CN108004190B - 芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于增加小球藻生物量的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的制备方法为：取解淀粉芽孢杆菌ATCC 23843，短小芽孢杆菌ATCC 700814，先活化培养，然后接种到三角瓶中振荡培养，分别将其培养至浓度为1×10⁸个/ml的菌液，然后按照体积比1:1混合。本申请芽孢杆菌与小球藻实现共生促进关系，解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的存在改善了小球藻的生长微环境，使得小球藻的生物量更多，且油脂含量较对照组显著，利于大规模生产。

Description

芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法。

发明内容

微藻是指含有叶绿素A并能进行光合作用的微生物的总称，其个体微小，一般需要在显微镜下才能辨别形态，微藻分布广泛、陆地湖泊、海洋水域均有分布，浮游微藻对池塘养殖的物质循环和能量流动具有举足轻重的作用，它对于维持池塘生态系统的正常功能，稳定池塘环境是不可或缺的。绿藻门和蓝藻门浮游植物都可能成为天然水体中的优势种，而对于养殖池塘，人们更希望对养殖池塘内的养殖对象有益的绿藻门浮游植物能在水体中占据优势，优良的浮游微藻藻相在种群稳定、生物量持续增长的过程中，可促进水体中营养盐的分解与转化，减少并消除氨氮、亚硝酸氮、有机污染物等多种有毒物质；而且还可通过光合作用产氧而增加养殖水体的溶解氧，促进水体中富含的耗氧性有机质的氧化分解。

小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3～8微米，是地球上最早的生命之一，出现在20多亿年前，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻生息在淡水中，它借助阳光、水和二氧化碳，以每隔20小时分裂出4个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能量转化生成蕴涵多种营养成分的藻体，并在增殖中释放出大量的氧气；而它的光合能力高于其他植物10倍以上。小球藻不仅可以作为水生经济动物的优秀天然饵料，同时还可以吸收水中的氮、磷等元素，降低水体的富营养化水平，净化水质。不仅如此，小球藻富含油脂，可以用来生产生物柴油；还含有一些烃类物质，提取后可加工成汽油、柴油使用。若用污水大量培养小球藻并使其具有高油脂含量和烃含量，不仅可减缓水质恶化，而且可为生产生物质能提供大量优质原料。

当下，微藻的生长属于热门研究学科，而微藻培养条件的优化及油脂积累量成为研究的重点。目前，微藻的大规模培养主要有两条途径——自养培养和异养发酵，自养培养可以固定温室气体二氧化碳并释放出氧气，对环境友好，但是由于微藻细胞间的互相遮蔽效应，光能的利用往往受到极大的限制。细胞浓度越高，这种遮蔽效应体现得越明显，严重影响细胞的生长和脂肪合成，这使在光生物反应装置中实现含油微藻的高密度培养变得十分困难。对于异养培养而言，细胞的生长主要依赖细胞对有机碳源的吸收，由于它不受光的限制，因此可以通过流加有机碳来实现高密度发酵和脂肪的高效合成。尽管异养培养具有生长速率快、培养周期短、培养过程易控制等优点，但利用异养微藻生产生物柴油的主要问题在于该方法依赖有机碳源(如葡萄糖、淀粉等)为原料，增加了生产成本。现有技术中微藻的的生产大多是利用光生反应器，他们的研究重点由一般性生产技术研究转向其深加工与特殊物质提取的研究，我国台湾生产小球藻的技术也相当成熟，一些小球藻的产品已经被广大群众所接受，我国内地20世纪60年代虽然已经开展了对小球藻的研究，但由于还不能进行大规模生产将成本降低，所以，只停留在生产初级产品阶段，导致投入产出比极度不平衡，同时也制约了对其进行开发研究的进程，我国内地大规模开放式养殖模式生物量达到1000万个/ml左右，受到投入高产出低的限制，与国外养殖水平差距较大，另外，现有技术也有利用淀粉酶解培养异养藻快速热解制备生物柴油的方法。该专利以低质粮食淀粉为原料，利用酶解淀粉制葡萄糖水溶液配制培养液，再通过异养转化技术获得异养小球藻；然后用高脂肪含量的异养藻细胞快速热解，获得高产量和高质量的生物柴油。该方法选择低质粮食淀粉水解后提供葡糖糖用作有机碳源，成本较高，难以实现大规模生产。

近年来，我国养殖业得以快速发展，养殖废水因含有大量的氮、磷及极高浓度的有机物，被视为高浓度污水，直接排放会导致水体富营养化，污染水源。此外，养殖废水携带大量的病原菌、散发极浓的臭味，日益对环境造成严重污染。保护生态环境已刻不容缓。

微藻自身含油量高，可以用各种水体养殖，具有不占用耕地等优势，利用养殖废水培养微藻，不仅解决了废水直接排放的环境污染问题，还实现了养殖废水的资源化利用，对能源和环境两方面均产生了积极的影响。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供提高藻类生物量。本发明是采用如下技术方案实现的：

芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法，其特征在于步骤如下：

（1）挑取小球藻藻接种到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度5000lux， 25-26℃培养，每天摇动三角瓶2～3次。3～4d后可观察到培养液颜色逐渐变绿。待生长至对数生长期，得到种子液(藻液)，所述生长培养基每升含：葡萄糖5g，酵母粉1g，硫酸亚铁 1g，Na₂SO₃ 2g，氯化钠0.5g，硼砂0.1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，氯化铵1g。

所述小球藻为chlorella.Sp ATCC30412

（2）将步骤（1）获得的藻液按照15%的体积比接种到扩大培养基中，所述扩大培养基成分为：菌渣水解液：生长培养基（步骤1所用）：芽孢杆菌培养液按照体积比=6-7:2-3:1-2混合；

所述菌渣水解液为：将氨基酸发酵结束后获得氨基酸母液离心收集菌体蛋白，调整菌体蛋白的固含量为8%，添加5-10wt%的1mol/L的NaOH，常温下水解5-8d，获得菌渣水解液。

所述芽孢杆菌培养液为：取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23843，短小芽孢杆菌ATCC700814，先活化培养，然后接种到三角瓶中振荡培养，分别将其培养至浓度为1×10⁸个/ml的菌液，然后按照体积比1:1混合。

（3）扩大培养在20±10℃、2000±500LUX、摇床振动速度为20-100 rpm的条件下培养；

传统小球藻培养基含有常量元素、微量元素、维生素以及部分生长调节剂等20余种化学药品，操作麻烦，工作量大，特别是一些微量成分和元素，用量极少，误差大，且不便运输和商品化、市场化运作。本发明公开的生长培养基，该培养液只含有9种营养元素，使用方便，工作量小，储存、运输方便，便于培养液的工厂化、标准化、市场化、商品化、专业化生产，微量成分和元素定量准确，误差小。且也能够实现较好的小球藻培养效果；

本发明在微藻采用培养基培养后，扩大培养的过程中添加廉价碳源作为异养培养过程的生长碳源，该廉价碳源是一种经过处理的菌渣，该碳源比单纯添加葡萄糖或者淀粉水解液等异养碳源更据生长优势，同时本发明方法将常规生物发酵生产中的菌渣实现循环再利用，解决了菌渣的污染问题，还能变废为宝，由于菌渣基本上为固体物质，为了能更好的被小球藻吸收利用，本申请采用碱水解的方式更利于营养物质的吸收；

本发明所述的菌种均可通过常规的培养方法得到所需浓度的菌液，限于篇幅，并不一一赘述。

具体实施方式

实施例1：

芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法，其特征在于步骤如下：

（1）挑取小球藻藻种到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度5000lux， 26℃培养，每天摇动三角瓶2～3次。3～4d后可观察到培养液颜色逐渐变绿。待生长至对数生长期，得到种子液(藻液)，所述生长培养基每升含：葡萄糖5g，酵母粉1g，硫酸亚铁 1g，Na₂SO₃2g，氯化钠0.5g，硼砂0.1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，氯化铵1g。

所述小球藻为chlorella.Sp ATCC30412

（2）将步骤（1）获得的藻液按照15%的体积比接种到扩大培养基中，所述扩大培养基成分为：菌渣水解液：生长培养基：芽孢杆菌培养液按照体积比=6:2:1混合；

所述菌渣水解液为：将氨基酸发酵结束后获得氨基酸母液离心收集菌体蛋白，调整菌体蛋白的固含量为8%，添加5wt%的1mol/L的NaOH，常温下水解5d，获得菌渣水解液。

所述芽孢杆菌培养液为：分别取解淀粉芽孢杆菌ATCC 23843，短小芽孢杆菌ATCC700814，先活化培养，然后接种到三角瓶中振荡培养，分别将其培养至浓度为1×10⁸个/ml的菌液，然后按照体积比1:1混合。

（3）扩大培养在20±10℃、2000±500LUX、摇床振动速度为20-100 rpm的条件下培养；

实施例2：

芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法，其特征在于步骤如下：

（1）挑取小球藻藻种到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度5000lux， 26℃培养，每天摇动三角瓶2～3次。3～4d后可观察到培养液颜色逐渐变绿。待生长至对数生长期，得到种子液(藻液)，所述生长培养基每升含：葡萄糖5g，酵母粉1g，硫酸亚铁 1g，Na₂SO₃2g，氯化钠0.5g，硼砂0.1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，氯化铵1g。

所述小球藻为chlorella.Sp ATCC30412

（2）将步骤（1）获得的藻液按照15%的体积比接种到扩大培养基中，所述扩大培养基成分为：菌渣水解液：生长培养基：芽孢杆菌培养液按照体积比=7:3:2混合；

所述菌渣水解液为：将氨基酸发酵结束后获得氨基酸母液离心收集菌体蛋白，调整菌体蛋白的固含量为8%，添加10wt%的1mol/L的NaOH，常温下水解8d，获得菌渣水解液。

所述芽孢杆菌培养液为：取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23843，短小芽孢杆菌ATCC700814，先活化培养，然后接种到三角瓶中振荡培养，分别将其培养至浓度为1×10⁸个/ml的菌液，然后按照体积比1:1混合。

（3）扩大培养在20±10℃、2000±500LUX、摇床振动速度为20-100 rpm的条件下培养；

实施例3

小球藻和芽孢杆菌的共生实验以及菌渣的规模化处理：采用解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和小球藻共生培养小球藻更促进小球藻的生长，添加小球藻和芽孢杆菌的体系，芽孢杆菌的生长对小球藻的生长起到协同促进作用，可能是由于，在生长过程中，藻细胞会向外界环境分泌有利于细菌生长的物质，细菌利用这些分泌的物质同时产生二氧化碳以及无机盐类再同时促进小球藻的生长。

油脂含量测定：将处于稳定器的藻液3000r/min离心，将藻泥用去离子水清洗，然后电热鼓风机干燥箱中65度烘干获得藻粉，将藻粉破碎细胞壁后置于具有塞磨口试管，加无水乙醇，混匀，室温提取3h，期间适当混匀，上清液移入离心管，加活性白土脱色，离心收集上清，将上清于电热鼓风干燥箱中蒸去无水乙醇，称重，计算油脂含量，油脂含量=油脂含量/藻粉质量 %；

实验组：按照步骤实施例1的操作；

对照1组：不使用芽孢杆菌共生系统，即扩大培养基中删除芽孢杆菌培养液，其余均相同；

对照2组：扩大培养基不含有菌渣水解液，其余均相同；

对照3组：扩大培养基仅含有菌渣水解液和芽孢杆菌培养液，其余均相同；

对照4组，扩大培养基选择添加CN2015100638727公开的类芽孢杆菌，其余均相同；

对照5组，扩大培养基删除解淀粉芽孢杆菌培养液，即芽孢杆菌培养液是短小芽孢杆菌培养液。

上述均在培养瓶培养，2天后开始记录颜色，每隔24h使用显微镜及血红细胞计数板对各瓶中微藻细胞进行计数。将计数结果进行计算统计并绘制生长曲线进行对照。结果见表1：

表1 共生实验

	培养瓶颜色	小球藻细胞浓度	油脂含量wt%
				实验组	2天后培养瓶颜色变绿色，颜色逐渐加深	6.1×10<sup>10</sup>个/mL	44.7
对照1	第4天培养瓶颜色绿色	1.2×10<sup>9</sup>个/mL	31.4
				对照2	2天后培养瓶颜色变绿色，颜色逐渐加深	4.9×10<sup>10</sup>个/mL	42.3
对照3	第3天颜色绿色	1.9×10<sup>9</sup>个/mL	40.3
				对照4	第3天颜色变绿色	1.8×10<sup>10</sup>个/mL	39.2
对照5	第3天颜色变绿色	2.2×10<sup>10</sup>个/mL	33.7

通过上述实验可知，芽孢杆菌和小球藻共生系统能够生产更大的小球藻浓度，接种后2天培养瓶颜色变绿，且较之对照实验1-3组，该组表现出更深的绿色，表明小球藻细胞的数量较之后者有显著的提高，由于芽孢杆菌和小球藻的共生促进关系，解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌的存在改善了小球藻的生长微环境，使得小球藻的生物量更多，且油脂含量较对照组显著。对照1组，由于去除了芽孢杆菌的共生条件，使得小球藻的生长相对延滞，对数期生物量较之实验组显著下降，且生产的小球藻油脂含量也相对较低。本申请实验组较之对照2组，在扩大培养中使用了菌渣培养液，不仅实现了废物利用，且获得了较之常规培养基本上取得了相似的结果，在油脂含量以及生长速度和生物量上均较之生长培养基效果相当，其利用了廉价碳源，大大节约了能源。对照3组较之实验组，在获得藻液后直接进入有菌渣水解液和解淀粉芽孢杆菌培养液中培养，没有任何之前培养液成分的存在，由于缺少了一定的驯化环境，导致小球藻生长较之实验组缓慢，最终生物量也由此受到影响；对照4组较之实验组，共生的芽孢杆菌由本申请的解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌替换为类芽孢杆菌，在生物量获得和油脂含量上较之不使用菌藻共生系统有一定的提高，然而在生物量以及产生的小球藻油脂含量上，本申请均取得更加优异的效果，球藻细胞生物量提高2.38倍，油脂含量提高14%，显示本申请的小球藻和芽孢杆菌取得更加优异的协同效果，通过对照试验5可以显示解淀粉芽孢杆菌和短小芽孢杆菌在促进藻类共生中能够起到协同效应。

实施例4

生长培养基筛选试验

BG-11一般是藻类培养的常用培养基，然而，其含有常量元素、微量元素、维生素以及部分生长调节剂等，操作复杂，工作量大，小球藻在生长过程中所需的营养元素有15-20种，大多数元素不会成为限制性因此，其中C,N,P是生长的主要元素，对小球藻的生长和积累有较大影响，本申请申请人通过正交优化实验删选获得简易小球藻培养基成分葡萄糖5g，酵母粉1g，硫酸亚铁 1g，Na₂SO₃ 2g，氯化钠0.5g，硼砂0.1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，氯化铵1g。较之现有技术，使用方便，配制工作量小，且也能够实现较好的小球藻培养效果。

实验组：挑取小球藻藻种到盛有100mL生长培养基的三角瓶中，光照度5000lux，26℃培养，每天摇动三角瓶2～3次。待生长至对数生长期，得到种子液(藻液)；

对照1组：将生长培养基替换为BG-11,其余同实验组；

对照2组：以常规土池培养的碳酸氢铵和过磷酸钙作为营养源制备生长培养基培养，其余同实验组。

结果见表2

表2生长培养基筛选试验

	生长速度（5d后）	生长状态
			实验组	0.341d<sup>-1</sup>	3d后变绿，叶绿色含量显著增高
对照1组	0.347 d<sup>-1</sup>	3d后变绿，叶绿色含量显著增高
			对照2组	0.102 d<sup>-1</sup>	表面形成藻膜，附壁严重，镜检细胞粘结，胞体有一定比例的分解死亡

可见本申请培养基取得了较之BG-11基本相似的结果，大大简化了培养基成分，并降低成本。

实施例5 投喂实验

实验组：将实施例2培养获得的藻类按照30％的质量比加入粉碎过筛后的鲫鱼饲料原料，混匀后利用制粒机制成颗粒饲料，干燥后投喂鲫鱼，日投喂量为鱼体重的3％-5％。

试验鲫鱼仔鱼分别放养于容积为500L水族缸中，每个水族缸中放养20尾鱼。

对照组：在培养小球藻的过程中，不添加复合芽孢杆菌培养液，其余同实验组。

每种饲料设三个重复，养殖8周后，实验鱼禁食一天后称量体重，解剖后取肌肉样品进行常规营养成分分析，取肝脏样品进行非特异性免疫指标和抗氧化指标测定，结果见表3。

表3 投喂实验

	增重率	饵料系数	成活率	水分（肌肉营养成分）
					实验组	139.22±6.13	2.01±0.23	95%	76.45±1.17
对照组	103.12±5.14	2.92±0.13	90%	78.13±1.46

经上述实验可知，本申请制备的小球藻在鲫鱼投喂实验取得显著的效果，较之仅培养小球藻，鲫鱼在增重率、成活率均有提高，饵料系数下降，饵料利用率得以提高，且饲喂的鲫鱼水分含量也有所降低，增强蛋白品质。

实施例6 藻菌体系污水处理实验

取实施例1扩大培养的藻菌体系，10%v/v加入人工污水中，人工污水的pH为7.0-8.0、COD含量为500mg/L、TN含量100 mg/L、TP 含量5.3 mg/L；向反应器中曝模拟烟道气，模拟烟道气成分5-20% CO2和50-100ppm NO，其他成分为N2，反应器运行一天后，反应器出口气体成分平均浓度稳定在2.5%CO2、33ppmNO(氮气平衡)，培养3天后，采用离心的方法收集微藻，排出处理后水。处理后污水的COD、TN、TP的去除率分别为88%、91%、97%，出水达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB8978-2002)二级排放标准。

对照组，不添加复合芽孢杆菌培养液，其余同实施例1，将获得的小球藻体系，10%v/v加入人工污水中，人工污水的pH为7.0-8.0、COD含量为500mg/L、TN含量100 mg/L、TP 含量5.3 mg/L；向反应器中曝模拟烟道气，模拟烟道气成分5-20% CO2和50-100ppm NO，其他成分为N2，培养3天后，采用离心的方法收集微藻，排出处理后水。处理后污水的COD、TN、TP的去除率分别为54%、65%、72%，较之实验组，差异显著。

本申请小球藻于芽孢杆菌的共生体系对污水的处理效果显著大于单一小球藻体系。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本案作了详尽的说明，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (2)

1.复合芽孢杆菌用于增加小球藻生物量的方法，具体步骤如下：

步骤（1）挑取小球藻接种到生长培养基中，生长至对数生长期，得到种子液；所述生长培养基每升含：葡萄糖5g，酵母粉1g，硫酸亚铁 1g，Na₂SO₃ 2g，氯化钠0.5g，硼砂0.1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，氯化铵1g；

所述小球藻为chlorella.Sp ATCC 30412；

步骤（2）将步骤（1）获得的种子液按照15%的体积比接种到扩大培养基中进行扩大培养；扩大培养条件为：20±10℃，2000±500LUX，摇床振动速度为20-100rpm；

所述复合芽孢杆菌是由解淀粉芽孢杆菌ATCC 23843和短小芽孢杆菌ATCC 700814按照1:1的体积比例混合获得的芽孢杆菌混合液；

所述扩大培养基成分为：菌渣水解液：生长培养基：复合芽孢杆菌按照体积比=6-7:2-3:1-2混合；

所述菌渣水解液为：将氨基酸发酵结束后获得的氨基酸母液进行离心，收集菌体蛋白，调整菌体蛋白的固含量为8wt%，添加10wt%的1mol/L的NaOH，常温下水解5-8d，获得菌渣水解液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合芽孢杆菌的制备方法为：分别取解淀粉芽孢杆菌ATCC 23843和短小芽孢杆菌ATCC 700814，先活化培养，然后接种到三角瓶中振荡培养，分别将其培养至浓度为1×10⁸个/ml的菌液，然后按照体积比1:1混合。