CN102485898A

CN102485898A - 微生物发酵生产脂质的方法

Info

Publication number: CN102485898A
Application number: CN2010105699832A
Authority: CN
Inventors: 常桂芳; 田桂尾; 戴小军; 吴清杭
Original assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Current assignee: Wilmar Shanghai Biotechnology Research and Development Center Co Ltd
Priority date: 2010-12-02
Filing date: 2010-12-02
Publication date: 2012-06-06

Abstract

本发明涉及微生物发酵生产脂质的方法。具体而言，本发明涉及培养生产脂质的微生物的方法以及生产脂质的方法，所述脂质为含多不饱和脂肪酸的脂质。本发明的方法包括在发酵的特定时期保持低溶氧水平，且同时保持低碳源浓度水平。

Description

微生物发酵生产脂质的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵生产脂质领域。具体而言，本发明涉及培养产脂质微生物以生产脂质的方法。

背景技术

一些微生物能够生产多不饱和脂肪酸脂肪酸(PUFA)，例如一些含多不饱和脂肪酸(PUFA)多酮合成酶系统(PKS)的微生物，诸如真核Stramenopiles界Heterokonta门Labytinthulida纲破囊壶菌目破囊壶菌科的Schizochytrium sp.菌产DHA和ω-6 DPA及同属的Ulkenia菌产DHA；细菌变形菌门γ-proteobacteria纲交替单胞菌目希万氏菌科Shewanella sp.产EPA及同目的Moritellaceae科Moritella marina产DHA；细菌变形菌门γ-proteobacteria纲弧菌目弧菌科的Photobacterium profundum产EPA或其他符合专利WO2005/098033(中国专利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特异的氨基酸序列LGISAIKRVEIL的微生物。

DHA的普遍商业来源是深海鱼油和海洋微藻。其中利用发酵技术异养培养海洋微藻具有很好的商业前景。在众多的海洋微藻中，Schizochytrium sp.的发酵特性和菌油脂质组成比较突出。

目前的科学研究已经证实Schizochytrium发酵生成DHA和ω-6 DPA是PUFA PKS系统作用的结果。该系统区别于动植物和多数微生物中PUFA生成路径。PUFA PKS系统在PUFA碳链延长的过程中，并不全部还原中间产物多烯酰ACP，而是通过2-反式3-顺式异构酶保留一些不饱和双键，因而PUFA积累过程中对氧的依赖比传统PUFA合成系统小。Schizochytrium PUFA PKS的菌株，可在极低溶氧(小于5％)条件下大量生成DHA和ω-6 DPA。

ZL 01806451.5公开了通过在发酵罐中高密度培养真核微生物来增加含有多烯脂肪酸的脂质的产生的方法。该专利实施例2说明摇瓶培养基中低溶氧水平对最终产物DHA的影响：结论是随着溶氧水平的降低，产物DHA随之相应提高，从而可在发酵后期实施低溶氧以获得更高的DHA产量。

然而，本领域仍需要新的发酵方法，以在低溶氧条件下促使PUFA PKS系统合成更多的PUFA。

发明内容

本发明人的研究发现，生产脂质的微生物必须在低溶氧条件下、在特定碳源浓度范围(碳源浓度≤15g/L)的前提下。当发酵培养基中碳源浓度超出该范围，这时实施低氧则无法显著提高DHA产量。

本申请第一方面提供一种培养生产脂质的微生物的方法，所述的脂质为含有多不饱和脂肪酸的脂质，所述方法包括：

在培养的微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于15g/L。

在一具体实施例中，所述的微生物为含有多不饱和脂肪酸的多酮合成酶系统、且可以利用该系统来生产脂质的微生物。

在一具体实施例中，所述微生物选自破囊壶菌目、交替单胞菌目和弧菌目。

在一具体实施例中，所述微生物选自破囊壶菌科、希万氏菌科、Moritellaceae科和弧菌科。

在一具体实施例中，所述的多不饱和脂肪酸选自ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。

在一具体实施例中，所述的ω-3多不饱和脂肪酸选自DHA、DPA和EPA。

在一具体实施例中，在培养的微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

在一具体实施例中，在培养的微生物的生物量干重达到90g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

本申请第二方面提供一种生产脂质的方法，所述方法包括：

(1)在适宜产脂质微生物生长的条件下培养该产脂质微生物；和

(2)在培养的产脂质微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于15g/L；

从而进行脂质生产。

在一具体实施例中，在培养的微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为等于或低于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

在一具体实施例中，在培养的微生物的生物量干重达到90g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为等于或低于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

在一具体实施例中，所述脂质是含有多不饱和脂肪酸的脂质。

在其它实施例中，所述的ω-3多不饱和脂肪酸选自DHA、DPA和EPA。

本发明的实施对实际生产中提高DHA产量将有重要的商业意义。按照本发明，在发酵罐上发酵培养含PUFA PKS菌株时，罐内残糖浓度只有保持在≤15g/L，同时在发酵后期实施低溶氧，可有效提高DHA产量。

具体实施方式

本发明的产脂质微生物包括但不限于：

(1)破囊壶菌目微生物，优选破囊壶菌科的微生物，更优选裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)(产DHA和ω-6 DPA)和吾肯氏壶菌Ulkenia(产DHA)；

(2)交替单胞菌目微生物，优选希万氏菌科和Moritellaceae科，更优选Shewanella sp.(产EPA)及Moritella marina(产DHA)；

(3)弧菌目微生物，优选弧菌科，更优选Photobacterium profundum(产EPA)；和

(4)其他符合专利WO2005/098033(中国专利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特异的氨基酸序列LGISAIKRVEIL的微生物。

在一优选实施例中，所述产脂质微生物是含PUFA PKS的微生物。

在一优选实施例中，所述产脂质微生物选自Schizochytrium sp.、Shewanella sp.、Moritella marina、Photobacterium profundum及具有专利WO2005/098033(中国专利200580018877)所描述的具有PUFA PKS特异的氨基酸序列LGISAIKRVEIL的微生物。

在更优选的实施例中，用于实施本发明方法的微生物是Schizochytriumsp.菌。

在其它实施例中，用于实施本发明方法的微生物是Ulkenia菌。

本申请的方法用于生产脂质。“脂质”在本文中指含有多不饱和脂肪酸的脂质。多不饱和脂肪酸(PUFA)指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。多不饱和脂肪酸通常分为ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。在多不饱和脂肪酸分子中，距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为ω-3多不饱和脂肪酸；在第六个碳原子上的，则称为ω-6多不饱和脂肪酸。ω-3不饱和脂肪酸中对人体最重要的两种不饱和脂肪酸是DHA和EPA。EPA是二十碳五烯酸的英文缩写，DHA是二十二碳六烯酸的英文缩写。

因此，在一个具体实施例中，本发明涉及生产多不饱和脂肪酸的方法，更进一步地，本发明涉及生产ω-3多不饱和脂肪酸的方法，更优选地，本发明涉及DHA和/或EPA的生产方法。所述方法包括在适宜产脂质微生物生长的条件下培养所述产脂质微生物，以及在培养的产脂质微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为等于或低于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于15g/L。

本发明产脂质微生物的培养可大致分为两个阶段。第一阶段是提高微生物生物量密度的阶段。第二阶段是脂质快速、大量积累阶段(生产阶段)。

在生物量密度的提高阶段，发酵过程的主要目的是提高发酵培养基中的生物量密度以得到所需的生物量密度。可采用本领域周知的技术来培养产脂质微生物，以提高微生物生物量密度。例如，可采用ZL 01806451.5所公开的方法实施第一阶段的培养。因此，本申请所述的“适宜产脂质微生物生长的条件”包括ZL 01806451.5所公开的方法以及现有技术已知的其它各种培养产脂质微生物的方法。应理解，不同的产脂质微生物的培养条件可能有些差异，但这些都是本领域技术人员所掌握的技术知识范围之内。

本发明的碳源优选碳水化合物，包括但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。但是典型地，碳水化合物，优选葡萄糖用作主要的碳源。脂肪酸，羟基形式的脂肪酸，三酸甘油酯，和双-和单-酸甘油酯也可用作碳源。本发明的碳源可以选择醇碳源。所述的醇碳源是指能够作为碳源用于本发明的微生物生产脂质方法的醇，例如甲醇，乙醇，异丙醇和甘油，但是为了本发明的目的，所述醇碳源不包括羟基有机酸如乳酸和类似的化合物。

本发明优选的氮源是酵母提取物，尿素，硝酸盐，亚硝酸盐，大豆蛋白，氨基酸，蛋白质，玉米浆，动物性副产物，无机铵盐。其它营养源包括磷酸盐，维生素(如维生素B12，硫胺素)，痕量金属(如锌，铜，钴，镍，铁，锰，钼)，主要金属(如镁，钙，钠，钾)。痕量金属源和主要金属源选自这些金属的硫酸盐或氯化物(例如MgSO₄·7H₂O；MnCl₂·4H₂O；ZnSO₄·7H₂O；CoCl₂·6H₂O；Na₂MoO₄·2H₂O；CuSO₄·5H₂O；NiSO₄·6H₂O；FeSO₄·7H₂O；CaCl₂；K₂SO₄；KCl；和Na₂SO₄)。

通常，培养的微生物的生物量干重达到至少85g/L时，可进行第二阶段的培养。本申请中，通过离心收集的菌体，去离子水洗涤两次后干燥至恒重、称重，即可计算得到相应的生物量干重，以g/L发酵液计。

在一个优选实施方式中，当生物量干重达到90g/L时，开始进行第二阶段的培养。在其它优选实施方式中，当生物量干重达到90-120g/L时，开始进行第二阶段的培养。

在此阶段，微生物利用底物的主要用途不是提高生物量密度，而是利用该底物生产脂质。应理解地是在生物量密度提高阶段微生物也产生脂质；但是，如上所述，在生物量密度提高阶段的主要目的是提高生物量密度。

可通过控制发酵罐顶部空间中的氧量来控制发酵培养基中的溶氧量，或优选通过控制发酵培养基的摇动(或搅拌)速度来控制。在发酵开始时，使用高的搅拌速度和通气量，使DO值接近饱和，在生物量提高阶段，发酵罐中的溶氧控制在至少10％。到在生产阶段，需要在控制发酵培养基中的溶氧浓度≤3.0％的同时，控制发酵培养基中的碳源浓度≤15g/L发酵液。生产阶段的碳源与第一阶段的碳源可以相同，可来自各种碳水化合物，包括，但不限于果糖，葡萄糖，蔗糖，糖蜜，和淀粉。当使用这些碳水化合物作为碳源时，“碳源浓度”通常也称为“残糖浓度”。

可采用本领域周知的技术来控制碳源浓度，通过监控残碳浓度(实时或阶段性监控碳源浓度)，并根据监控到的碳源浓度对补充碳源的流加速度进行调整，从而控制发酵罐中碳源的浓度。

在优选的实施例中，生产阶段的碳源浓度较佳控制在≤10g/L的水平。在其它优选的实施例中，生产阶段的碳源浓度较佳控制在5～10g/L的水平。

本发明在5L发酵罐的应用实验，低残糖低氧调控下，DHA的产率可以达到5.98g/L每天，5.32g/L每天以及5.57g/L每天，高于高残糖低溶氧的4.44g/L每天，4.06g/L每天以及4.44g/L每天。显然控制低残糖的条件下，进行低溶氧调控，DHA的产率更高。

脂质的提取和分析方法是本领域周知的。例如，可按照国标GBT22223-2008的方法进行破壁、脂质提取和脂肪酸组分检测。

本申请也包括采用本申请方法获得的脂质，其中，与采用其它方法相比，采用本发明方法对促进脂质中DHA含量效果更好。

下文将以具体实施例对本发明进行详细的阐述。应理解，本申请并不限于这些具体的实施例。

实施例1

利用摇瓶培养，分析溶氧和非醇碳源葡萄糖的浓度水平对裂壶藻藻油中DHA含量及DHA产量的影响。培养步骤如下：

(1)将保藏于超低温冰箱中的甘油管菌种划线接种到斜面培养活化，活化培养基为：葡萄糖5g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉1g/L，琼脂粉18g/L，海盐30g/L。28℃培养40小时。

(2)挑活化后的单菌落，接种到种子液培养基(配方见表1)中，液装量50ml/250ml三角瓶，28℃、200rpm下摇床培养48小时。种子液浓度约干重15-20g/L。

表1 种子培养基配方(g/L)

项目	含量	项目	含量	项目	含量
						葡萄糖	50	酵母粉	20	硫酸铵	1
磷酸二氢钾	1	硫酸钠	12	硫酸镁	5
						硫酸钾	5	氯化钾	1	氯化钙	0.02
氯化锰	0.0052	硫酸锌	0.0052	硫酸铜	0.0008
						钼酸钠	0.000016	硫酸镍	0.0008	硫酸亚铁	0.01
氯化钴	0.000066	硫胺素	0.00076	维生素B12	0.0012
						泛酸钙	0.0256	pH(氢氧化钾)	6.5-7.5	灭菌	121℃×20分钟

(3)按10％的接种量，接种种子液到不同的发酵培养基中。发酵培养基组成如下表2所示，酵母粉为氮源，在C/N比为5的前提下，使用不同浓度的葡萄糖作为碳源。培养基分别按50ml和200ml每250ml三角瓶的形式分装，以创造出高溶氧(DO 31％)和低溶氧(DO 3％)的培养条件。

表2 发酵培养基配方(g/L)

(4)上述培养瓶在28℃、200rpm下摇床培养48小时。离心收集菌体，60℃干燥至恒重，磨碎。按照国标GBT22223-2008的方法进行破壁、脂质提取和脂肪酸组分检测。检测结果见表3。

表3 溶氧和糖浓度对DHA产率和藻油中DHA含量的影响

从上表可以看出，低溶氧发酵下，10g/L的起始葡萄糖所得藻油中DHA的含量最高，而且DHA的产率也最高。起始葡萄糖浓度≤10g/L时，DHA的产率和DHA在藻油中的比率两个属性均高于葡萄糖浓度≥10g/L的发酵。从上述实验可以看出，要使DHA的产率提高，除了提高藻体的发酵生物量，还必须控制发酵液残糖浓度的基础上实施低氧调控。

实施例2

利用5L发酵罐进行应用实验。实施步骤如下：

(1)、(2)实施例1中的(1)、(2)。

(3)按5％-10％的接种量转接种子液到基础发酵培养基中(表4)。

表4发酵罐基础培养基(g/L)

项目	含量	项目	含量	项目	含量
						葡萄糖	25	酵母粉	4	硫酸铵	1
磷酸二氢钾	1	硫酸钠	6	硫酸镁	3
						硫酸钾	3.5	氯化钾	1	氯化钙	0.05
氯化锰	0.0052	硫酸锌	0.0052	硫酸铜	0.0008
						钼酸钠	0.000016	硫酸镍	0.0008	硫酸亚铁	0.01
氯化钴	0.000066	硫胺素	0.00076	维生素B12	0.0012
						泛酸钙	0.0256	pH(氢氧化钾)	6.5-7.5	灭菌	121℃×20分钟

(4)对几个批次的发酵进行如下调控，发酵结果见表5所示。

①通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度在＜10g/L并控制发酵罐溶氧值约0.3％。

②通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度在＞10g/L(50g/L)并控制发酵罐溶氧值约0.5％。

③通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度在＞10g/L(20g/L)并控制发酵罐溶氧值保持在30％。

表5 发酵过程溶氧和残糖控制与发酵结果

Time：发酵时刻；RCS：发酵液中残糖的浓度；DO：发酵液的溶氧值；DCW：发酵液中干细胞量；TFA(％DCW)：干细胞中油脂的含量；DHA(％TFA)：油脂中DHA的含量；DHA(g/L)：DHA产率。

从实验结果可以看出，进行低氧调控的发酵，DHA的产率为17.93g/L及13.32g/L，高于不进行低氧调控的发酵(11.08g/L)。在进行低氧控制的发酵中，低残糖发酵获得的DHA产率高于高残糖发酵的结果。

实施例3

利用5L发酵罐进行应用实验，实施步聚如下：

(1)、(2)、(3)同实施2的(1)、(2)、(3)步。

(4)对个批次发酵进行如下调控，发酵结果见表6所示。

①通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度＜10g/L并控制发酵罐溶氧值＞1％(2％)。

②通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度在约10g/L并控制发酵罐溶氧值＞1％(10％)。

表6 发酵过程溶氧和残糖控制与发酵结果

Time(h)	DO(％)	DCW(g/L)	TFA(％DCW)	DHA(％TFA)	DHA(g/L)
						72	≈2	108.2	50.37	28.78	15.69
72	≈10	112.39	47.28	22.91	12.17

从实验结果可以看出，发酵第二阶段进行低氧控制时，低残糖发酵所得DHA产率高于高残糖发酵的结果。

实施例4

利用5L发酵罐进行应用实验，实施步骤如下：

(1)、(2)、(3)同实施2的(1)、(2)、(3)步。

(4)通过对各批次发酵进行如下调控，发酵结果见表7所示：

①通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖浓度＜10g/L并控制发酵罐溶氧值约1％。

②通过通气量及搅拌速度控制，使溶氧保持在大约30％，26-30℃下发酵至藻体生物量干重达到90-120g/L。然后进入发酵第二阶段，控制流加，保持残糖＞10g/L(20g/L)并控制发酵罐溶氧值约1％。

表7 发酵过程溶氧和残糖控制与发酵结果

Time(h)	DO(％)	DCW(g/L)	TFA(％DCW)	DHA(％TFA)	DHA(g/L)
						72	从≈20变为≈1	108.89	49.79	30.80	16.70
72	从≈20变为≈1	95.46	49.86	27.97	13.31

从实验结果可以看出，发酵第二阶段进行低氧控制时，低残糖发酵所得DHA的产率和菌油中DHA的含量属性均高于高残糖发酵的结果。此外，进行低氧发酵的情况下，糖浓度的增加既不能增加生物量也未能增加DHA产率。

综合几个实施应用例的数据看，同样在低残糖低溶氧调控下，DHA的产率情况也不同(表8)。在同样保持残糖浓度＜10g/L的情况下，溶氧由0.3％到2％的几个应用例中，DHA的产率逐步下降(17.93g/L、16.70g/L到15.69g/L)。因此，在保持低残糖的前体下，溶氧水平可以尽量低。

表8 发酵过程溶氧和残糖控制与发酵结果

Time(h)	DO(％)	DCW(g/L)	TFA(％DCW)	DHA(％TFA)	DHA(g/L)
						72	从≈30变为≈0.3	139.54	52.84	24.32	17.93
72	从≈20变为≈1	108.89	49.79	30.80	16.70
						72	从≈25变为≈2	108.2	50.37	28.78	15.69

以上已以具体实施方式的形式对本发明进行了阐述。应理解，上述实施例仅仅是阐述性的。在不偏离本申请精神的情况下，可对本发明做出各种变动，这些变动都在本发明的范围之内。

Claims

1.一种培养生产脂质的微生物的方法，所述的脂质为含有多不饱和脂肪酸的脂质，所述方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物为含有多不饱和脂肪酸的多酮合成酶系统、且可以利用该系统来生产脂质的微生物。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述微生物选自破囊壶菌目、交替单胞菌目和弧菌目。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多不饱和脂肪酸选自ω-3和ω-6多不饱和脂肪酸。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的ω-3多不饱和脂肪酸选自DHA、DPA和EPA。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在培养的微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在培养的微生物的生物量干重达到90g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为低于或等于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

8.一种生产脂质的方法，其特征在于，所述方法包括：

从而进行脂质生产。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在培养的微生物的生物量干重达到85g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为等于或低于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，在培养的微生物的生物量干重达到90g/L或以上之后，使发酵培养基中的溶氧水平维持为等于或低于3％，同时使发酵培养基中的碳源浓度维持为低于或等于10g/L。