CN114686534A - 一种磷脂型dha的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种磷脂型DHA的制备方法，所述制备方法采用裂殖壶菌发酵，在所述裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期至发酵结束期间，控制发酵液中碳源碳浓度为0.10‑0.36％，并控制碳氮比为2:1‑4:1。本发明提供的制备方法通过在裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期开始直至发酵结束，有限制地进行补充碳源和氮源，即控制碳氮比为2:1‑4:1，既能提供裂殖壶菌生长的基本能量，又能使得磷脂型油脂合成迅速累积，从而获得富含磷脂型DHA的油脂制品。

Description

一种磷脂型DHA的制备方法
技术领域
本发明涉及药品保健品领域，尤其涉及一种磷脂型DHA的制备方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸的存在形式主要分为甘油三酯型、乙酯型和磷脂型。有证据表明，磷脂型多不饱和脂肪酸在人体内吸收方式为主动吸收，吸收率高于甘油三酯型多不饱和脂肪酸，并远高于乙酯型多不饱和脂肪酸。
二十二碳六烯酸(DHA)是一种重要的omega-3长链多不饱和脂肪酸，是大脑和视网膜组织中细胞膜的组成成分，具有增强视力、促进脑细胞发育及预防高血压、动脉硬化、心血管疾病等生理功效。因此，提供磷脂型DHA以满足人们机体所需具有重要意义。
天然的磷脂型DHA主要来源于鸡蛋卵黄和南极磷虾油的富集，但这两种原料来源不稳定，提取较为麻烦，其补充方式单一。因此，目前采用较多的是通过真菌发酵制得磷脂型DHA。常规的发酵法又分两种：一种是直接提取微生物油脂中的磷脂型DHA，另一种是采用酯交换的方式。其中，直接提取微生物油脂中的磷脂型DHA自然是更简便的选择，但是目前的发酵工艺中，都是以生产甘油三酯型DHA为目的，造成磷脂型DHA含量非常少，难以大量收集。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种磷脂型DHA的制备方法，通过对裂殖壶菌发酵的过程控制，使得磷脂型油脂合成迅速累积，从而获得富含磷脂型DHA的油脂。
本发明提供一种磷脂型DHA的制备方法，采用裂殖壶菌发酵，在所述裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期至发酵结束期间，控制发酵液中碳源碳浓度为0.10-0.36％，并控制碳氮比为2:1-4:1。
在裂殖壶菌发酵中，由于裂殖壶菌代谢途径等因素的影响，会使得代谢产物整体往甘油三酯型产物积累的方向进行，从而使得油脂中磷脂型油脂随着发酵时间的延长逐渐降低。基于此，传统的发酵工艺中会根据碳源的消耗速度补加碳源，但这对提高磷脂型DHA的生成基本没帮助。后来又有研究者提出，索性在发酵结束得到富含甘油酯型DHA的菌体细胞后，再以此为基础二次添加营养物质进行发酵来提高磷脂型DHA的比例。但是，这样对磷脂型DHA的产量提高有限，而且在实际工业发酵生产中，延长发酵周期会降低细胞活力，过多的补料操作也会增加染菌风险。
本发明研究发现，通过在裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期开始直至发酵结束，有限制地进行补充碳源和氮源，即控制碳氮比为2:1-4:1，既能提供裂殖壶菌生长的基本能量，又能使得磷脂型油脂合成迅速累积，并且抑制磷脂型油脂的消耗，从而获得富含磷脂型DHA的油脂制品。
需要注意的是，本发明所述碳氮比为有机物中碳的总含量与氮的总含量的比值。本发明中所述菌体进入对数生长期的标志为初始培养基中的碳源量接近0，一般在发酵2-5h后。
具体地，所述裂殖壶菌发酵过程中，在菌体进入对数生长期后，根据发酵液中的残余碳源碳浓度，采用连续补料的方式补加碳源使碳源碳浓度为0.10-0.36％，然后按照所述碳氮比进行氮源的补充。
优选地，所述碳源为葡萄糖、甘油或其酯、糖蜜中的一种或多种；所述补充的氮源为氨水、氨基酸或其盐、磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素中的一种或多种。其中氨基酸包括谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸或丙氨酸。
更优选地，所述补充的氮源中包含至少0.05g/L(以发酵液体积计)的脯氨酸和/或至少0.03g/L(以发酵液体积计)的谷氨酸或其盐。
进一步地，从菌体进入对数生长期至发酵结束期间，还向发酵液中补加植物油。
所述植物油可以为葵花籽油、玉米油、菜籽油等等。本发明控制碳氮比的同时还向发酵液中补加植物油，可以参与三羧酸循环，抑制糖酵解途径，提供菌体生长所需要的能量，进一步减少因能量不足导致的已经合成的磷脂的消耗，提高油脂中磷脂型DHA油脂总量。
优选地，所述植物油的补加速度根据其消耗速度变化，控制所述植物油在发酵液中的残留量为1-2.5g/L，补加方式为连续流加。
其中，植物油的残留量通过检测发酵液离心后上清液中植物油浓度获得，最优为1g/L。
进一步地，所述裂殖壶菌发酵的周期为45-60h。
传统的裂殖壶菌发酵一般发酵周期在90h左右，本发明由于对发酵过程进行了调控，可以在保证磷脂型DHA含量较高的情况下将发酵周期直接缩短至1/2-2/3，进一步减少磷脂型油脂在发酵后期的损失，并避免了发酵时间过长导致的细胞活力降低等问题。
进一步地，根据所需产品的不同所述制备方法还包括：待所述裂殖壶菌发酵结束后，干燥发酵液获得干菌体，或者，将发酵液进行酶解破壁和离心，收集上层，获得富含磷脂型DHA的油脂。
上述酶解破壁和离心步骤均可在现有技术中找到参考，具体地，可通过如下步骤获得富含磷脂型DHA的油脂：
发酵完毕后，将发酵液放罐至酶解罐，加入氢氧化钠调节pH至7-8.5，加入0.1％的酶进行酶解，通过取样观察细胞的破壁情况确定酶解是否完成；
酶解完成后将完全破壁的酶解液放料至离心机进行过滤，离心上层为DHA毛油、中层为高温废水、下层为DHA菌粕，收集上层产出的DHA毛油入库，获得富含磷脂型DHA的油脂。
在本发明的优选实施方式中，所述磷脂型DHA的制备方法具体包括以下步骤：
(1)种子液制备：将裂殖壶菌种子经过摇瓶多级培养制备一级种子罐的种子液；
(2)种子液扩大培养：将制备的种子液通过二级培养的方式进行种子液扩培，种子罐的装液量为罐体积的50％左右，培养温度为28-30℃，在适宜的通气及搅拌的培养条件下，通常培养2-3天；
(3)发酵罐培养：将扩大培养的种子液按照16-20％的接种量通过消毒后的移种站移种至发酵罐中，培养温度28-30℃，在适宜的通气及搅拌条件下进行发酵，待菌体进入对数生长期，根据消耗速度补充碳氮源，使得发酵液中碳源碳浓度为0.10-0.36％，碳氮比为2:1-4:1，并同时补充植物油，控制植物油残留量在1-2g/L，直至发酵结束，发酵周期为45-60h。
步骤(3)中的初始培养基：碳源2-10％，氮源4-13％，主要金属盐0.1-5％，0.001-0.3％金属离子，0.1-0.3％微量元素，0.4-1％磷酸盐。其中各组分的百分比为质量体积比。
本发明发现，将培养基中磷酸盐的添加量控制在0.4-1％，高于常规添加量，更有利于磷脂型DHA含量的提高。
其中：碳源可以是葡萄糖、甘油、糖蜜中的一种或几种。
天然氮源为酵母浸膏、玉米浆干粉、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白、黄豆饼粉中的一种或多种，优选为酵母浸膏。
无机氮源为谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸中的一种或多种，优选为谷氨酸。
磷酸盐可以为磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等磷酸盐。
主要金属盐选自这些金属的硫酸盐或氯化物，如MgSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、NiSO4·6H2O、FeSO4·7H2O、CaCl2、K2SO4、KCl、Na2SO4或其混合物。
优选为：0.2-0.5％氯化钠，0.4-1％硫酸镁，0.1-0.5％氯化钙，0.01-0.05％碳酸氢钠，0.1-0.5％硫酸钠，0.18％硫酸铵和0.2-0.8％氯化钾。
金属离子为Na2EDTA、FeCl3·6H2O、H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnCl2、CoCl2·6H2O、NiSO4·H2O、CuSO4·H2O、Na2MoO4·2H2O中的一种或几种。
微量元素为硫胺素、生物素、维生素B12中的一种或几种。
在本发明的优选实施方式中，进行发酵罐培养时，初始培养基为葡萄糖4-10％、谷氨酸钠3.5-10％、酵母浸膏0.5-3％、氯化钠0.2-0.5％、磷酸二氢钾0.3-1％、硫酸镁0.4-1％、氯化钙0.01-0.5％、碳酸氢钠0.01-0.05％、硫酸铵0.1-0.2％和氯化钾0.1-0.8％，以及每升含有0.01-0.3g FeCl3·6H2O的金属离子液、每升含有100-1000mg硫胺素、0.5-50mg生物素和0.5-50mg维生素B12的微量元素液。
本发明提供的制备方法通过在裂殖壶菌高密度发酵过程中，从菌体进入对数生长期开始直至发酵结束，有限制地进行补充碳源和氮源，即控制碳氮比为2:1-4:1，既能提供裂殖壶菌生长的基本能量，又能使得磷脂型油脂合成迅速累积，并且抑制甘油三酯的转化，从而使得单位质量菌体中的磷脂积累较高，获得磷脂型DHA含量较高的油脂制品，所述油脂制品包括含油干菌体和/或所提取的含油磷脂型DHA的油脂。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中所用材料若无特别声明，均可以市售购得。
以下实施例中所用发酵罐为50L发酵罐，根据实际情况，也可在7L/70L或者更大规模的发酵罐中进行，实施例中的种子液制备以及种子液扩大培养的过程、级数均可视发酵规模调整。
实施例1
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，具体步骤如下：
(1)种子液制备：将裂殖壶菌种子经过摇瓶培养制备一级种子罐的种子液；种子培养基的配方为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、酵母浸膏10g/L、氯化钠10g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁5g/L和氯化钙0.5g/L。
(2)种子液扩大培养：将制备的种子液通过二级培养的方式进行种子液扩培，种子罐的装液量为罐体积的50％左右，培养温度为28℃，在220rpm的搅拌速度下，培养2天；扩大培养的培养基配方与种子培养基配方相同。
(3)发酵罐培养：将扩大培养的种子液按照20％的接种量通过消毒后的移种站移种至发酵罐中，培养温度28-30℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1.5vvm(L/L.min)，罐压0.1MPa，补加柠檬酸控制发酵液pH在6.0-7.5之间；
初始培养基：葡萄糖5％，谷氨酸钠6％，酵母浸膏1％，0.2％氯化钠，0.6％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，0.05％碳酸氢钠，0.1％硫酸铵，0.2％氯化钾，金属离子(每升含有6.0g Na2EDTA，0.29g FeCl3·6H2O，6.84g H3BO3)，以及微量元素(每升含有100mg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg维生素B12)；
在菌体生长的对数期5h(此时底糖消耗至0.001％，近似为0，需要开始补糖)之后至发酵结束(发酵周期为60h)，残糖控制在0.8％，碳氮比控制在3:1，具体为在线检测发酵液中的残糖结果，采用连续补料的方式补加葡萄糖来控制发酵液中的糖浓度满足控制范围，通过碳氮比得到所需补充的谷氨酸钠。
(4)酶解：发酵完毕后，将发酵液放罐至酶解罐，加入氢氧化钠调节pH至7-8.5，再加入0.1％的蛋白酶进行酶解，通过取样观察细胞的破壁情况确定酶解是否完成，得到酶解液。
(5)离心：酶解完成后将完全破壁的酶解液放料至离心机进行过滤，离心上层为DHA毛油、中层为高温废水、下层为DHA菌粕，收集上层产出的DHA毛油入库，获得富含磷脂型DHA的油脂。
实施例2
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例1不同在于步骤(3)，在原来基础上还补加葵花籽油，具体为：在菌体生长的对数期(5h，底糖耗至0)开始补加，直至发酵结束，通过检测发酵液离心后上清中葵花籽油的浓度，控制其残留量在1g/L，补加方式为连续流加。
实施例3
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2不同在于步骤(3)中在菌体生长的对数期5h之后至发酵结束(发酵周期为60h)，残糖控制在0.8％，碳氮比控制在2.5:1。
实施例4
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2不同在于步骤(3)中葵花籽油的补加量，具体为：在菌体生长的对数期(5h，底糖耗至0)开始补加，直至发酵结束，通过检测发酵液离心后上清中葵花籽油的浓度，控制其残留量在0.3g/L，补加方式为连续流加。
实施例5
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2不同在于步骤(3)中发酵周期为90h。
实施例6
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2的不同在于：
(3)发酵罐培养：初始培养基：葡萄糖10％，谷氨酸钠6％，酵母浸膏1％，0.2％氯化钠，0.2％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，0.05％碳酸氢钠，0.1％硫酸铵，0.2％氯化钾，金属离子(每升含有6.0g Na2EDTA，0.29g FeCl3·6H2O，6.84g H3BO3)，以及微量元素(每升含有100mg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg维生素B12)。
实施例7
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2的不同在于
(3)发酵罐培养：葡萄糖5％、谷氨酸钠12％、酵母浸膏2％、0.5％氯化钠、1％磷酸二氢钾、1％硫酸镁、0.1％氯化钙、0.01％碳酸氢钠、0.2％硫酸铵和0.7％氯化钾，以及每升含有4g Na2EDTA、0.1g FeCl3·6H2O、4g H3BO3、800mg硫胺素、10mg生物素和10mg维生素B12。
在菌体生长的对数期5h(此时底糖消耗至0.001％，近似为0，需要开始补糖)之后至发酵结束(发酵周期为60h)，残糖控制在0.8％，碳氮比控制在2:1，具体为在线检测发酵液中的残糖结果，采用连续补料的方式补加葡萄糖来控制发酵液中的糖浓度满足控制范围，通过碳氮比得到所需补充的氨水。
对比例1
本对比例提供一种发酵工艺，其与实施例1不同在于步骤(3)中，通过发酵过程葡萄糖浓度变化间歇式补糖，采用连续流加的方式补加葡萄糖，控制其维持在1％，发酵至90h放罐。
对比例2
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例1不同在于步骤(3)：
发酵罐培养：将扩大培养的种子液按照20％的接种量通过消毒后的移种站移种至发酵罐中，培养温度28-30℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1.5vvm(L/L.min)，罐压0.1MPa，补加柠檬酸控制发酵液pH在6.0-7.5之间；
初始培养基：葡萄糖5％，谷氨酸钠6％，酵母浸膏1％，0.2％氯化钠，1％磷酸二氢钾，0.5％硫酸镁，0.5％氯化钙，0.05％碳酸氢钠，0.1％硫酸铵，0.2％氯化钾，金属离子(每升含有6.0g Na2EDTA，0.29g FeCl3·6H2O，6.84g H3BO3)，以及微量元素(每升含有100mg硫胺素，0.5mg生物素，0.5mg维生素B12)；
通过发酵过程葡萄糖浓度变化间歇式补糖，对数期及之后的发酵过程，采用连续流加的方式补加葡萄糖，控制其维持在0.8％(传统补糖工艺)；
同时，在菌体生长的对数期(5h，底糖耗至0)之后直至发酵结束进行补加葵花籽油，通过检测发酵液离心后上清中葵花籽油的浓度，控制其残留量在1g/L，补加方式为连续流加；
发酵周期至60h放罐。
对比例3
本实施例提供一种磷脂型DHA的制备方法，与实施例2不同在于步骤(3)中在菌体生长的对数期5h之后至发酵结束(发酵周期为60h)，残糖控制在0.8％，碳氮比控制在0.5:1。
分别测定实施例1-6、对比例1-3得到的发酵液的各项指标：发酵结束后，针对提取到的总脂质，SEP-PAK PLus柱色谱法分离成甘油三酯(TG)及磷脂，用盐酸甲醇法使磷脂组分其衍生为甲酯，然后进行脂肪酸的定性和定量分析，结果如表1所示。
表1实施例1-7、对比例1-3所得发酵的分析结果(其中，重量为每1g干菌体中的量)
Figure BDA0002872886760000101
结合表1中实施例1-4/6-7结果可以看出，本发明通过在裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期开始直至发酵结束，有限制地进行补充碳源和氮源，即控制碳氮比为2:1-4:1，能使得磷脂型油脂合成迅速累积，每克干菌体中磷脂型DHA的质量超过10mg；结合实施例1和实施例2的结果可知，通过补加植物油可进一步提高油脂中磷脂型DHA油脂的量；从实施例5可知，若仍采用常规的发酵周期，磷脂型DHA的含量反而较低。但是，从对比例2可知，若只补加植物油而不控制碳氮比，得到的菌体积累的磷脂型DHA质量有限。结合实施例2和实施例4可知，优选控制植物油在发酵液中的残留量为1-2.5g/L。结合实施例2、实施例6-7可知，本发明将磷酸盐的添加量控制在0.4-1％更有利于磷脂型DHA含量的提高。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种磷脂型DHA的制备方法，采用裂殖壶菌发酵，其特征在于，在所述裂殖壶菌发酵过程中，从菌体进入对数生长期至发酵结束期间，控制发酵液中碳源碳浓度为0.10-0.36％，并控制碳氮比为2:1-4:1。
2.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，所述裂殖壶菌发酵过程中，在菌体进入对数生长期后，具体包括：根据发酵液中的残余碳源碳浓度，采用连续补料的方式补加碳源使碳源碳浓度保持在0.10-0.36％，然后按照所述碳氮比进行氮源的补充。
3.根据权利要求2所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、甘油或其酯、糖蜜中的一种或多种；所述补充的氮源为氨水、氨基酸或其盐、磷酸氢二铵、硝酸铵、硫酸铵、尿素中的一种或多种。
4.根据权利要求1～3任一项所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，从菌体进入对数生长期至发酵结束期间，还向发酵液中补加植物油。
5.根据权利要求4所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，所述植物油的补加速度根据其消耗速度变化，控制所述植物油在发酵液中的残留量为1-2.5g/L，补加方式为连续流加。
6.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，所述裂殖壶菌发酵的周期为45-60h。
7.根据权利要求1所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，进行所述裂殖壶菌发酵时，初始培养基中磷酸盐的质量体积分数为0.4-1％。
8.根据权利要求7所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，进行所述裂殖壶菌发酵时，初始培养基为：碳源2-10％，氮源4-13％，主要金属盐0.1-5％，0.001-0.3％金属离子，0.1-0.3％微量元素，0.4-1％磷酸盐。
9.根据权利要求8所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，进行所述裂殖壶菌发酵时，初始培养基为：葡萄糖4-10％、谷氨酸钠3.5-10％、酵母浸膏0.5-3％、氯化钠0.2-0.5％、磷酸二氢钾0.3-1％、硫酸镁0.4-1％、氯化钙0.01-0.5％、碳酸氢钠0.01-0.05％、硫酸铵0.1-0.2％和氯化钾0.1-0.8％，以及每升含有0.01-0.3g FeCl3·6H2O的金属离子液、每升含有100-1000mg硫胺素、0.5-50mg生物素和0.5-50mg维生素B12的微量元素液。
10.根据权利要求1～9任一项所述的磷脂型DHA的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：待所述裂殖壶菌发酵结束后，干燥发酵液获得富含磷脂型DHA的干菌体，或者，将发酵液进行酶解破壁和离心，收集上层，获得富含磷脂型DHA的油脂。
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