CN102382873A - 一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法 - Google Patents

一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法 Download PDF

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朱葆华
陈常杰
潘克厚
刘冬梅
杨官品
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Abstract

本发明提供一种三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,其特征在于包含如下步骤:(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;(2)基因枪转化;(3)荧光显微镜观察。本发明的优点在于:简单,快速,容易实现,经济适用。

Description

一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种微藻检测方法,尤其涉及一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法,属于微藻分子生物学技术领域。
技术背景
遗传转化体系的建立是实现外源基因在宿主中表达的基础,也是研究基因功能、进行基因表达调控最直接的平台。在藻类中,莱茵衣藻的转化体系已经相当成熟,是目前唯一建立细胞核、叶绿体和线粒体三套遗传转化的生物材料,许多内源基因的功能通过其转化体系得到直接验证。团藻、小球藻、盐藻等真核微藻也相继转化成功。海洋硅藻由于具有硅质的外壳,常规的转化方法难以奏效,直到1995年才有了转化成功的报道。
三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum Bohlin)是一种真核海洋单细胞硅藻,营养丰富,是多种养殖生物的优良饵料;能够大量合成并积累PUFAs,特别是EPA,其EPA含量可占总脂肪酸含量的30%以上,有望成为工业化生产EPA的原料。另外,三角褐指藻的遗传背景非常清楚,已经获得了其全基因组序列,为进行三角褐指藻遗传转化创造了有利条件,是研究PUFA生物合成及调控机理的理想材料。目前,三角褐指藻转化体系建立需要提取基因组DNA,通过PCR或Southern blotting的方法进行检测,这2种方法操作比较繁琐,不太容易掌握。本发明的目的在于找到一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法,也是对上述2种方法的有益补充。
发明内容
本发明的目的在于找到一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法,该检测方法通过对GFP基因重组质粒构建,基因枪转化,荧光显微镜观察来快速检测三角褐指藻遗传转化体系,也是PCR或Southern blotting方法的有益补充。
本发明的目的是这样来达到的,研制了一种三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法,该检测方法包含如下步骤:
(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;
(2)基因枪转化,将离心收获的藻细胞用新鲜培养基重新悬浮,取约5×107个藻细胞在轰击前1小时涂布于f/2直径约2-2.5cm的固体平板中央,取10μL微粒子弹(包被质粒DNA 1.0μg)于DNA载片中央,无菌风吹干;将平板置于基因枪第二层进行轰击;轰击的藻细胞置于光照下培养24小时后,将藻细胞用500μL新鲜培养基洗下重新涂布于含有100μg·mL-1博莱霉素(Zeocin)的固体培养基上至长出单藻落;
(3)荧光显微镜观察,挑取单藻落于含有100μg·mL-1博莱霉素的新鲜液体培养基中培养7天后用Nikon E50i荧光显微镜观察藻细胞,同一个视野分别在可见光和蓝光下拍照。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的重组质粒构建提取的重组质粒应为一条主带,且为超螺旋的。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的基因枪转化轰击压力为1500psi。
本发明的优点在于:简单,快速,容易实现,经济适用。
具体实施例
为能进一步说明三角褐指藻遗传转化体系构建的快速检测方法具体实施例如下;
实施例1:
(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;
(2)基因枪转化,将离心收获的藻细胞用新鲜培养基重新悬浮,取约5×107个藻细胞在轰击前1小时涂布于f/2直径约2-2.5cm的固体平板中央,取10μL微粒子弹(包被质粒DNA 1.0μg)于DNA载片中央,无菌风吹干;将平板置于基因枪第二层进行轰击;轰击的藻细胞置于光照下培养24-48小时后,将藻细胞用500μL新鲜培养基洗下重新涂布于含有100μg·mL-1博莱霉素(Zeocin)的固体培养基上至长出单藻落;
(3)荧光显微镜观察,挑取单藻落于含有100μg·mL-1博莱霉素的新鲜液体培养基中培养7天后用Nikon E50i荧光显微镜观察藻细胞,同一个视野分别在可见光和蓝光下拍照。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的重组质粒构建提取的重组质粒应为一条主带,且为超螺旋的。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的基因枪转化轰击压力为1500psi。
实施例2:
(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;
(2)基因枪转化,将离心收获的藻细胞用新鲜培养基重新悬浮,取约5×107个藻细胞在轰击前1小时涂布于f/2直径约2-2.5cm的固体平板中央,取10μL微粒子弹(包被质粒DNA 1.0μg)于DNA载片中央,无菌风吹干;将平板置于基因枪第二层进行轰击;轰击的藻细胞置于光照下培养36小时后,将藻细胞用500μL新鲜培养基洗下重新涂布于含有100μg·mL-1博莱霉素(Zeocin)的固体培养基上至长出单藻落;
(3)荧光显微镜观察,挑取单藻落于含有100μg·mL-1博莱霉素的新鲜液体培养基中培养7天后用Nikon E50i荧光显微镜观察藻细胞,同一个视野分别在可见光和蓝光下拍照。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的重组质粒构建提取的重组质粒应为一条主带,且为超螺旋的。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的基因枪转化轰击压力为1500psi。
实施例3:
(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;
(2)基因枪转化,将离心收获的藻细胞用新鲜培养基重新悬浮,取约5×107个藻细胞在轰击前1小时涂布于f/2直径约2-2.5cm的固体平板中央,取10μL微粒子弹(包被质粒DNA 1.0μg)于DNA载片中央,无菌风吹干;将平板置于基因枪第二层进行轰击;轰击的藻细胞置于光照下培养48小时后,将藻细胞用500μL新鲜培养基洗下重新涂布于含有100μg·mL-1博莱霉素(Zeocin)的固体培养基上至长出单藻落;
(3)荧光显微镜观察,挑取单藻落于含有100μg·mL-1博莱霉素的新鲜液体培养基中培养7天后用Nikon E50i荧光显微镜观察藻细胞,同一个视野分别在可见光和蓝光下拍照。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的重组质粒构建提取的重组质粒应为一条主带,且为超螺旋的。
所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,所述的基因枪转化轰击压力为1500psi。
本领域的普通技术人员都会理解,在本发明的保护范围内,对于上述实施例进行修改,添加和替换都是可能的,其都没有超出本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,其特征在于包含如下步骤:
(1)GFP基因重组质粒构建,提取重组质粒进行三角褐指藻转化;
(2)基因枪转化,将离心收获的藻细胞用新鲜培养基重新悬浮,取约5×107个藻细胞在轰击前1小时涂布于f/2直径约2-2.5cm的固体平板中央,取10μL微粒子弹(包被质粒DNA 1.0μg)于DNA载片中央,无菌风吹干;将平板置于基因枪第二层进行轰击;轰击的藻细胞置于光照下培养24-48小时后,将藻细胞用500μL新鲜培养基洗下重新涂布于含有100μg·mL-1博莱霉素(Zeocin)的固体培养基上至长出单藻落;
(3)荧光显微镜观察,挑取单藻落于含有100μg·mL-1博莱霉素的新鲜液体培养基中培养7天后用Nikon E50i荧光显微镜观察藻细胞,同一个视野分别在可见光和蓝光下拍照。
2.根据权利要求1所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,其特征在于:所述的重组质粒构建提取的重组质粒应为一条主带,且为超螺旋的。
3.根据权利要求1所述的三角褐指藻遗传转化体系构建的检测方法,其特征在于:所述的基因枪转化轰击压力为1500psi。 
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