CN105624185B - 一种富油新绿藻的遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种富油新绿藻的遗传转化方法，包括如下步骤：S1.携带双元表达载体农杆菌准备；S2.富油新绿藻细胞的准备；S3.共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；S4.转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测。本发明对一种新的宿主富油新绿藻实现了转基因操作，对各步骤参数进行了优化限定，为富油新绿藻的基因工程操作开辟了道路。

Description

一种富油新绿藻的遗传转化方法

技术领域

本发明属于微藻基因工程技术领域，具体地，涉及一种富油新绿藻的遗传转化方法。

背景技术

富油新绿藻（Neochloris oleoabundans）是1962年从沙漠中分离得到的一株淡水藻，经鉴定为绿藻门，绿藻纲，绿球藻目，绿球藻科，新绿藻属（Neochloris)的一种单细胞真核绿藻。这种藻具有高产油脂能力，脂质含量可达到干重的17.5~54%，其中的三脂肪酰甘油酯占总脂质含量的80%，而且其脂肪酸组成中大多数是16~18碳的饱和或单不饱和脂肪酸。所以，很适合做生物柴油的资源。这种微藻的油酸含量很高，占总脂肪酸的35%左右。在国外，有人研究发现这种微藻具有很高的营养价值，并且用其作为贻贝等的水产动物的饵料。因此，富油新绿藻是一种很有价值的微藻藻种。

有关微藻油脂积累的机理是研究人员十分关注的问题，目前比较明确的是营养胁迫机制。一般，营养源缺乏又会导致微藻细胞生长不良，最终影响总的油脂产量不高。因此，研究人员开始关注是否有可以通过基因工程的手段来促进微藻的油脂合成，比如干预微藻细胞的代谢调节机制，促进细胞内油脂合成，还有人在寻找油脂合成相关基因表达的调节子，这些努力都涉及到微藻的基因工程问题。

富油新绿藻在被发现以后一直几乎没人关注，直到2008年李雁群等报道其产油机理后才开始得到逐渐广泛的关注。但是人们主要还是在形态学、培养技术、细胞采收、油脂提取等方面开展研究，还没有基因工程方面的报道。

微藻是门类繁多，差异巨大，生物学性质十分复杂的生物类群，是具有微小结构（单细胞结构）和光合作用能力的生物。目前，绿藻门微藻基因工程研究较多的是莱茵衣藻、小球藻和杜氏盐藻等，但是富油新绿藻却没有任何基因工程的报道。

在基因工程中，外源基因的遗传转化是一个关键步骤。目前，对于微藻常用的基因转入细胞的方法有农杆菌介导法、电击法、基因枪法、珠磨法、PEG介导法等技术。电击法、基因枪法、珠磨法是通过机械作用使质粒穿过藻细胞壁和细胞膜而进入细胞，这种方法目标DNA得到有效重组的概率较低，基因工程的整体成功率不高。PEG介导法在像富油新绿藻这类有细胞壁的绿藻中应用时，需要先将细胞制成原生质体，这种技术不仅和机械法一样有重组率低的问题，还有原生质体再生困难的问题。农杆菌介导法，是利用农杆菌的Ti质粒可以将一段DNA序列（T-DNA）重组到宿主细胞核DNA中的性质，通过将要表达的外源DNA序列重组到T-DNA序列中，然后将带有需要转化的外源DNA序列的质粒的农杆菌与微藻共培养从而使目标DNA序列转化到宿主细胞中。这种方法的优点是外源DNA重组的可靠性强。农杆菌介导的基因转化，在高等植物研究中被广泛采用。2004年Kumar首次利用农杆菌介导法在莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardti）转基因获得成功后，陆续有报道在雨生红球藻（Haematococcus Pluvialis），裂殖壶菌（Schizochytrium），杜氏盐藻（Dunaliella salina）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）上用农杆菌介导法获得成功。但是经发明人的前期研究发现，文献上现有的方法不适合富油新绿藻的遗传转化。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，通过农杆菌介导法有效转化外源基因于富油新绿藻中，提供了一种富油新绿藻的遗传转化方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的。

一种富油新绿藻的遗传转化方法，包括如下步骤：

S1. 携带双元表达载体农杆菌准备：将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌中，再将转化后的农杆菌涂布于培养平板上培养，挑选出成功转入了质粒的农杆菌，转移到固体培养基保存；

S2. 富油新绿藻（Neochloris oleoabundans）细胞的准备：培养富油新绿藻细胞到对数生长期，离心，得到藻细胞，用于共培养；

S3. 共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；

S4. 转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测；

其中，S1所述重组的pCAMBIA1301质粒包含Hsp70A-RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止子的表达盒和CaMV35s启动子+ hygromycin基因+ CaMV35s poly A终止子的表达盒。

所述质粒保存在大肠杆菌中，先培养大肠杆菌，提取质粒用于转化到农杆菌中。富油新绿藻获得了潮霉素抗性，说明潮霉素基因转化成功。对转化子进行PCR检测，可以进一步证明潮霉素基因已经转化成功。收集的转化子细胞还可以通过PCR检测证明GUS基因转化成功，通过GUS组织化学染色可以直观观察GUS基因转化成功并得到表达。

目前报道的农杆菌介导的转基因技术中，外源基因表达采用的启动子大多用CaMV35s启动子，本发明的实验发现用更适合绿藻的Hsp70A-RBCS2启动子更有利于在富油新绿藻中表达外源基因，可以获得更高的转化率。发明人发现，改变重组的pCAMBIA1301质粒将导致所述富油新绿藻的转化率降低。

并且，现有技术中通常采用在黑暗中共培养，或者采用周期光照共培养，经本发明的实验发现，采用连续光照可以得到更高的转化率和更短的培养周期。

本发明所述方法的关键点在于针对一种新的宿主富油新绿藻实现了转基因操作，对各步骤参数进行了优化限定，为富油新绿藻的基因工程操作开辟了道路。

优选地，S2所述培养富油新绿藻所用的培养基为改良SE培养基，培养基配方为：NaNO₃ 0.51-1.70g/L, K₂HPO₄·3H₂O 0.15g/L, MgSO₄∙7H₂O 0.15g/L, CaCl₂∙2H₂O 0.05g/L, KH₂PO₄ 0.35g/L, NaCl 0.05g/L, FeCl₃∙6H₂O 0.01g/L, H₃BO₃ 2.86mg/L, MnCl₂∙4H₂O1.81μg/L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄∙4H₂O 39μg/L, ZnSO₄∙7H₂O 220μg/L, CuSO₄∙5H₂O 79μg/L。改良SE培养基的特征在于比普通常用的SE培养基的营养更丰富，特别是氮源浓度大幅度增加。

目前报道的小球藻、杜氏盐藻和莱茵衣藻等绿球藻科的微藻在转基因操作时所采用的培养基是普通常用的培养基，本发明的实验发现用高氮源含量的营养加富的改良SE培养基用于过程中的微藻培养，更加适合富油新绿藻的转基因操作。

优选地，S2所述富油新绿藻在培养至细胞浓度达OD₆₀₀ 1.0~3.0的对数生长期时收集，再离心。

优选地，S3所述的农杆菌所用的液体培养基为含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素的YEB培养基，当所述农杆菌达到菌细胞浓度为OD₆₀₀ 0.5~1.0的对数生长期时，采用离心方法收获农杆菌细胞。

优选地，S1所述感受态农杆菌的制备方法为：将根癌农杆菌EHA105在28℃ 转速200rpm的条件下培养48小时，5000rpm离心5min，去上清后用10%甘油反复重悬和离心处理，最后通过离心回收菌体细胞并制得菌悬液，得到处于感受态的农杆菌。

优选地，S1所述将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌的条件为：200Ω,16000V电击。

优选地，S1所述平板上培养的条件为：将转化后的农杆菌在含有50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素的固体平板培养基上培养48h。

优选地，S2所述培养富油新绿藻细胞的条件为：通风量0.5-2vvm，通风中补充CO₂到浓度达到0.1-10%，2000-10000Lux连续光照培养，培养温度25～30℃。

优选地，S3所述的混合培养采用液体培养，培养基为在所述改良SE培养基的基础上添加0.5~2.0g/L NaHCO₃作为碳源，培养条件为在500~2000Lux的光照强度连续光照，25~30℃培养24-72小时

优选地，所述混合培养采用的农杆菌细胞、藻细胞为分别用含乙酰丁香酮100~300μg/mL和0.5~2.0g/L NaHCO₃的改良SE培养基制成菌悬液后再混合培养：所述农杆菌细胞制成OD₆₀₀ 0.5~1.0的农杆菌悬液，所述藻细胞悬液的浓度为1×10⁵~5×10⁵个/mL；然后按照农杆菌悬液与藻细胞悬液的体积比为1:5的比例，将农杆菌和藻细胞混合。

目前报道的几种绿球藻转基因的共培养方法中，都是采用在固体平板中共培养的方法，本发明的实验表明，采用液体共培养法相对于固体平板共培养可以获得更高的转化率。

优选地，S4所述的收集为：1000rpm离心5min，用含有500mg/mL头孢噻肟钠的改良SE培养基重悬沉淀的细胞，再次1000rpm 5min离心并回收细胞，重复3次，得到共培养后的藻细胞。

优选地，S4所述的筛选平板为在所述的改良SE培养基的基础上再添加10μg/mL潮霉素、0.5~2.0g/L NaHCO₃和1.5-2.0%琼脂制作的培养平板。

优选地，S4所述液体培养基为含头孢噻肟钠的改良SE培养基，制成细胞悬液的藻细胞浓度为1×10⁴个/mL。

优选地，S4所述的连续光照是在25-30℃，500-2000Lux连续光照培养的条件下进行的。

优选地，S2所述离心为1000rpm离心5min。

与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明构建带β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）基因（GUS）和潮霉素磷酸转移酶（hygromycin phosphotransferase）基因（HPT）的Ti质粒，通过含这种重组Ti质粒的农杆菌与富油新绿藻共培养，使GUS和HPT基因遗传转化到富油新绿藻细胞，然后再采用抗性筛选培养基筛选成功转基因的转化子，并通过GUS染色和PCR技术对转化子进行分析确认，从而建立了一种适合富油新绿藻的遗传转化方法。本发明对一种新的宿主富油新绿藻实现了转基因操作，对各步骤参数进行了优化限定，为富油新绿藻的基因工程操作开辟了道路。

附图说明

图1为富油新绿藻对潮霉素的敏感性；从左至右浓度依次为A：0；B：6μg/mL；C：8 μg/mL；D：10μg/mL；E：12 μg/mL。

图2为实施例1转化子在固体选择培养基长出单藻落。

图3为实施例1对转化子进行GUS染色结果；WT：野生型藻细胞染色脱色结果；1：转化子染色脱色结果；b：显微镜下转化子细胞染色结果；c：显微镜下野生型藻细胞染色结果。

图4为实施例1转化子GUS基因的PCR产物电泳结果图；WT：野生型对照；P：阳性对照；1~6：为阳性转化子。

图5为实施例1转化子hygromycin基因的PCR产物电泳结果图；WT：野生型对照；P：阳性对照；1~6：为阳性转化子。

图6为实施例1 RT-PCR产物电泳结果图；1：潮霉素基因检测片段扩增产物；3：GUS基因检测片段扩增产物；2和4：野生型对照；M：500DNAMaker。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1 液体培养基共培养法转化

选根癌农杆菌EHA105。培养基配方为（YEB培养基）：牛肉膏5g/L，酵母1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/100mL，pH=7.4，利福平50mg/mL。在28℃摇瓶培养至对数期（OD₆₀₀=0.5-1.0）。取50mL农杆菌菌液，28℃ 转速200rpm的条件下培养48小时，5000rpm离心5min，弃上清，加40mL 10%甘油重悬菌体，冰浴30min，再在4℃ 5000rpm条件离心5min，去上清，加入30mL 10%甘油重悬，继续在4℃5000rpm离心5min，弃上清后加入30mL 10%甘油重悬菌体，再次在4℃5000rpm离心5min，去上清后加2mL 10%甘油得菌悬液，从而制得电转化感受态的农杆菌。

取2μl pCAMBIA1301质粒（包含重组的Hsp70A-RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止子的表达盒和CaMV35s启动子+ hygromycin基因+ CaMV35s poly A终止子的表达盒）提取液于200μl感受态农杆菌细胞悬液中，混匀，冰浴30min，转入预冷的电转杯电击转化（电阻200欧姆，电压16000伏，电转杯厚度1mm），立即加入1mLYEB培养基，置于28℃150rpm摇床培养4-6h。吸取200μl经摇床培养的菌液涂布于含利福平50mg/mL和卡那霉素50mg/mL的固体平板中，在28℃培养箱培养48h，挑选生长的菌落，得到转入了质粒pCAMBIA1301的农杆菌，转移于斜面培养基保存。

富油新绿藻培养基为改良SE培养基，配方为：NaNO₃ 0.85g/L, K₂HPO₄·3H₂O 0.15g/L, MgSO₄·7H₂O 0.15 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.05 g/L, KH₂PO₄ 0.35 g/L, NaCl 0.05 g/L, H₃BO₃ 2.86 mg/L, MnCl₂·4H₂O 1.81 mg/L, ZnSO₄·7H₂O 0.22 mg/L, CuSO₄·5H₂O0.079 mg/L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.039 mg/L。接种富油新绿藻，用磁力搅拌器搅拌，通入二氧化碳和空气的混合气（CO₂含量约5%，v/v)，8000~10000Lux连续光照，温度28±2℃。收获对数期（OD=2.5左右）的富油新绿藻藻细胞，用于共培养。

将斜面培养基保存的转入pCAMBIA1301的农杆菌挑1-2环于含50mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素的YEB培养基中，在28℃，200rpm摇床培养过夜，细胞浓度OD₆₀₀达到0.5~1.0的对数生长期，5000rpm离心5min，收获农杆菌细胞，用于后续与富油新绿藻共培养。

用含乙酰丁香酮100~300μg/mL和0.5~2.0g/LNaHCO₃的改良SE培养基将预先培养好的富油新绿藻细胞制成1×10⁵个/mL的细胞悬液50mL；将培养好的转入了pCAMBIA1301的农杆菌的培养液中取10mL 5000rpm离心5min收获农杆菌细胞，将细胞加到上述50mL藻细胞悬液中使农杆菌细胞与藻细胞混合在培养基中，在光照强度为2000 Lux的28℃恒温摇床中150rpm培养48小时。1000rpm 5min离心，去上清，用含有500mg/mL头孢噻肟钠的改良SE培养基重悬沉淀的细胞，再次1000rpm 5min离心并回收细胞以实现对细胞的洗涤，共洗3次，得到共培养后的藻细胞。将得到的藻细胞用改良SE液体培养基制成1×10⁴个/mL的细胞悬液，取100μL藻细胞悬液涂布于筛选培养基（含10μg/mL潮霉素和0.5~2.0g/LNaHCO₃的改良SE培养基，此潮霉素浓度为能抑制野生种富油新绿藻生长的浓度。此浓度是通过对富油新绿藻对潮霉素敏感性研究所得的抑制浓度，如附图1所示）做成的固体培养平板上，同时再取100μL藻细胞悬液涂布于对照培养基（仅添加0.5~2.0g/LNaHCO₃不添加抗生素的改良SE培养基）做成的固体培养平板上，均在28℃ 2000 Lux连续光照培养20天(如附图2），平板上长出藻落，分别计数各平板上长出的藻落数。挑取筛选平板上长出的的藻落转移保存，并用改良SE培养基扩大培养，通过GUS染色和PCR分析，判断挑出来的藻落是否是阳性转化子，计算筛选平板上阳性转化子藻落的数量。由筛选平板上长出的阳性转化子的藻落数除以对照平板上长出的藻落数计算转化率。结果，转化率为12.3%。

GUS染色液的配方为：0.1 mol/L Na₃PO₄ (pH 7.0)， 0.5mmol/L K₃Fe (CN)₆，0.5mmol/L K₄Fe (CN) ₆ , 10mmol/L EDTA，0.5 mg/mL X-Gluc。染色方法为: 将藻细胞悬浮于染色液中，37℃染色过夜，用75%酒精脱色后，就可以在显微镜下通过肉眼直接观察到成功转入GUS基因并得到表达的绿藻细胞显蓝色，如附图3所示。

对转化子进行基因检测，提取转化子DNA：取200mg转化后藻细胞置于1.5mL的离心管，加600μlCTAB缓冲液，混匀，于65℃水浴保温1h,取出后加等体积PCI抽提液（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，v/v）,混匀，4℃ 12500rpm离心10min,将上清转移至新的离心管中，加入RNase至终浓度为1μg/mL，在37℃下放置30min，再用PCI抽提一次，离心4℃，12500rpm，离心10min，水相转移至新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，室温下放置8～12min，沉淀DNA，于4℃及12500rpm条件下离心20min，弃去上清液，用70%乙醇洗涤DNA，沉淀两次，晾干，将DNA溶解于20μlTE缓冲液中，得到转化后藻细胞的DNA。

由已知的GUS基因和潮霉素基因，设计检测引物：

GUS-F 5'-ACTGCTGCTGTCGGCTTTA-3'，

GUS-R 5'- GCACTTGCGGACGGGTAT-3'，

位置在1052-1259bp，长度为208bp；

HPT-F 5'- ATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

HPT-R 5'- ACTGGCAAACTGTGATGGAC-3'，

位置在329-542bp，长度为 214bp。

以提取的转化后藻细胞的DNA为模板进行PCR扩增，用Takara PCRMix，体系为20μl，反应程序为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃30s，终延伸72℃10min，循环数为30。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到图4和图5的结果，说明2个外源基因转化成功。

提取转化子RNA，先采用液氮研磨，然后提取RNA，所用试剂盒为东盛通用RNA提取试剂盒。用Taraka反转录试剂盒进行反转录，以cDNA为模板，上述GUS基因和hygromycin基因引物，进行PCR扩增，扩增结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图6，说明2个外源基因得到表达。

对比例1 固体培养基共培养法转化

本对比例与实施例1所述的富油新绿藻遗传转化的方法大体相同，不同之处在于，共培养采用改良SE培养基的固体平板。

具体为，SE固体培养基为在液体的改良SE培养基的基础上加入1.5%琼脂粉，并加入NaHCO₃作为碳源。富油新绿藻藻细胞的获得与实例1相同，即用改良的SE液体培养基，用磁力搅拌器搅拌，通入二氧化碳和空气的混合气（CO₂含量约5%，v/v)，8000-10000Lux连续光照，温度28±2℃,培养至对数期（OD=2.5左右），吸取200μl富油新绿藻藻悬液，涂布于含0.5~2.0g/LNaHCO₃的改良SE固体培养上，在温度为28℃的光照培养箱中预培养48h～72h，待藻落长至草坪状。将培养至对数期的转入了pCAMBIA1301的农杆菌菌液吸取200μl，均匀涂布于藻细胞上，在28℃，光照条件下，进行共培养48h。

从固体平板上刮取与农杆菌共培养了48h的藻细胞，用含有500mg/mL头孢噻肟钠的改良SE培养基冲洗，离心收取藻细胞，用少量培养基制得藻细胞悬液，分别将藻悬液均匀涂布于选择培养基平板和对照培养基平板上。选择培养基和对照培养基与实例1相同。将涂布了藻悬液的固体平板置于28℃培养箱中在2000Lux的连续光照下培养。

20天后，在培养基平板上长出藻落，长出的藻落按照实例1的方法分析检测阳性转化藻落，计算转化率为4.5%。

对比例2

本对比例与实施例1所述的富油新绿藻遗传转化的方法大体相同，不同之处在于重组在pCAMBIA1301质粒上的表达盒的启动子不同，即重组的pCAMBIA1301质粒不同。

具体为，在实例1中pCAMBIA1301质粒上构建的GUS基因的表达盒启动子是Hsp70A-RBCS2启动子，终止子是RBCS2，本对比例中pCAMBIA1301质粒上GUS基因的表达盒是用CaMV35s启动子和Nos polyA终止子的表达盒。潮霉素抗性基因的表达盒还是CaMV35s启动子+ hygromycin基因+ CaMV35s poly A终止子的表达盒。

转基因程序和培养及筛选方法和条件与实例1相同，结果转化率为9.8%。

对比例3

本对比例与实施例1所述的富油新绿藻遗传转化的方法大体相同，不同之处在于所采用的培养基不是用改良SE培养基。

具体为，本实例采用的培养基是常规使用的SE培养基，培养基配方为：NaNO₃0.25g/L, K₂HPO₄·3H₂O 0.075 g/L, MgSO₄·7H₂O 0.075 g/L, CaCl₂·2H₂O 0.025 g/L,KH₂PO₄ 0.175 g/L, NaCl 0.025 g/L, H₃BO₃ 2.86 mg/L, MnCl₂·4H₂O 1.81 mg/L,ZnSO₄·7H₂O 0.22 mg/L, CuSO₄·5H₂O 0.079 mg/L, (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.039 mg/L。

转基因程序和培养及筛选方法和条件与实例1相同，结果在转化子筛选过程中培养20天，在筛选培养基平板上没有藻落长出，说明该培养基不适合转基因富油新绿藻筛选培养。

对比例4

本对比例与实施例1所述的富油新绿藻遗传转化的方法大体相同，不同之处在于在共培养转化时是采用黑暗条件下培养的。

具体为，藻细胞的准备和转双元载体的农杆菌的准备与实例1相同，用含乙酰丁香酮100~300μg/mL和0.5~2.0g/LNaHCO₃的改良SE培养基将预先培养好的富油新绿藻细胞制成1×10⁵个/mL的细胞悬液50mL；取培养好的转入了pCAMBIA1301的农杆菌的培养液10mL在5000rpm离心5min收获农杆菌细胞，将细胞加到上述50mL藻细胞悬液中使农杆菌细胞与藻细胞混合在培养基中，在28℃恒温摇床中150rpm黑暗条件培养48小时。然后，1000rpm 5min离心，去上清，用含有500mg/mL头孢噻肟钠的改良SE培养基重悬沉淀的细胞，再次1000rpm5min离心并回收细胞以实现对细胞的洗涤，共洗3次，得到共培养后的藻细胞。后续的转化子筛选和基因检测与实施例1相同，结果转化率只有1.6%。

Claims (1)

1.一种富油新绿藻的遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.携带双元表达载体农杆菌准备：将重组的pCAMBIA1301质粒转入感受态农杆菌中，再将转化后的农杆菌涂布于培养平板上培养，挑选出成功转入了质粒的农杆菌，转移到固体培养基保存；

S2.富油新绿藻(Neochloris oleoabundans)细胞的准备：培养富油新绿藻细胞到对数生长期，离心，得到藻细胞，用于共培养；

S3.共培养：将S1保存的农杆菌转移到液体培养基中培养到对数生长期，将得到的农杆菌细胞与S2得到的藻细胞混合培养；

S4.转化子筛选：收集S3共培养后的细胞，再用液体培养基将藻细胞制成细胞悬液，涂布于含潮霉素的筛选平板上，连续光照培养直到长出藻落，计数平板上长出的藻落数，挑取长出的藻落转移保存、检测；

其中，S1所述重组的pCAMBIA1301质粒包含Hsp70A-RBCS2启动子+GUS基因+RBCS2终止子的表达盒和CaMV35s启动子+hygromycin基因+CaMV35s poly A终止子的表达盒；S2所述培养富油新绿藻所用的培养基为改良SE培养基，培养基配方为：NaNO₃ 0.85g/L,K₂HPO₄·3H₂O 0.15g/L,MgSO₄·7H₂O 0.15g/L,CaCl₂·2H₂O 0.05g/L,KH₂PO₄ 0.35g/L,NaCl 0.05g/L,FeCl₃·6H₂O 0.01g/L,H₃BO₃ 2.86mg/L,MnCl₂·4H₂O 1.81μg/L,(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 39μg/L，ZnSO₄·7H₂O 220μg/L，CuSO₄·5H₂O 79μg/L；

S3所述的混合培养采用液体培养，培养基为改良SE培养基再添加0.5～2.0g/L NaHCO₃作为碳源，培养条件为在500～2000Lux的光照强度连续光照，25～30℃培养24-72小时；

S4所述的筛选平板为改良SE培养基再添加10μg/mL潮霉素、0.5～2.0g/L NaHCO₃和1.5-2.0％琼脂制作的培养平板。

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