CN101812484B - 高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法 - Google Patents

高密度培养裂殖壶菌发酵生产dha的方法 Download PDF

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高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，涉及DHA的制备方法，提供一种采用微生物发酵法生产DHA的方法，代替鱼油提取ω-3多元不饱和脂肪酸。按体积比菌种∶培养基为1∶(5～10)，将菌种接种至摇瓶培养至发酵液中细胞干重为10～12g/L；然后按照5～10％的接种量将摇瓶的菌种接种到1000L种子发酵罐，培养至发酵液中细胞干重为20～24g/L；再按照5～10％的接种量将1000L种子发酵罐的菌种接种到8000L种子发酵罐，培养120～130小时，发酵液中细胞干重为120～150g/L，DHA含量达到26～30g/L。本发明通过优化培养基和优化培养条件，采用传统的发酵方法，DHA生产率比已报道的高出3倍以上。且菌种(裂殖壶菌)、培养基和培养条件生产成本低产量高，适用于工业化生产DHA。

Description

高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法
技术领域
本发明涉及DHA的制备方法，尤其是以微生物发酵法生产DHA的方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)是一种Omega-3多元不饱和脂肪酸，动物自身难以合成，有重要的生理调节功能和医疗及保健作用。DHA传统来源主要是从海洋鱼类以及它们的鱼油提取得到，但是这种方法存在以下缺点：
(1)资源有限，产量不稳定。每种来源的鱼油脂肪酸的组成，也就是ω-3多元不饱和脂肪酸的含量因鱼的种类、捕捞的季节、气候和地点的不同而存在着差异，鱼油产量波动很大。现在，全球鱼油年产量为100万吨，其中多元不饱和脂肪酸10万至25万吨，如果这些鱼油全部用来提取ω-3多元不饱和脂肪酸，获得的EPA(二十碳五烯酸)和DHA只够供给5500～10400万人每人每天5g的摄取量，这样的供应量远远不能满足市场需求。
(2)纯化工艺复杂，产品得率低。由于鱼油成分复杂，含有难以去除的胆固醇成分、脂溶性纤维素，这些物质可贮存在人体的脂肪组织中，而不通过代谢及泌尿系统排出体外，高剂量的脂溶性纤维素可导致肾脏疾病或失明；同时，鱼油中含有高达80％的饱和脂肪酸和大量ω-6脂肪酸，过量的摄食对人体有很大的副作用，鉴于此，要获得纯度较高的DHA，分离纯化工艺非常复杂，成本也比较高。工业生产中从鱼油提炼DHA和EPA时，先将鱼油中的油和水进行分离，然后再经过浓缩、蒸馏、精制、脱臭等一系列复杂工艺，才能得到一定纯度的产品。理论上讲，100万吨鱼油中可得到10-25万吨DHA，然而在实际生产过程中鱼油多被氢化，ω-3多元不饱和脂肪酸被氢化饱和，降低了其在鱼油中的含量，造成了原料的浪费，同时也损害了DHA和EPA的品质，随着对ω-3多元不饱和脂肪酸的生理、营养和药理作用的深入了解，DHA等ω-3多元不饱和脂肪酸的药用需求量也越来越大，鉴于鱼油难以提纯的特点，目前的海洋鱼油生产远不能满足市场需求，必须寻找可替代的资源。
(3)鱼油产品难以应用于食品添加剂行业。由于鱼油含有很重的且难闻的鱼腥味，虽然经过复杂的提纯工艺，鱼腥味仍然难以除去，产品中这种鱼腥味就极大地限制了这些高附加值产品在食品行业中的应用。如果采用一些方法(如：包埋等)专门来掩盖或去除鱼油特有的鱼腥味，就无形中又增加了产品的成本，不利于产品的市场竞争。
(4)不利于环境资源的保护。由于人们对ω-3多元不饱和脂肪酸的生理作用认识的不断提高，对DHA等ω-3多不饱和脂肪酸的市场需求也在不断增加，这也会导致某些为了商业利益而不计后果的过量捕捞行为的出现，给环境资源保护带来了负面影响。
发明内容
本发明的目的旨在于提供一种采用微生物发酵法生产DHA的方法，代替鱼油提取ω-3多元不饱和脂肪酸。
所说的以裂殖壶菌发酵生产DHA的方法如下：
1)按体积比菌种∶培养基为1∶(5～10)，将菌种接种至装有培养基的250ml摇瓶中，在22～28℃的摇床中以220rpm的转速，培养20～30小时；然后按照5～10％的接种量接种至装有培养基的1000ml的摇瓶，在22～28℃的摇床中以220rpm的转速，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为10～12g/L；
2)按照5～10％的接种量将摇瓶的菌种接种到装有培养基的1000L种子发酵罐，整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度22～28℃，通气量8～10m3/h，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为20～24g/L；
3)按照5～10％的接种量将1000L种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000L种子发酵罐，整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度22～28℃，通气量20～22m3/h，溶氧控制在30％～50％，罐内葡萄糖浓度维持在5～10g/L；通过流加碳源发酵培养120～130小时，放罐，测定发酵液中细胞干重为120～150g/L，DHA含量达到26～30g/L。
上述菌种为裂殖壶菌菌种。
上述摇瓶培养基配方为：葡萄糖：95～105g/L，酵母粉：20～30g/L。
上述1000L种子罐培养基配方为：葡萄糖：120～126g/L；酵母膏：15～20g/L；大豆蛋白胨：2.9～3.1g/L；乙酸铵：1.7～1.9g/L。
上述8000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：120～126g/L；酵母膏：15～20g/L；大豆蛋白胨：2.9～3.1g/L；乙酸铵：1.7～1.9g/L；氯化钾：0.6～0.80.70g/L；硫酸镁：1.8～2.2g/L；磷酸二氢钾：1.9～2.1g/L；氯化钙：0.19～0.21g/L；硫酸铵：1.4～1.6g/L；硫酸锰：4.9～5.1mg/L；七水硫酸锌：3.9～4.1mg/L；五水硫酸铜：2.9～3.1mg/L；钼酸钠：0～0.07mg/L；甘氨酸：1.9～2.1g/L；谷氨酸：1.6～1.8g/L；色氨酸：1.5～1.7g/L；赖氨酸：0.29～3.1g/L。
本发明利用高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA做为替代资源，代替鱼油提取ω-3多元不饱和脂肪酸，具有以下优势：
(1)可以全年进行生产，不受原料和产地的限制，没有季节或气候的依赖性。现在微生物发酵技术的快速发展也给高密度培养产DHA的细菌提供了必要的技术支持。
(2)从微生物中提取得到的油脂不像鱼油制品那样含有胆固醇，产品品质可以保证。
(3)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA不具有鱼腥味，而且也没有杀虫剂和重金属离子的污染。
(4)尽管目前发现的高密度培养裂殖壶菌发酵生产的脂质含量通常比传统鱼油低，但微生物发酵生产的油脂含有大量必须脂肪酸，微生物脂肪酸组成比较简单，多元不饱和脂肪酸的含量比较高，富集也比较容易，这种高纯度简化了提纯过程，在商业生产上可大大降低生产成本。
(5)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA，发酵条件比较容易控制，进而为控制脂质产量和组成提供了可能。
(6)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA同时可以生产含PUFA(多不饱和脂肪酸)的磷脂、糖脂等，这些物质有许多具有特殊的药用价值。
(7)高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA，其菌种裂殖壶菌富含蛋白质、微量元素、维生素、抗氧化剂等，在膳食配方中可以作为大量营养素和微量营养素的来源。
(8)可以利用基因工程手段并结合微生物产多元不饱和脂肪酸的代谢途径，利用代谢调控的方法来控制PUFA的组成。
(9)利用高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA等多元不饱和脂肪酸还可以减少因市场需求而大量捕捞带来的对环境的影响，对环境资源的保护具有潜在的意义，同时微生物发酵法生产多不饱和脂肪酸产品，在生产过程中三废少，工厂的建设和投产投资成本低。
总之，本发明通过优化培养基和优化培养条件，采用传统的发酵方法，经过5天培养，在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到120～150g/L，DHA达到26～30g/L，DHA生产率达到5.2～6.0克/(升·天)，比已见报道的DHA生产率高出3倍以上。且菌种(裂殖壶菌)、培养基和培养条件生产成本低产量高，适用于工业化生产DHA。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做详细说明。
实施例1：
1)按葡萄糖：100g/L，酵母粉：25g/L配制摇瓶培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
2)取10ml保藏于超低温冰箱的甘油管裂殖壶菌菌种，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，在25℃的摇床中以220rpm的转速，培养24小时；然后按照10％的接种量接种至装有400ml培养基的1000ml的摇瓶，在25℃的摇床中以220rpm的转速，培养24小时。测定发酵液中细胞干重为12g/L。
3)按葡萄糖：123g/L，酵母膏：17g/L，大豆蛋白胨：3.0g/L，乙酸铵：1.8g/L配制1000L种子罐培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
4)将摇瓶种子按照10％的接种量接种到装有500L培养基的1000L种子发酵罐后，整个发酵过程利用28％氨水控制pH在5.5～6.0之间，培养温度25℃，通气量8m3/h，培养24小时后，测定发酵液中细胞干重为24g/L。
5)按照葡萄糖：123g/L，酵母膏：17g/L，大豆蛋白胨：3.0g/L，乙酸铵：1.8g/L，氯化钾：0.70g/L，硫酸镁：2g/L，磷酸二氢钾：2g/L，氯化钙：0.20g/L，硫酸铵：1.5g/L，硫酸锰：5mg/L，七水硫酸锌：4mg/L，五水硫酸铜：3mg/L，钼酸钠：0.07mg/L，甘氨酸：2.0g/L，谷氨酸：1.7g/L，色氨酸：1.6g/L，赖氨酸：0.3g/L，进行8000L发酵罐的培养基配制，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
6)将1000L种子罐按照10％接种量接种至装有5000L培养基料液的8000L发酵罐，整个发酵过程培养温度25℃，通气量22m3/h；用28％氨水控制pH在5.5～6.0之间，利用搅拌转速控制溶氧在40％；通过流加碳源进行发酵，始终使发酵罐内葡萄糖浓度维持在8～10g/L之间；发酵培养5天，放罐，在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到150g/L，DHA达到30g/L。
实施例2：
1)按葡萄糖：95g/L，酵母粉：30g/L配制摇瓶培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
2)取5ml保藏于超低温冰箱的甘油管裂殖壶菌菌种，接种至装有50ml培养基的250ml的摇瓶中，在25℃的摇床中以220rpm的转速，培养24小时；然后按照5％的接种量接种至装有400ml培养基的1000ml的摇瓶，在22℃的摇床中以220rpm的转速，培养30小时。测定发酵液中细胞干重为10g/L。
3)按葡萄糖：120g/L，酵母膏：20g/L，大豆蛋白胨：3.1g/L，乙酸铵：1.7g/L配制1000L种子罐培养基，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
4)将摇瓶种子按照10％的接种量接种到装有500L培养基的1000L种子发酵罐后，整个发酵过程利用30％氨水控制pH在5.5～6.0之间，培养温度22℃，通气量10m3/h，培养30小时后，测定发酵液中细胞干重为20g/L。
5)按照葡萄糖：120g/L，酵母膏：20g/L，大豆蛋白胨：3.1g/L，乙酸铵：1.7g/L，氯化钾：0.60g/L，硫酸镁：2.2g/L，磷酸二氢钾：1.9g/L，氯化钙：0.19g/L，硫酸铵：1.6g/L，硫酸锰：4.9mg/L，七水硫酸锌：4.1mg/L，五水硫酸铜：3.1mg/L，钼酸钠：0.01mg/L，甘氨酸：2.1g/L，谷氨酸：1.6g/L，色氨酸：1.7g/L，赖氨酸：0.31g/L，进行8000L发酵罐的培养基配制，配制完成后利用氢氧化钠调节pH7.5，121℃，30min灭菌，灭菌后调节pH 6.0备用；
6)将1000L种子罐按照10％接种量接种至装有5000L培养基料液的8000L发酵罐，整个发酵过程培养温度22℃，通气量20m3/h；用30％氨水控制pH在5.5～6.0之间，利用搅拌转速控制溶氧在50％；通过流加碳源进行发酵，始终使发酵罐内葡萄糖浓度维持在5～8g/L之间；发酵培养5天，放罐，在8000L发酵罐中发酵液的细胞干重达到120g/L，DHA达到36g/L。

Claims (1)

1.高密度培养裂殖壶菌发酵生产DHA的方法，其特征在于所说的以裂殖壶菌发酵生产DHA的方法如下：
1)按体积比菌种：培养基为1∶5～10，将菌种接种至装有培养基的250ml摇瓶中，摇瓶培养基配方为：葡萄糖：95～105g/L，酵母粉：20～30g/L；在22～28℃的摇床中以220rpm的转速，培养20～30小时；然后按照5～10％的接种量接种至装有培养基的1000ml的摇瓶，在22～28℃的摇床中以220rpm的转速，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为10～12g/L；
2)按照5～10％的接种量将摇瓶的菌种接种到装有培养基的1000L种子发酵罐，1000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：120～126g/L；酵母膏：15～20g/L；大豆蛋白胨：2.9～3.1g/L；乙酸铵：1.7～1.9g/L；整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度22～28℃，通气量8～10m3/h，培养20～30小时，测定发酵液中细胞干重为20～24g/L；
3)按照5～10％的接种量将1000L种子发酵罐的菌种接种到装有培养基的8000L种子发酵罐，8000L种子发酵罐培养基配方为：葡萄糖：120～126g/L；酵母膏：15～20g/L；大豆蛋白胨：2.9～3.1g/L；乙酸铵：1.7～1.9g/L；氯化钾：0.6g/L或0.7g/L；硫酸镁：1.8～2.2g/L；磷酸二氢钾：1.9～2.1g/L；氯化钙：0.19～0.21g/L；硫酸铵：1.4～1.6g/L；硫酸锰：4.9～5.1mg/L；七水硫酸锌：3.9～4.1mg/L；五水硫酸铜：2.9～3.1mg/L；钼酸钠：0～0.07mg/L；甘氨酸：1.9～2.1g/L；谷氨酸：1.6～1.8g/L；色氨酸：1.5～1.7g/L；赖氨酸：0.29～3.1g/L；整个发酵过程采用28％～30％氨水控制pH在5.5～6.0，培养温度22～28℃，通气量20～22m3/h，溶氧控制在30％～50％，罐内葡萄糖浓度维持在5～10g/L；通过流加碳源发酵培养120～130小时，放罐，测定发酵液中细胞干重为120～150g/L，DHA含量达到26～30g/L。 
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