CN1710060A - 三角褐指藻的一种开放式培养方法及其专用培养基 - Google Patents

三角褐指藻的一种开放式培养方法及其专用培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了三角褐指藻的一种开放式培养方法及其专用培养基。本发明所提供的培养基命名为ZBPT，其配方为：硝酸钠，135－165mg；磷酸二氢钾，32－38mg；硅酸钠，215－255mg；碳酸氢钠，400－500mg；碘化钾，400－1000mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000ml。应用本发明所提供的培养基培养三角褐指藻的方法，包括如下步骤：1)用海水配置培养基；2)三角褐指藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按与培养基体积比为1∶5－9的比例将三角褐指藻接种到培养基中，在19－25℃，光照强度3000－6000Lux，光照时间8－12h/天条件下通气培养。本发明的ZBPT培养基有利于三角褐指藻生物量的积累，并能有效防治绿藻污染，可在开放环境中大规模培养三角褐指藻，具有重要的应用价值。

Description

三角褐指藻的一种开放式培养方法及其专用培养基
技术领域
本发明涉及藻类的培养方法及其专用培养基，特别是涉及三角褐指藻的开放式培养方法及其专用培养基。
背景技术
三角褐指藻(Phaedactylum tricornutum)属于硅藻门羽纹藻纲，是一种常见海洋生态系统的初级生产力藻类。三角褐指藻富含多种不饱和脂肪酸，特别是二十碳五烯酸(EPA)，使其成为很多珍贵水产动物的可口饵料，和海洋生物制药的原料。
天然海水中的三角褐指藻与其他多种微藻混杂生长在一起，种群密度很低，无法满足水产养殖业的需要。目前大多数三角褐指藻人工培养基的营养盐组成都适合于绿藻的生长，因此在三角褐指藻培养过程中，经常出现单细胞绿藻如小球藻、盐藻等污染，这些单细胞绿藻生长速度快，在大量消耗培养基养分的同时还分泌胞外产物抑制三角褐指藻的生长，容易导致培养失败。现阶段三角褐指藻培养基常采用f/2培养基，但该培养基只能在实验室条件下小体积培养(1升左右)，且极容易污染单细胞绿藻，无法进行规模化培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种能使三角褐指藻在开放条件下快速生长的培养基。
本发明所提供的三角褐指藻培养基命名为ZBPT，其配方如下：硝酸钠，135-165mg；磷酸二氢钾，32-38mg；硅酸钠，215-255mg；碳酸氢钠，400-500mg；碘化钾，400-1000mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000毫升；所述f/2微量元素溶液为：硫酸锌，23mg；氯化钴，12mg；氯化锰，178mg；硫酸铜，10mg；钼酸纳，7.3mg；柠檬酸铁，3.9g；乙二胺四乙酸二纳，4.35g；纯水定容至1000ml；所述改良f/2维生素溶液为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。
培养基的优选方案为：1L培养基中所述硝酸钠为148mg；所述磷酸二氢钾为34.8mg；所述硅酸钠为238mg；所述碳酸氢钠为450mg；所述碘化钾为800mg。
海水在配制培养基前按如下步骤处理：1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
本发明的第二个目的是提供一种应用本发明所提供的ZBPT培养基培养三角褐指藻的方法。
应用本发明的ZBPT培养基培养三角褐指藻，包括如下步骤：1)用海水配置培养基；2)按三角褐指藻与培养基体积比为1∶5-9的比例将三角褐指藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
培养过程的通气量为0.5m3/min；培养8-14天即可达到培养终点。优选培养条件为：温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
人工培养三角褐指藻主要涉及两方面的关键技术：即培养基的组成和绿藻污染的防治。本发明所提供的ZBPT培养基能使三角褐指藻细胞快速利用培养基的营养成分，达到细胞快速分裂，有利于三角褐指藻生物量的积累；在ZBPT培养基中加入800mg/L碘化钾，可使三角褐指藻生物量提高22.1％，并能有效达到防治绿藻污染的目的，可以采用开放式的培养方式大规模获得三角褐指藻及其目标产物，对水产养殖业和海洋生物制药有着十分重要的意义。
附图说明
图1为三角褐指藻在f/2培养基和ZBPT培养基的生长曲线
图2为三角褐指藻在含碘化钾和不含碘化钾ZBPT培养基的生长曲线
图3为三角褐指藻在不同碘化钾浓度ZBPT培养基的生长曲线
具体实施方式
实施例1、三角褐指藻在ZBPT培养基中的生长培养
1、ZBPT培养基的配制
1)取1L天然静置海水，加入1N盐酸调节海水pH为3，静置12h，除去沉淀物；然后加入1N NaOH调节至pH为7.5左右，静置除去沉淀物。
2)定量称取下述物质配制ZBPT培养基：硝酸钠(Na NO3)：148mg；磷酸二氢钾(KH2PO4)，34.8mg；硅酸钠(NaSiO3)，238mg；碳酸氢钠(NaHCO3)，450mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；碘化钾(KI)，800mg；步骤1)海水海水定容至1000ml。其中，f/2微量元素溶液为：硫酸锌，23mg；氯化钴，12mg；氯化锰，178mg；硫酸铜，10mg；钼酸纳，7.3mg；柠檬酸铁，3.9g；乙二胺四乙酸二纳，4.35g；纯水定容至1000ml；改良f/2维生素溶液为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。
2、三角褐指藻在ZBPT培养基中的培养
按三角褐指藻与ZBPT培养基体积比为1∶5的比例接种三角褐指藻到培养罐中，在温度为25℃、光照时间为10h/天、光强5000Lux条件下，以0.5m3/min通气量通气培养。
以f/2培养基作为对照，采用与上相同的培养方式进行培养。
三角褐指藻在两种培养基上的生长曲线如图1所示，图中A为f/2培养基；B为ZBPT培养基。培养结果表明，三角褐指藻在ZBPT培养基中的整个生长过程历时8-12天，最长可达20天；随初始培养的接种密度和比例不同而有差异。通常情况下当藻种密度为3×105cells/ml、接种比例为1∶5时，培养第3天即进入指数生长期，第9天藻胞密度达最大值；接着藻细胞分裂开始变慢，藻体开始缓慢下沉，藻液颜色变浅并最终在底部形成藻泥，生长结束。与之相比，三角褐指藻在f/2培养基中第5天才进入对数期，第6天开始，细胞生长缓慢，到第11天才达最大值。
实施例2、含碘化钾的ZBPT培养基对三角褐指藻培养过程中绿藻污染的防治作用
按下述配方配制ZBPT培养基：硝酸钠，135mg；磷酸二氢钾，38mg；硅酸钠，215mg；碳酸氢钠，500mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000ml。
其中一部分加入800mg/L碘化钾，另一部分不加。在温度为25℃、光照时间为8h/天、接种量为1∶9、光强5000Lux条件下通气培养三角褐指藻12天，其他操作与实施例1相同。三角褐指藻生长曲线如图2所示，图中A为未加碘化钾；B为加入800mg/L碘化钾。
结果表明，三角褐指藻在不加碘化钾的培养基中培养时，接种5天后，培养体系受到绿藻污染，新月菱形藻生长速度缓慢，藻体细胞密度下降；在ZBPT培养基中加入800mg/L的碘化钾时，可有效预防绿藻类的污染，对已污染的三角褐指藻培养物中单细胞绿藻也能有效遏制，具体表现为单细胞绿藻类种群数量增长停止并逐渐减少，存活的单细胞绿藻多附着在容器液面上方的器壁上。此外，碘化钾的加入还能促进三角褐指藻的生长，迅速形成生长优势，进一步抑制单细胞绿藻等杂藻的生长。
实施例3、三角褐指藻在不同碘化钾浓度ZBPT培养基的生长培养
按下述配方配制ZBPT培养基：硝酸钠，165mg；磷酸二氢钾，32mg；硅酸钠，255mg；碳酸氢钠，400mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000ml。
向其中分别加入不同浓度的碘化钾：0、200、400、600、800、1000、1200、1400mg/L，在温度为25℃、光照时间为12h/天、接种量为1∶9、光强5000Lux条件下通气培养三角褐指藻12天，其他操作与实施例1相同。三角褐指藻生长曲线如图3所示，图中A-H碘化钾浓度分别为0、200、400、600、800、1000、1200、1400mg/L。
从图中可以看出，不同浓度的碘化钾在ZBPT培养基中对三角褐指藻培养生物量有一定的影响：碘化钾在400-800mg/L内对三角褐指藻培生物量的积累有促进作用，其中800mg/L对生物量积累的促进作用最为显著，达22.1％；碘化钾的加入使细胞生长最大密度的到来推迟2-3天。
实施例4、用ZBPT培养基培养的三角褐指藻藻体脂肪酸的组成
按照实施例1的ZBPT培养基配方配制培养基120L，以f/2培养基作为对照，培养方式与实施例1相同，培养10天后，收集藻体细胞，按常规方法测定藻体脂肪酸的组成，结果如表1所示，其中表中14:0表示饱和十四碳酸；i-15:0表示饱和十五碳酸；16:1(n-7)表示十六碳-9-烯酸；其余与此类似。
结果表明，在ZBPT培养的三角褐指藻其藻体脂肪酸的组成以二十碳五烯酸(EPA)为主要成分(34.9％)，其次为十六碳一烯酸(18.4％)和十六碳酸(13.3％)；亚麻酸、十四碳酸、二十二碳六烯酸也占有较大的比例，分别为4.7％、4.1％和3.9％。在f/2培养基培养的三角褐指藻其藻体脂肪酸的组成也以二十碳五烯酸(EPA)为主要成分(30.7％)，其次为十六碳一烯酸(21.8％)和十六碳酸(16.3％)；十六碳三烯酸、十四碳酸、二十碳四烯酸和二十二碳六烯酸也占有较大的比例，分别为5.7％、5.1％、2.9％和2.8％。与f/2培养基相比，在ZBPT培养基培养的三角褐指藻不饱和脂肪酸含量略高。
表1.三角褐指藻在ZBPT及f/2培养基培养的藻体脂肪酸组成
  脂肪酸组成   培养基ZBPT  培养基f/2
  14:014:1i-15:015:016:016:1(n-7)i-17:016:2(n-6)16:3(n-4)16:4(n-1)18:018:1(n-9)18:1(n-7)18:2(n-6)18:3(n-6)18:4(n-3)20:3(n-6)20:4(n-6)20:4(n-3)20:5(n-3)22:5(n-3)   4.11.40.30.513.318.41.20.52.31.91.70.50.41.84.71.90.83.80.734.90.7  5.10.40.40.416.321.81.00.35.71.21.21.80.72.11.70.70.32.91.730.70.8
  22:6(n-3)   3.9  2.8

Claims (9)

1、一种三角褐指藻培养基，其配方如下：硝酸钠，135-165mg；磷酸二氢钾，32-38mg；硅酸钠，215-255mg；碳酸氢钠，400-500mg；碘化钾，400-800mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000毫升；所述f/2微量元素溶液为：硫酸锌，23mg；氯化钴，12mg；氯化锰，178mg；硫酸铜，10mg；钼酸纳，7.3mg；柠檬酸铁，3.9g；乙二胺四乙酸二纳，4.35g；纯水定容至1000ml；所述改良f/2维生素溶液为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml。
2、根据权利要求1所述的三角褐指藻培养基，其特征在于：所述硝酸钠为148mg；所述磷酸二氢钾为34.8mg；所述硅酸钠为238mg；所述碳酸氢钠为450mg。
3、根据权利要求1或2所述的三角褐指藻培养基，其特征在于：所述碘化钾为800mg。
4、根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于：所述海水按如下步骤处理：
1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
5、一种三角褐指藻的培养方法，包括如下步骤：1)用海水配置培养基，其配方如下：硝酸钠，135-165mg；磷酸二氢钾，32-38mg；硅酸钠，215-255mg；碳酸氢钠，400-500mg；碘化钾，400-1000mg；f/2微量元素溶液，1ml；改良f/2维生素溶液，1ml；海水定容至1000毫升；所述f/2微量元素溶液为：硫酸锌，23mg；氯化钴，12mg；氯化锰，178mg；硫酸铜，10mg；钼酸纳，7.3mg；柠檬酸铁，3.9g；乙二胺四乙酸二纳，4.35g；纯水定容至1000ml；所述改良f/2维生素溶液为：维生素B12，0.5mg；维生素B1，100mg；维生素H，0.5mg；纯水定容至1000ml；2)三角褐指藻藻种密度为3×105细胞/毫升，按与培养基体积比为1∶5-9的比例将三角褐指藻接种到培养基中，在19-25℃，光照强度3000-6000Lux，光照时间8-12h/天条件下通气培养。
6、根据权利要求5所述的培养方法，其特征在于：步骤1)所述硝酸钠为148mg；所述磷酸二氢钾为34.8mg；所述硅酸钠为238mg；所述碳酸氢钠为450mg；所述碘化钾为800mg。
7、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：所述海水在配置培养基前按如下步骤处理：1)用盐酸调节天然海水pH为2-4，静置12-24h；2)用NaOH调节pH到7.0-8.0。
8、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：步骤2)所述通气培养的通气量为0.5m3/min。
9、根据权利要求5或6所述的培养方法，其特征在于：步骤2)所述培养温度为25℃；光照强度为5000Lux；光照时间为10h/天。
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