含10--50ml液体培养基的三角摇瓶中，培养条件：在18--30℃条件下，100--250rpm振荡培养2--5天；

(7)以细胞干重为指标，进行第一轮筛选：筛选出10-20菌株的细胞干重高的单菌落；

(8)然后以DHA产量为指标，进行第二轮筛选，按常规的BF₃-甲醇法直接进行甲酯化，然后通过气相色谱法测定菌体中DHA的百分含量，确定DHA产量高的菌株，最后筛选出3株DHA的产量高达8g/L的裂殖壶菌菌株，分别命名为OUC7、OUC23、OUC88。

所述的菌株OUC88菌株的优化菌株培养条件是以1--10％的接种量接入预培养的种子液；在该菌的培养初期，采用碳、氮源浓度均在60--30g/L的培养基；在培养的中后期，即第3-4天开始补加碳源，提高碳氮比C/N≮2；在18---30℃条件下，在空气浴振荡器上振荡转速为100---250rpm，振荡培养3---7天；离心收集菌体，冷冻干燥后，测菌体细胞干重和测定菌体中DHA的含量。

所述的培养基是以葡萄糖或甘油或果糖为碳源，以酵母提取物或蛋白胨为氮源，加入到天然海水和蒸馏水的混合液中，其中海水占培养基的20％--80％；其中碳源浓度为10--80g/L，氮源浓度为6--40g/L，配制培养基的pH值在4--8。

所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88，其菌体细胞，以其含有45--80％的总脂，其中不饱和脂肪酸以DHA为主的含量达23--44％，还含有7--11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸较高含量，含有0.4--1％的牛磺酸，另含有ω-3多不饱和脂肪酸(EPA)≤1％的性能作为食品，饮料，乳制品及其婴儿奶粉的添加剂以及饲料和饲料添加剂的应用。

本发明的优点在于：从原出发菌种出发，通过二次人工诱变，二轮筛选育出DHA含量较高的裂殖壶菌新品种。本发明的菌株OUC88的菌体用常规方法对该菌中的总脂、蛋白含量、氨基酸组成及灰分进行了分析：发现其细胞中有45-80％的总脂，其中不饱和脂肪酸以DHA为主，DHA在总脂中的含量达23-44％，另外还含有约7-11％的DPA。而另一种ω-3多不饱和脂肪酸EPA在该菌中含量很低，不到1％，这对于开发裂殖壶菌作为在制造食品、乳制品及其婴儿奶的粉添加剂的卫生食品应用很有利。因为研究表明，过量的EPA不利于婴幼儿的发育。菌体中蛋白含量为8-12％左右，其中，谷氨酸和天冬氨酸含量较高。分析还发现，该菌中含有约0.4--1％的牛磺酸，首次报道于国内外文献中。本发明的裂殖壶菌具有较高的研究价值。本发明的裂殖壶菌其干重生物量由原来的12--22g/L提高到14--25g/L，菌体中DHA的百分含量则由原来的13-26％提高到现在的18-35％。这样得到的DHA的产量不低于3.6g/L，最高可达8g/L，超过了目前文献中所报道的4g/L的最高产量，达到了预期的细胞生物量和DHA含量均增加的效果。Fan KW等人对裂殖壶菌mangrovei的研究，分别以葡萄糖和酵母提取物为碳源和氮源按常规方法进行培养，得到的DHA的最高产量为.2.78g/L(Fan KW et al，2001)；T.Nakahara等人以葡萄糖为碳源、以玉米浆和(NH₄)₂SO₄为氮源对裂殖壶菌sp.strain SR21分别在摇瓶和反应器中进行常规培养，发现该微生物在反应器中的生长情况优于摇瓶，在反应器中的最高产量为21g/L的细胞干重和4.7g/L的DHA(T.Nakahara et al，1996)；1997年，T.Yaguchi等人在反应器中按常规方法对裂殖壶菌sp.strain SR21进行培养，以葡萄糖为碳源、以玉米浆和(NH₄)₂SO₄为氮源，在振荡培养转速为300rpm条件下，提高葡萄糖的浓度到12％，得到了48.1g/L的细胞干重和13.3g/L的DHA产量(T.Yaguchi，1997)；而T.Yolochi等人在1998年仍以1997年T.Yaguchi等人研究的裂殖壶菌sp.strainSR21为研究对象，(此时该菌已被定名为裂殖壶菌limacinum SR21)，分别采用多种碳源、氮源包括1997年T.Yaguchi采用过的葡萄糖(碳源)和玉米浆、(NH₄)₂SO₄(二者为氮源)在摇瓶中按常规方法进行优化培养，得到的最好结果只有4g/L的DHA产量(T.Yolochi，1998)。而本发明通过对裂殖壶菌limacinum SR21进行人工诱变，筛选出高DHA含量的突变菌株OUC88，同样也在摇瓶中对菌株OUC88进行培养，再通过后期补加碳源这一操作，使细胞干重高达25g/L，DHA产量达8.27g/L；且整个培养工艺简单，不需增加额外的设备和人工，仅通过较低的附加投入，提高了生物的利用率，降低了发酵成本，提高了经济效益。本发明的整个培养工艺操作简单，不增加额外的设备和人工，仅通过较低的附加投入，提高了生物利用率，获得了较高产量的目的产物，降低了发酵成本。

附图及其具体实施方式

本发明的实施例结合附图进一步说明如下：

图1为不同时期本发明的期裂殖壶菌OUC88生长状况图。

图2为不同时期本发明的期裂殖壶菌OUC88DHA积累状况图。

参见图1，图2本发明研制的一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88及其工业应用。该菌种具有富产二十二碳六烯酸的能力，其菌种保藏号：CGMCCNo.1240，保藏日期：2004.10.27。

所述的裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88菌株是以裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21菌种，其菌种保存号为：IFO 32693的菌株为出发菌种，通过人工诱变而得到的新菌种；其诱变步骤如下：

实施例1：裂殖壶菌的诱变选育：

挑取裂殖壶菌SR21单菌落，于含50ml液体培养基(葡萄糖30g/l、酵母提取物10g/l、50％的天然海水)的三角摇瓶中，于25℃条件下，180rpm振荡培养2天后，于无菌条件下加入0.05mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，使其终浓度为0.08mol/L，不断摇动处理30分钟，无菌条件下离心上步培养液并洗涤菌体，即用无菌水洗涤5次后，将离心洗涤菌液使菌液的OD₆₅₀达0.3---0.8后，转入培养皿，使该离心洗涤菌液成为厚度为：1--5mm的薄层菌液；再于20W的紫外灯下30cm的距离处诱变0(对照)、10、20、30、40、50、60秒，再将菌体离心后悬浮于1ml液体培养基，然后涂布固体平板，于25℃条件下暗处培养2天，长出单菌落，计算不同条件下的致死率(见表1)。

表1：不同诱变时间下裂殖壶菌SR21的致死率：

诱变时间(秒)	长出的菌落数(个)	致死率(％)
			0	2308	--
10	1812	21.49
			20	840	63.60
30	746	67.68
			40	232	89.95
50	154	93.33
			60	68	97.05

根据表1确定致死率在80％--90％的诱变时间40秒的菌株，挑取单菌落，重新对该菌进行诱变，诱变时间为40秒，其它诱变条件同上。随机挑取诱变后长出的单菌落，分别于含50ml液体培养基的三角摇瓶中在25℃条件下180rpm振荡培养5天，离心收集菌体，-50℃冷冻干燥后，测其干重。以干重为指标进行第一次筛选，筛选出8株单菌落。

然后以DHA产量为指标，进行第二轮筛选。即，对筛选出的8株菌株进行第二次筛选：分别取适量干燥菌体，按常规的BF₃-甲醇法直接进行甲酯化，脂肪酸甲酯用正己烷抽提后进行气相色谱分析，通过和DHA标准品的保留时间相对照，对菌体中的DHA进行定性分析；采用面积内标法，通过十九酸标准品和DHA标准品峰面积的积分关系以及甲酯化过程中加入的内标物十九酸和菌体中DHA的峰面积的积分关系确定样品中DHA的浓度，然后根据抽提脂肪酸所用的正己烷的体积及甲酯化所用的菌体样品的质量，计算出菌体中DHA的百分含量，从而计算出裂殖壶菌中DHA的产量。最后筛选出3株DHA产量较高的裂殖壶菌株系(见表1-2)，分别命名为OUC7、OUC23、OUC88。其中以菌株OUC88的DHA含量最高。

   表1-2：裂殖壶菌诱变株与原出发菌株DHA产量的比较：

菌株	细胞干重(g/100mL)	细胞中DHA的含量(％)
			SR21	0.9705	18.15
OUC7	1.1273	19.97
			OUC23	1.0854	22.08

具体实施例2：碳、氮源浓度及碳氮比对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响：

在250ml的三角摇瓶中，分别加50ml天然海水(取自青岛海域)和50ml蒸馏水，按表1所示的浓度添加碳源(葡萄糖)和氮源(酵母提取物)，调PH值为6.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的OUC88菌种种子液，在空气浴振荡器上25℃下振荡培养5天，振荡转速为180rpm。离心收集菌体，-50℃条件下冷冻干燥至恒重，测其干重；取部分菌体，按常规的BF₃-甲醇法甲酯化，同实施例1中所述，通过气相色谱法测定菌体中DHA的百分含量。结果见表2。

            表2：不同培养基配比对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响

实例号	葡萄糖(g/L)	酵母提取物(g/L)	细胞干重(g/100mL)	细胞内DHA含量(％)
					1	30	10	1.112	25.56
2	30	20	1.205	23.09

3	30	30	1.456	20.62
					4	60	10	1.205	28.60
5	60	20	1.784	26.46
					6	60	30	1.917	25.34
7	90	10	0.817	29.74
					8	90	20	0.862	26.12
9	90	30	0.850	25.81

从表2中可以看出，细胞干重随着碳源浓度的增加而增加，当葡萄糖浓度为60--70g/L时，细胞干重达21-24g/L；当碳源浓度再增加时，细胞干重则呈下降趋势，当葡萄糖浓度为90g/L时，细胞干重只有8g/L左右。氮源浓度与细胞干重也有类似关系。当酵母提取物浓度在10--30g/L范围时，细胞干重随其浓度的增加而增加。细胞干重与DHA含量无线形关系，而碳源和氮源的比率则影响着DHA的积累，一定范围内C/N比的提高利于DHA的积累。

实施例3：不同时期内裂殖壶菌OUC88生长状况和DHA积累状况的测定：

在150ml的三角摇瓶中，分别加入25ml天然海水(取自青岛海域)和25ml蒸馏水，然后添加浓度为60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，调PH值为6.0，同时做7个平行样，高压灭菌后，接入1ml预培养的种子液，在空气浴振荡器上25℃下振荡培养，振荡转速为180rpm，每隔22小时取出一瓶样品进行分析，以期观察裂殖壶菌的生长及DHA的积累状况。菌体经离心收集、冷冻干燥后测其干重；其内DHA的含量按实施例1中所述的方法进行测定。结果见图1。

从图1中可以看出，裂殖壶菌细胞增殖和DHA积累不同步。在培养的前3天，细胞数量呈倍数增长，到第4天，细胞数目已基本不再增加，开始进入稳定生长期；而DHA的百分含量在前3天稳定在一个较低水平，3天后DHA开始大量积累，5天左右趋于稳定。因此，可把裂殖壶菌的生长过程分为两个阶段：前期为细胞增殖阶段，后期为DHA积累阶段。

实施例4：PH值对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响：

在250ml的三角摇瓶中，分别加入50ml天然海水(取自青岛海域)和50ml蒸馏水，然后添加浓度为60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，分别调PH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以找出最适合该菌生长及DHA积累的PH值。高压灭菌后，接入5ml预培养的OUC88种子液，在空气浴振荡器上25℃下振荡培养5天，振荡转速为180rpm。菌体经离心收集、冷冻干燥后测其干重；其内DHA的百分含量按实施例1中所述的方法进行测定。结果见表3。

             表3  pH值对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响

实例号	pH值	细胞干重(g/100mL)	细胞中DHA的百分含量(％)
				10	4.0	0.573	7.53
11	5.0	0.805	8.87
				12	6.0	1.894	22.72
13	7.0	2.113	26.34

14

8.0

1.921

21.63

从表3可以看出该菌能适应较宽范围的pH环境，但接近中性的pH值利于细胞的生长和DHA的积累。

实施例5：培养温度对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响：

如实施例3中所述配制培养基，调PH值为7.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的OUC88种子液，在空气浴振荡器上分别在20℃、23℃、25℃、28℃、30℃下振荡培养5天，振荡转速为180rpm。菌体经离心收集、冷冻干燥后测其干重；其内DHA的百分含量按实施例1中所述的方法进行测定。结果见表4。

               表4  培养温度对裂殖壶菌生物量及DHA含量的影响

实例号	培养温度(℃)	细胞干重(g/100mL)	细胞中DHA的百分含量(％)
				15	20	1.522	25.03
16	23	2.198	25.21
				17	25	2.049	22.76
18	28	1.233	18.87
				19	30	0.379	-

从表4可以看出，20--25℃范围内的温度较适合裂殖壶菌的生长，生物量可达22g/L，当温度超过28℃时，该菌生长速率急剧下降，到30℃时，该菌的生长几乎停止。而相对的低温利于DHA的积累，在20--23℃时，DHA的百分含量较高。

实施例6：振荡培养转速对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响

如实施例3中所述配制培养基，调PH值为7.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的OUC88种子液，在空气浴振荡器上23℃下振荡培养5天，振荡转速分别为150rpm、180rpm、200rpm、220rpm 4个水平，以测定振荡培养转速对裂殖壶菌生物量及DHA含量的影响，结果见表5。

          表5：振荡培养转速对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响：

实例号	振荡培养转速(rpm)	细胞干重(g/100mL)	细胞中DHA的百分含量(％)
				20	150	1.413	18.32
21	180	2.058	25.48
				22	200	2.299	24.32
23	220	2.192	23.12

从表5可以看出，细胞干重及DHA的含量均随振荡转速的提高而增加，这是因为转速的提高增加了培养基内部的溶氧，利于好氧的裂殖壶菌的生长，同时也促进了该菌的代谢，利于DHA的积累。

实施例7：后期补加葡萄糖对裂殖壶菌ouc88生物量及DHA含量的影响：

在250ml的三角摇瓶中，分别加入50ml天然海水(取自青岛海域)和50ml蒸馏水，然后添加浓度为60g/L的葡萄糖和30g/L的酵母提取物，分别调PH值为7.0，高压灭菌后，接入5ml预培养的种子液，在空气浴振荡器上23℃下振荡培养，振荡转速为200rpm。培养3天后，在无菌条件下，分别补加如表5所示的不同浓度的经过高压灭菌的葡萄糖溶液，然后继续培养2天。菌体经离心收集、冷冻干燥后测其干重；其内DHA的百分含量按实施例1中所述的方法进行测定。结果见表6。

         表6：后期补加葡萄糖对裂殖壶菌OUC88生物量及DHA含量的影响：

实例号	补糖体积(ml)	补糖浓度(％：m/v)	细胞干重(g/100mL)	DHA含(％)
					24	0	0	2.127	23.67
25	10	0	2.093	22.12
					26	10	10	2.347	27.83
27	10	20	2.436	29.74
					28	10	30	2.567	32.23
29	10	40	2.355	32.87
					30	10	50	2.306	33.78

由实施例1和实施例2的结果分析认为，裂殖壶菌的培养过程可分为两个阶段：前2--3天为细胞增殖阶段，较高浓度的碳源和氮源利于细胞数目的增加；后期为DHA的积累阶段，需要较高的C/N比，此时向培养基中补加一定的碳源，提高培养基中碳源和氮源的比率，将利于DHA的积累。试验证明，通过后期补加葡萄糖，细胞干重略有增加，由原来的21g/L提高到25g/L；而DHA含量则明显增加，由原来的24％左右提高到34％左右。这样得到的结果是细胞干重最高达25g/L，DHA产量最高达8.27g/L。

实施例8：裂殖壶菌OUC88的理化性状分析：

按实施例6中所述配制培养基，高压灭菌后，接入5mlOUC88种子液，振荡培养，培养条件同实施例6。培养4天后，离心收集菌体，冷冻干燥。

取部分干燥菌体，按常规的氯仿/甲醇法提取总脂：细胞破碎后，加入氯仿/甲醇混合液(2∶1∶V/V)，混匀，抽体液用Folch试剂洗涤，蒸发溶剂，即得较纯的总脂，称其重量，通过与所用的菌体重量相比，计算出总脂在细胞干重中的百分比。再取部分总脂，按常规的BF₃-甲醇法，同实施例1中所述进行甲酯化，用甲酯化的脂肪酸通过气相色谱—质谱分析确定其总脂中各脂肪酸的成分，通过与相应的标准品对照，测定总脂中各组分的含量，结果见表7。

     表7：裂殖壶菌OUC88主要脂肪酸含量：

脂肪酸成分	总脂中该成分的含量(％)
		C14：0	2.1
C15：0	7.7
		C16：0	34.6
C18：0	1.8
		C22：5	8.4
C22：6	44.2

分析发现，总脂中不饱和脂肪酸以DHA为主，DHA在总脂中的含量达48.53％，另外，还含有约8％的DPA。而另一种ω-3PUFAEPA在该菌中的含量很低，不到1％。椐研究证明，过量的EPA不利于婴幼儿的发育。本发明裂殖壶菌OUC88的菌体对于开发裂殖壶菌作为面包食品添加剂或乳制品的炼乳、奶片、尤其是婴儿奶粉的添加剂，很有营养价值和促进身体发育。

分别取部分干燥菌体，按常规的方法，分别对其蛋白含量、氨基酸组成及灰分进行测定，结果见表8-1，8-2。另外还发现，该菌中还含有一种药用成分牛磺酸，这在国内外文献中是首次报道，这进一步提高了该菌的开发应用价值。

表8-1：裂殖壶菌OUC88理化性状分析：

成分	含量(mg/100mg)
		总蛋白	9.52
总脂	78.40
		灰分	5.8

表8-2：裂殖壶菌OUC88中氨基酸组分分析：

氨基酸名称	含量(mg/100mg)
		天冬氨酸	1.11
苏氨酸	0.35
		丝氨酸	0.38
谷氨酸	1.54
		甘氨酸	0.36
丙氨酸	0.43
		胱氨酸	-
缬氨酸	0.69
		蛋氨酸	0.11
异亮氨酸	0.25
		亮氨酸	0.51
酪氨酸	0.25
		苯丙氨酸	0.37
赖氨酸	0.41
		组氨酸	0.12
精氨酸	0.07
		脯氨酸	0.43
总和	7.56

综上，本发明的菌株OUC88的菌体细胞，以其具有含有45--80％的总脂，其中不饱和脂肪酸以DHA为主的含量达23--44％，还含有7--11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸含量也较高，含有0.4--1％的牛磺酸，另含ω-3多不饱和脂肪酸(EPA)≤1％的性能，作为在制造食品、乳制品及其婴儿奶粉的添加剂中的卫生食品应用。

实施例9：用裂殖壶菌OUC88菌粉作为饵料营养强化轮虫DHA的实验；

将轮虫培养于2m3玻璃钢水槽中，每个玻璃钢水槽中的水体为1m3，水温为25℃，绿球藻浓度为850万个细胞/ml，充分通气。实验分为A、B、C、D四个组，A组为对照组，只添加绿球藻，B、C、D组为实验组，分别加入浓度为20mg/L、50mg/L、80mg/L的裂殖壶菌，其他条件各组均一致。于3、6、9、12、18小时在解剖镜下观察检测轮虫，用300目筛绢收集每次观察的轮虫样品，-50℃条件下冷冻干燥。取部分冷冻干燥的轮虫，按常规的BF3-甲醇法甲酯化，同实施例1中所述，气相色谱法测定轮虫DHA的含量。

                表9  实验各组轮虫体内DHA的积累测定结果

组别		A	B	C	D
						开始时	DHA/FA(％)	未检出	未检出	未检出	未检出
DHA(mg/g)	0	0	0	0
					3小时后		DHA/FA(％)	未检出	2.47	2.61	3.53
DHA(mg/g)	0	0.67	3.5	4.67
						6小时后	DHA/FA(％)	未检出	3.86	4.86	7.54
DHA(mg/g)	0	1.38	5.04	5.31
					9小时后		DHA/FA(％)	未检出	4.73	8.43	10.02
DHA(mg/g)	0	4.01	6.51	6.87
						12小时后	DHA/FA(％)	未检出	5.98	10.21	13.44
DHA(mg/g)	0	4.42	7.85	8.14
					18小时后		DHA/FA(％)	未检出	5.16	10.74	12.53
DHA(mg/g)	0	3.99	5.45	5.73

注：FA表示总脂肪酸  ％表示百分含量  DHA(mg/g)表示每克干轮虫粉中含有DHA的毫克数。

从表9可知：裂殖壶菌OUC88有显著增加轮虫体内的DHA含量的作用。三个实验组B、C、D在强化12小时后轮虫体内DHA/FA的含量分别为5.98％、10.21％和13.44％，每克干燥轮虫粉中DHA的净含量分别为4.42mg/g、7.85mg/g、8.14mg/g；而对照组A在整个实验过程中均未检测出轮虫体内的DHA含量。从实验中还看出，在超过12小时后，轮虫体内的DHA含量显著下降，因此，使轮虫在体内积累DHA的时间以不超过12小时为宜。

实施例10：用裂殖壶菌OUC88强化过的轮虫饲喂大菱鲆幼苗抗白化效果试验；

实验分为A、B、C三组，每组大菱鲆幼苗200尾，培养于50L塑料桶中，水体20L，水源为过滤的自然海水，经紫外线消毒。初孵仔鱼培育温度14℃.以后逐渐升温至16℃。海水盐度28‰，pH值8.6。光源为人工光源，水面200-2000lx。仔鱼前期微充气，仔鱼后期加大充气量。每天吸污一次，以清除池底污物。充分通气。A组投喂未强化的轮虫(只用小球藻喂养的轮虫)，B组投喂用日本乌贼甘油强化的轮虫，C组投喂用裂殖壶菌OUC88强化过的轮虫，其他条件一致，每天观察仔鱼存活情况。、

                          表10  大菱鲆抗白化实验结果

	强化剂用量(mg/L)	起始时仔鱼数量(尾)	结束时白化苗数(尾)	白化率(％)
					A	0	200	119	59.5
B	30	200	18	9.0
					C	80	200	13	6.5

实验结束时，饲喂未强化轮虫的大菱鲆的生长速率最低，发育过程中白化现象严重，白化率高达59.5％；在两个饲喂强化轮虫的大菱鲆组间，用裂殖壶菌OUC88强化轮虫饲喂的大菱鲆生长速率高于用日本乌贼甘油强化轮虫饲喂的大菱鲆，摄食活跃，皮肤的黑色素细胞生长状态好，B组大菱鲆白化率为9.0％，C组大菱鲆白化率为6.5％，C组白化率要低于B组白化率。并且，当幼苗发生白化时，用裂殖壶菌OUC88强化轮虫饲喂的大菱鲆的白化面积也远远小于用日本乌贼甘油强化轮虫饲喂的大菱鲆的白化面积。说明用裂殖壶菌OUC88强化过的轮虫饲喂大菱鲆幼苗的抗白化效果优于传统的用日本乌贼甘油强化轮虫饲喂的大菱鲆的抗白化效果，且使用安全可靠。

本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (5)

1、一种海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工业应用，其特征在于：其具有富产二十二碳六烯酸(简称：DHA)的能力，其菌种保藏号：CGMCC No.1240，保藏日期：2004.10.27。

2、权利要求1所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的诱变方法，其特征在于：所述的该菌株是以裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)SR21其菌种保存号为：IFO32693的菌株为出发菌种，用化学诱变和物理诱变相结合的方法得到的新菌种；其诱变步骤如下：

(1)挑取裂殖壶菌SR21单菌落于液体培养基中，在18——30℃条件下，100——250rpm振荡培养1——3天后；

(2)于无菌条件下加入0.05——0.1mol/mL的甲基磺酸乙酯(EMS)，并使其终浓度为0.05——0.1mol/L，不断摇动处理10——50分钟；

(3)离心(2)步培养液并洗涤菌体后，将离心洗涤菌液使菌液的OD₆₅₀达0.3——0.8后，转入培养皿，使该离心洗涤菌液成为厚度为：1——5mm的薄层菌液；

(4)再将(3)步的薄层菌液在10——30W的紫外灯下30——40cm的距离处，经紫外光线(UV)照射诱变10——60秒；

(5)将诱变的薄层菌液离心后，制成液体培养基的菌细胞悬浮液，再涂布于固体培养基平板，并于暗处18——30℃条件下，培养1——3天，培养长出单菌落；计算不同时间条件下的菌株诱变致死率，选择菌株重新进行诱变，培养长出单菌落；

(6)计算不同时间条件下的菌株诱变致死率，确定致死率在80％——90％的诱变时间40秒的菌株，挑取其单菌落，重新对该菌进行诱变，诱变条件同上述(2)，(3)，(4)和(5)；将重新进行诱变的菌株培养后，再挑取长出的单菌落，再分别接入含10——50ml液体培养基的三角摇瓶中，培养条件：在18——30℃条件下，100——250rpm振荡培养2——5天；

(7)以菌体产量为指标，进行第一轮筛选：筛选出10-20株菌体产量高的单菌落；

(8)然后以DHA产量为指标，进行第二轮筛选，按常规的BF3-甲醇法直接进行甲酯化，然后通过气相色谱法测定菌体中DHA的百分含量，确定DHA产量高的菌株，最后筛选出3株DHA的产量高达8g/L的裂殖壶菌菌株，分别命名为OUC7、OUC23、OUC88。

3、根据权利要求1所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工业应用，其特征在于：所述的菌株OUC88菌株的优化菌株培养条件是以1——10％的接种量接入预培养的种子液；在该菌的培养初期，采用碳、氮源浓度均在60——30g/L的培养基；在培养的中后期，即第3-4天开始补加碳源，提高碳氮比(C/N)在2——5∶1；在18---30℃条件下，在空气浴振荡器上振荡转速为100---250rpm，振荡培养---7天；离心收集菌体，冷冻干燥后，测菌体细胞干重和测定菌体中DHA的含量。

4、根据权利要求3所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88的工业应用，其特征在于：所述的培养基是以葡萄糖或甘油或果糖为碳源，以酵母提取物或蛋白胨为氮源，加入到天然海水和蒸馏水的混合液中，其中海水占培养基的20％——80％；其中碳源浓度为10——80g/L，氮源浓度为6——40g/L，配制培养基的pH值在4——8。

5、权利要求1所述海洋裂殖壶菌(Schizochytrium limacinum)OUC88，其特征在于：所述的菌体细胞，以其含有45——80％的总脂，其中不饱和脂肪酸以DHA为主的含量达23——44％，还含有7——11％的DPA，谷氨酸和天冬氨酸含量也较高，含有0.4——1％的牛磺酸，另含有ω-3多不饱和脂肪酸(EPA)≤1％的性能作为食品，乳制品及其婴儿奶粉的添加剂以及饲料，和饲料添加剂的应用。

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