CN1255545C - 花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法 - Google Patents
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Abstract
花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法涉及微生物发酵生产方法，克服产品花生四烯酸含量低，成本高的不足，增强生产稳定性和食用安全。所述花生四烯酸油脂利用高山被孢霉Mortierella alpina M0223生产，花生四烯酸残基含量65.5-73.5%，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的0.69-3.7%。本方法步骤为：菌种培养活化，种子培养，菌种接入摇瓶或者发酵罐发酵培养，收集湿菌体，烘干后提取油脂。本发明大大提高了产品品质，降低了成本，避免了人工改造菌种带来的生产稳定性和食用安全问题。本发明的油脂精制后可用作婴幼儿营养强化剂和食品添加剂以及医药、化妆品原料。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵生产方法，特别是利用野生菌株生产高产量花生四烯酸油脂和其制备方法。
背景技术
花生四烯酸(AA)和亚油酸、亚麻酸作为人体必需的3种脂肪酸具有多种生理功能。AA是人体最重要的，含量最丰富的二十碳多不饱和脂肪酸(C20PuFA)，主要存在于器官肌肉和血液组织中，与磷脂结合成结构脂类起着重要作用。在人体的脑和神经组织中，AA含量一般占多不饱和脂肪酸(PuFAs)总量的40-50％，在神经末梢甚至高达70％。AA还是许多二十碳烯酸衍生物的直接前体，包括前列腺素E2(PGE2)、前列环素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白细胞三烯B4(LTB4)和C4(LTC4)等等。这些生物活性物质对脂蛋白的代谢、血液流变学、血管弹性、白细胞功能和血小板激活等具有重要的调节作用。AA还具有酯化胆固醇，抑制血小板聚集、增加血管弹性、降低血液粘度、调节白细胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。临床试验还发现，富含AA的饮食能明显改善蛋白尿、肾小球动脉硬化和肾小管功能紊乱，对糖尿病微血管病变具有改善作用；同时对糖尿病的各种慢性并发症也具有良好的防治作用。所以，其营养保健功能体现在婴幼儿生长发育、特别是婴幼儿智力及视神经发育、孕产妇营养、心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤等许多方面。
在植物油中，绝大多数都不含AA，少数植物油中含有AA，但其含量均非常低，无法从植物油获得AA产品。从整体上说，虽然AA广泛存在于动物体内，但来源于动物组织的AA无论是在产量上还是在成本上都无法满足市场的需求。人们长期以来渴望获得大量成本低、AA含量高的产品。
采用发酵法由微生物来生产花生四烯酸是一种替代性来源，已发现许多微生物都能合成AA，其中以高山被孢霉(Mortierella alpina)最具应用前景。高山被孢霉是一种丝状真菌，它在以碳水化合物为碳源的培养基中生长时，菌体内会积累较多的油脂，其油脂的脂肪酸组成中含有丰富的多不饱和脂肪酸，尤其是AA含量较高，被认为是最好的生产花生四烯酸油脂的菌种，并且荷兰、英国和美国FDA先后通过了野生被孢霉及其产物食用安全的认证。
WO 9213086(公开于1992年8月6日)公开了一种真菌产油脂，该油脂含有约10％至50％的AR，该油脂中的EPA含量不超过AA的五分之一、十分之一或者基本不含EPA。所述真菌可以是被孢霉属，具体为高山被孢霉菌。
CN1175976A公开了一种生产花生四烯酸油脂的发酵方法及其获得的油脂，所述的油脂中AA含量与EPA含量之比至少约5∶1，更好10∶1，最好至少20∶1，且AA含量可达到接近70％。该文献方法中采用的微生物也是高山被孢霉菌，是通过控制过程中的pH值实现高AA含量的。
但是，上述文献的不足之处在于，在提高AA在油脂中含量的同时，EPA的含量仍较高，其给出的实例中EPA与AA之比最少也超过5％。而高含量的二十碳五烯酸对婴幼儿的不利影响限制了AA在婴幼儿食品中的广泛应用。而且，现有技术中生产花生四烯酸油脂的方法及获得的产品中仍然存在着油脂中花生四烯酸含量偏低，或者EPA含量偏高的缺陷，同时还存在发酵所采用的培养基成本高，以及非野生性菌种发酵存在的生产不稳定以及食用安全等诸多问题。
发明内容
本发明提出一种花生四烯酸油脂及其微生物发酵生产方法，其任务正是为了克服上述技术的不足，提供一种筛选的野生高产菌株和相应的花生四烯酸油脂的廉价发酵生产方法，从而提高花生四烯酸油脂的品质和生产稳定性，同时降低了花生四烯酸油脂的生产成本，避免其他人工改造菌种可能带来的生产稳定性甚至引起食用安全争议等新问题。
本发明的任务是通过下列技术方案实现的：
本发明提供了一种由高山被孢霉(Mortierella alpina)菌种M0223生产的甘油三酯类油脂，该油脂含有65.5-73.5％的花生四烯酸残基，且二十碳五烯酸残基的含量为花生四烯酸残基含量的0.69-3.7％。
上述甘油三酯类油脂的制备方法包括：
(1)将高山被孢霉Mortierella alpina M0223菌种培养活化，在装有种子培养基的摇瓶中进行种子培养，种子培养基包括碳源、氮源和无机盐，其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的一种或多种，氮源选自豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、鱼粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸钾、硝酸钠中的一种或多种，无机盐选自磷酸氢二钾或磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种；
(2)将种子培养所得菌种接入装有发酵培养基的摇瓶或者发酵罐发酵培养，发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐，其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、纤维二糖、糖蜜、脂肪酸和甘油中的一种或多种，氮源选自豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、蛋白胨、鱼粉、牛肉膏、玉米浆、硝酸钾、硝酸钠中的一种或多种，无机盐选自磷酸氢二钾或磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种；
(3)发酵结束后，收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂，
其中
所述摇瓶种子培养条件为：摇床转速为80-200rpm，培养温度为18-28℃，振荡培养时间为3-5天；
所述摇瓶发酵培养条件为：菌种接种量为每100毫升的发酵培养基接入5-15毫升的摇瓶种子液，摇床转速为120-240rpm，培养温度为18-28℃，从发酵培养的第三天到第五天采用流加补料或分批补料方式，共补充相当于不高于90g/L葡萄糖的碳源和不高于9g/L硝酸钾的氮源，共振荡培养6-9天；
所述发酵罐发酵培养条件为：菌种接种量按每100毫升的发酵培养基接入5-15毫升(即体积比为5-15％)的摇瓶种子液接入一级发酵罐，多级发酵则将前一级发酵罐的种子液按体积比为5-15％的接种量接入下一级发酵罐中，发酵罐搅拌转速60-150rpm，通气量为每分钟每升发酵液通入0.1-1.5升空气；发酵温度范围18-28℃，发酵6-9天，发酵过程采用流加补料或分批补料培养方法：从发酵的第三天到第五天共补充相当于不高于90克/升的葡萄糖的碳源，以及不高于9克/升硝酸钾的氮源。
此外，可以将从干菌体中得到的粗油再进行脱胶、碱炼、脱色、脱臭和抗氧化中的一种或多种处理，得到本发明的花生四烯酸油脂产品。
上述方法的进一步的特征是：
种子培养基每百毫升含40-60克新鲜黄豆芽提取汁和3-8克的葡萄糖。所述种子培养基的制备为称取40-60克新鲜黄豆芽加水煮沸0.5-1小时过滤后，加入葡萄糖3-8克溶解后定容至100ml。
所述方法中发酵培养基含有淀粉水解糖50-100克/升，豆饼粉汁蛋白1.5-8克/升，硝酸钾1.5-4.5克/升，K2HPO4.3H2O 1.5-4.5克/升，MgSO4.7H2O 0.2-1.0克/升，pH5.5-7.0。其中，淀粉水解糖是由淀粉先采用高温淀粉酶液化、再采用糖化酶进行糖化的双酶法制备；而豆饼粉汁是由豆饼粉采用热水提取制备，并要求以碳酸钠或氢氧化钠维持提取过程中pH在7.0-8.0范围内。
所述方法的发酵培养条件的优选方案为：最适发酵温度范围22-25℃，pH范围5.5-6.0。
以上所述淀粉水解糖的淀粉来源包括玉米粉、红薯粉、小麦粉和土豆粉中的一种或多种。
此外，上述发酵过程中还可以通过采用变温控制发酵，分别提高菌体生长量和花生四烯酸油脂的合成。即在发酵的前3至5天，控制发酵温度在24-28℃范围内，促进菌体生长；在发酵到第3至5天以后，控制发酵温度在18-22℃范围内，促进花生四烯酸油脂的合成。
本发明所采用的野生高产被孢霉菌株M0223，已在中国科学院典型培养物保藏委员会，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行菌种保藏：
菌种分类命名：高山被孢霉M0223，
拉丁文名称：Mortierella alpina M0223，
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所
邮政编码：100080
保藏日期：2003年3月10日
保藏编号：CGMCC No.0903
由于采用上述技术方案，使本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果：
(1)通过高产菌种及相应发酵工艺的优化，特别是采用优化的培养基和补料发酵工艺，生产出花生四烯酸残基含量特别高同时二十碳五烯酸含量非常低的油脂，其花生四烯酸残基含量可达到65.5-73.5％，且二十碳五烯酸含量可仅为花生四烯酸残基含量的0.69-3.7％。明显优于同类发明。
(2)因为所用菌种为直接从自然界筛选获得的高产野生菌株，菌种性状及生产能力非常稳定。且不存在其他人工育种方法带来的菌种生产性能不稳定甚至可能带来的食用安全等问题。
(3)发酵原料皆为农副产品，廉价易得，因而发酵成本大大低于同类发明。
采用本发明所用的菌种及相应的发酵生产工艺，能够实现花生四烯酸在油脂中的含量最高达到73.5％，二十碳五烯酸(EPA)残基含量最低水平为花生四烯酸(AA)残基含量的0.69％，花生四烯酸最高产量超过9.0g/L。以上技术指标明显高于国内外同类发明的专利水平和其他报道的工业性规模的发酵水平。。
具体实施方式
实施例1：摇瓶发酵
1、菌种活化
制备种子前采用PDA斜面进行菌种活化，并将活化的菌种转入PDA固体培养基中培养积累大量孢子供种子大量制备用。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉M0223的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：5.0％(w/v)葡萄糖，50％(w/v)豆芽汁。豆芽汁制备按称取50克新鲜黄豆芽加水煮沸1小时过滤后，滤液定容至100ml时豆芽汁浓度为50％(w/v)。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为140rpm，培养温度为25℃，振荡培养时间为3天。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)80，豆饼汁中蛋白质含量5，硝酸钠3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。玉米粉水解糖是由玉米粉按照先液化、后糖化的双酶法制备，水解糖中葡萄糖浓度用DNS法确定；豆饼汁制备：由豆饼粉采用热水提取制备，并要求以碳酸钠或氢氧化钠维持提取过程中pH在7.0-8.0范围内，豆饼汁中蛋白质浓度用福林酚法确定。菌种接种量按照体积比为8％(V/V)，摇瓶在25℃下按150rpm振荡培养7天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为30.6g/L，油脂含量为36.2％，气相色谱检测花生四烯酸含量为66.5％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.61％，花生四烯酸产量为7.37g/L。表1为实例1发酵后真菌油脂成分。
表1：实例1发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.25.05.63.86.03.60.40.61.52.966.52.41.53.61％ |
实施例2：摇瓶发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉M0223的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：玉米淀粉水解糖5.0％(w/v)，豆饼蛋白质4.5g/L。玉米淀粉水解糖和豆饼汁的制备见实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为100rpm，培养温度为24℃，振荡培养时间为3天。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：糖蜜(以葡萄糖含量计算)40，玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)20，豆饼粉蛋白质3，玉米浆0.5％(v/v)，硝酸钠3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。玉米粉水解糖和豆饼粉蛋白质的制备方法见实施例1。菌种接种量为12％(V/V)，摇瓶先在25℃下150rpm振荡培养4天，再在21℃下150rpm振荡培养4天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为29.6g/L，油脂含量为37.1％，气相色谱检测花生四烯酸含量为66.2％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.17％，花生四烯酸产量达到7.27g/L。表2为实例2发酵后真菌油脂成分。
表2：实例2发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.24.35.24.55.83.70.50.81.52.966.22.12.33.17％ |
实施例3：摇瓶发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉M0223的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：葡萄糖3％(w/v)，蔗糖2.0％(w/v)，酵母膏5g/L，蛋白胨3g/L。玉米淀粉水解糖的制备见实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为100rpm，培养温度为26℃，振荡培养时间为天。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：红薯淀粉水解糖(以葡萄糖含量计算)80，花生饼粉蛋白质1.5，硝酸钠4.5，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。红薯淀粉水解糖按照先液化、后糖化的双酶法制备，水解糖中葡萄糖浓度用DNS法确定；花生饼粉蛋白质制备方法为：花生饼粉采用热水提取，浸汁汁中蛋白质浓度用福林酚法确定。接种量为11％(V/V)，摇瓶在25℃下按150rpm振荡培养5天，19℃下按150rpm振荡培养4天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为28.7g/L，油脂含量为36.9％，气相色谱检测花生四烯酸含量为65.8％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.50％，花生四烯酸产量达到6.99g/L。表3为实例3发酵后真菌油脂成分。
表3：实例3发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.15.26.13.97.23.40.20.41.62.865.82.31.03.50％ |
实施例4：摇瓶发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：3.0％(w/v)小麦淀粉水解糖，1.0％果糖，0.5％酵母膏，0.3％牛肉膏。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为80rpm，培养温度为24℃，振荡培养时间为5天。小麦淀粉水解糖是由小麦粉按照先液化、后糖化的双酶法制备，水解糖中葡萄糖浓度用DNS法确定。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)80，酵母膏3，牛肉膏3，硝酸钾3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.8。玉米粉水解糖是由玉米粉按照先液化、后糖化的双酶法制备，水解糖中葡萄糖浓度用DNS法确定。接种量为8％(V/V)，摇瓶在20℃下按150rpm振荡培养9天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为28.6g/L，油脂含量为38.2％，气相色谱检测花生四烯酸含量为73.5％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的1.50％，花生四烯酸产量达到8.03g/L。表4为实例4发酵后真菌油脂成分。
表4：实例4发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.23.14.33.05.23.20.70.51.52.973.51.10.81.50％ |
实施例5：摇瓶发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：5.0％(w/v)葡萄糖，50％(w/v)豆芽汁，0.3％酵母膏。豆芽汁制备同实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为180rpm，培养温度为22℃，振荡培养时间为3天。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)50，豆饼汁中蛋白质含量4.5，硝酸钾3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.6。玉米粉水解糖和豆饼汁的制备同实施例1。接种量为10％(V/V)，摇瓶在22℃下按150rpm振荡培养，然后在第3天、4天、5天进行补料，补料培养基为(g/L)：玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)20，硝酸钾1.5，继续培养至第9天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为36.6g/L，油脂含量为38.2％，气相色谱检测花生四烯酸含量为65.5％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的2.0％，花生四烯酸产量达到9.16g/L。表5为实例5发酵后真菌油脂成分。
表5：实例5发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.55.16.05.86.33.50.30.51.32.765.51.31.22.00％ |
实施例6：摇瓶发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：5.0％(w/v)麦芽糖，50％(w/v)豆芽汁，0.3％豆饼蛋白。豆芽汁和豆饼蛋白的制备同实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为180rpm，培养温度为22℃，振荡培养时间为3天。
3、摇瓶发酵：
将2中所述的摇瓶菌种接入装有发酵培养基的摇瓶进行发酵培养，摇瓶发酵培养基配方为(g/L)：土豆淀粉水解糖(以葡萄糖含量计算)50，玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)20，豆饼蛋白质1.5，牛肉膏3，硝酸钾4.5，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。土豆淀粉水解糖和豆饼汁的制备同实施例1。接种量为12％(V/V)，摇瓶在23℃下150rpm振荡培养，然后在第3天、4天进行补料，补料培养基为(g/L)：玉米粉水解糖(以葡萄糖含量计算)10，硝酸钾1，继续培养至第9天，收获菌体，进行相关指标分析获得：菌体量为33.6g/L，油脂含量为36.7％，气相色谱检测花生四烯酸含量为72.8％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的0.69％，花生四烯酸产量达到8.98g/L。表6为实例6发酵后真菌油脂成分。
表6：实例6发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.23.54.34.85.03.20.20.30.92.872.80.51.50.69％ |
实施例7 5L发酵罐发酵
1、菌种活化
同实施例1
2、种子制备
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：6.0％(w/v)玉米淀粉水解糖，0.5％(w/v)酵母膏，0.3％(w/v)牛肉膏。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为150rpm，培养温度为25℃，振荡培养时间为3天。然后再转入发酵罐中继续发酵培养。
3、5L发酵罐发酵
采用B.Brown公司5L发酵罐进行发酵实验，发酵罐中培养基的装量为3.5L，发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉水解糖中含葡萄糖50，酵母膏5，牛肉膏3，硝酸钠3.5，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH调至6.5，并加入0.3％的泡敌。按10％(V/V)接种量将菌种从2中的种子摇瓶接入5L发酵罐中，发酵罐电机搅拌转速150rpm，空气流量0.3VVM，培养温度控制在23℃，从第3到第5天采用流加方式补充葡萄糖10g/L/天和硝酸钠2g/L/天，共培养8天，收获菌体并分析发酵结果获得：菌体量30.2g/L，油脂含量36.1％，花生四烯酸在油脂中的含量达到72.3％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.46％，花生四烯酸产量达到7.88g/L。表7是实例7发酵后真菌油脂成分。
表7：：实例7发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.34.34.85.23.40.40.70.61.12.272.32.52.23.46％ |
实施例8 5L发酵罐发酵
1、菌种活化
同实施例1
2、种子制备
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：4％(w/v)红薯淀粉水解糖，1.0％(w/v)蔗糖，50％豆芽汁。淀粉水解糖和豆芽汁的制备同实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为120rpm，培养温度为22℃，振荡培养时间为4天。然后再转入发酵罐中继续发酵培养。
3、5L发酵罐发酵
采用B.Brown公司5L发酵罐进行发酵实验，发酵罐中培养基的装量为3.5L，发酵培养基配方为(g/L)：红薯淀粉水解糖中含葡萄糖50，豆饼粉蛋白4.5，硝酸钾3.5，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH调至6.0，并加入0.3％的泡敌。按12％(V/V)接种量将菌种从2中的种子摇瓶接入5L发酵罐中，发酵罐电机搅拌转速60rpm，空气流量0.8VVM，培养温度控制在24℃，从第3到第5天采用分批方式补充葡萄糖30g/L/天，硝酸钠2g/L/天，共培养9天，收获菌体并分析发酵结果获得：菌体量31.2g/L，油脂含量34.8％，花生四烯酸在油脂中的含量达到65.5％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.05％，花生四烯酸产量达到7.11g/L。表8是实例8发酵后真菌油脂成分。
表8：：实例8发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.55.86.35.64.91.80.70.71.22.865.52.02.23.05％ |
实施例9 100L发酵罐发酵
1、菌种活化
同实施例1。
2、种子扩大
将生长在PDA固体培养基上的被孢霉的孢子用无菌水加玻璃珠振荡洗脱后，通过无菌操作接入装有种子培养基的摇瓶中。种子培养基配方为：7％(w/v)葡萄糖，45％(w/v)豆芽汁，豆芽汁制备同实施例1。摇瓶种子培养条件为：摇床转速为160rpm，培养温度为23℃，振荡培养时间为4天。然后再转入发酵罐中继续发酵培养。
3、100L发酵罐发酵
采用国产100L发酵罐进行发酵实验，发酵罐中培养基的装量为70L，发酵培养基配方为(g/L)：玉米粉水解糖中含葡萄糖100，豆饼汁蛋白7，硝酸钠2.8，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH调至6.5，并加入0.3％的泡敌。按10％(V/V)接种量将菌种从2中的种子摇瓶接入100L发酵罐中，发酵罐电机搅拌转速120rpm，空气流量1.2VVM，培养温度控制在23℃，第3，4，5天各补充葡萄糖20g/L，硝酸钾1.5g/L，共培养8天，收获菌体并分析发酵结果获得：菌体量31.3g/L，油脂含量36.4％，花生四烯酸在油脂中的含量达到70.3％，二十碳五烯酸残基含量为花生四烯酸残基含量的3.70％，花生四烯酸产量达到8.01g/L。表9为实例9发酵后真菌油脂成分。
表9：实例9发酵后真菌油脂成分
| 脂肪酸名称豆蔻酸(14:0)棕榈酸(16:0)硬脂酸(18:0)油酸(18:1)亚油酸(18:2)γ-亚麻酸(18:3n6)二十烷酸(20:0)二十碳一烯酸(20:1)二十碳二烯酸(20:2)二高γ-亚麻酸(20:3n6)花生四烯酸(20:4n6)EPA其他脂肪酸EPA/AA | 在油脂中的含量(％)0.24.13.53.95.23.90.50.61.32.870.32.61.13.70％ |
在100L发酵罐又进行了六批次生产稳定性实验，平均菌体量为30.5g/L，油脂含量为36.2％，花生四烯酸在油脂中的含量超过67.0％，花生四烯酸产量超过7.0g/L，EPA含量低于花生四烯酸含量的3.7％。表明该菌种在发酵罐中发酵生产花生四烯酸油脂的性能稳定，品质好，具有重要应用价值。
Claims (7)
1.一种花生四烯酸油脂，其特征在于所述的油脂由保藏编号为CGMCC№0903的高山被孢霉Mortierella alpina菌种M0223生产，含有65.5-73.5％的花生四烯酸残基，且二十碳五烯酸残基的含量为花生四烯酸残基含量的0.69-3.7％，其余为其他脂肪酸残基。
2.权利要求1所述花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于所述的方法步骤为：
(1)将保藏编号为CGMCC№0903的高山被孢霉Mortierella alpina M0223菌种培养活化，在装有种子培养基的摇瓶中进行种子培养，种子培养基包括碳源、氮源和无机盐，其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖的一种或多种，氮源选自豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、鱼粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸钾、硝酸钠中的一种或多种，无机盐选自磷酸氢二钾或磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种；
(2)将种子培养所得菌种接入装有发酵培养基的摇瓶或者发酵罐发酵培养，发酵培养基包括碳源、氮源和无机盐，其中，碳源选自淀粉水解糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、纤维二糖、糖蜜、脂肪酸和甘油中的一种或多种，氮源选自豆饼粉、花生饼粉、酵母膏、蛋白胨、鱼粉、牛肉膏、玉米浆、硝酸钾、硝酸钠中的一种或多种，无机盐选自磷酸氢二钾或磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸钠中的一种或多种；
(3)发酵结束后，收集湿菌体，烘干后提取干菌体中的油脂；
(4)将从干菌体中得到的粗油再进行脱胶、碱炼、脱色、脱臭和抗氧化中的一种或多种处理，得到花生四烯酸油脂产品；
其中
所述摇瓶种子培养条件为：摇床转速为80-200rpm，培养温度为18-28℃，振荡培养时间为3-5天；
所述摇瓶发酵培养条件为：菌种接种量为每100毫升的发酵培养基接入5-15毫升的摇瓶种子液，摇床转速为120-240rpm，培养温度为18-28℃，从发酵培养的第三天到第五天采用流加补料或分批补料方式，共补充相当于不高于90g/L葡萄糖的碳源和不高于9g/L硝酸钾的氮源，共振荡培养6-9天；
所述发酵罐发酵培养条件为：菌种接种量按每100毫升的发酵培养基接入5-15毫升的摇瓶种子液接入发酵罐进行一级发酵；或者进行多级发酵，即将前一级发酵罐的种子液按体积比为5-15％的接种量接入下一级发酵罐中，发酵罐搅拌转速60-150rpm，通气量为每分钟每升发酵液通入0.1-1.5升空气；发酵温度范围18-28℃，发酵6-9天，发酵过程采用流加补料或分批补料培养方法：从发酵的第三天到第五天共补充相当于不高于90克/升的葡萄糖的碳源，以及不高于9克/升硝酸钾的氮源。
3.权利要求2所述的花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基每百毫升含40-60克新鲜黄豆芽提取汁和3-8克的葡萄糖；种子培养基是通过称取40-60克新鲜黄豆芽加水煮沸0.5-1小时过滤后，加入葡萄糖3-8克溶解后定容至100ml而制备的。
4.权利要求2所述的花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：淀粉水解糖50-100克/升，豆饼粉汁蛋白1.5-8克/升，硝酸钾1.5-4.5克/升，K2HPO4.3H2O 1.5-4.5克/升，MgSO4.7H2O 0.2-1.0克/升，pH5.5-7.0；所述的发酵培养基中，淀粉水解糖是由淀粉先采用高温淀粉酶液化、再采用糖化酶进行糖化的双酶法制备的；豆饼粉汁是由豆饼粉采用热水提取制备的，并且在提取过程中以碳酸钠或氢氧化钠维持pH在7.0-8.0范围内。
5.权利要求2所述的花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养条件为：发酵温度范围22-25℃，pH范围5.5-6.0。
6.权利要求2所述的花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于，所述淀粉水解糖的淀粉来源包括玉米粉、红薯粉、小麦粉和土豆粉中的一种或多种。
7.权利要求2所述的花生四烯酸油脂的制备方法，其特征在于，所述发酵过程中采用变温控制，即在发酵的前3至5天，发酵温度控制在24-28℃范围；在发酵到第3至5天以后，发酵温度控制在18-22℃范围。
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