CN117467714A - 一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 - Google Patents
一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117467714A CN117467714A CN202311411521.1A CN202311411521A CN117467714A CN 117467714 A CN117467714 A CN 117467714A CN 202311411521 A CN202311411521 A CN 202311411521A CN 117467714 A CN117467714 A CN 117467714A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fermentation
- vitamin
- dha
- malic acid
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 89
- 241000003595 Aurantiochytrium limacinum Species 0.000 title claims abstract description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 48
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 41
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 56
- BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N (S)-malic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 35
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 30
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N alpha-hydroxysuccinic acid Natural products OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 30
- 235000011090 malic acid Nutrition 0.000 claims description 30
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 28
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- 239000001630 malic acid Substances 0.000 claims description 25
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 22
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 20
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 19
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 18
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 17
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 15
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 14
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 13
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 13
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 13
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 13
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L (5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methyl phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP([O-])([O-])=O)C(C)=C1O RBCOYOYDYNXAFA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 11
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 11
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims description 11
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 11
- FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2,7, Chemical compound [Co+3].N#[C-].C1([C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)[N-]\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O FDJOLVPMNUYSCM-UVKKECPRSA-L 0.000 claims description 11
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 claims description 11
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 10
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 claims description 10
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N dimethylselenoniopropionate Natural products CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 claims description 8
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 claims description 8
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 claims description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 claims description 7
- 235000010216 calcium carbonate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 235000015165 citric acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 claims description 7
- 101710130006 Beta-glucanase Proteins 0.000 claims description 6
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 235000011121 sodium hydroxide Nutrition 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 4
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000019260 propionic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N quinbolone Chemical compound O([C@H]1CC[C@H]2[C@H]3[C@@H]([C@]4(C=CC(=O)C=C4CC3)C)CC[C@@]21C)C1=CCCC1 IUVKMZGDUIUOCP-BTNSXGMBSA-N 0.000 claims description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 2
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 2
- 239000006188 syrup Substances 0.000 claims description 2
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004519 grease Substances 0.000 abstract description 14
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 130
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 67
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 65
- 229940099690 malic acid Drugs 0.000 description 17
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 10
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 10
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 10
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 5
- 229940116298 l- malic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 4
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 3
- 150000004649 carbonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 2
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 2
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 239000013530 defoamer Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 2
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 2
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 2
- 235000021243 milk fat Nutrition 0.000 description 2
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 2
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010004032 Bromelains Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241001454694 Clupeiformes Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007330 LDL Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010007622 LDL Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 102000019280 Pancreatic lipases Human genes 0.000 description 1
- 108050006759 Pancreatic lipases Proteins 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241001125046 Sardina pilchardus Species 0.000 description 1
- 241000233671 Schizochytrium Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000019513 anchovy Nutrition 0.000 description 1
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 235000019835 bromelain Nutrition 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008094 contradictory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 235000004626 essential fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 1
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940040461 lipase Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 229940116369 pancreatic lipase Drugs 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
- C12P7/6434—Docosahexenoic acids [DHA]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/06—Lysis of microorganisms
- C12N1/063—Lysis of microorganisms of yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
- C12N1/18—Baker's yeast; Brewer's yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/85—Saccharomyces
- C12R2001/865—Saccharomyces cerevisiae
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域。本发明提供了一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn‑2DHA占比的培养基，其特征在于，所述培养基含有啤酒酵母破壁液。本发明采用含啤酒酵母破壁液的培养基，解决了如何提高发酵液干重、总油脂、DHA含量及sn‑2DHA占比的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法。
背景技术
不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸，其生理功能是保持细胞膜的相对流动性，以保证细胞的正常生理活动。根据双键的位置及功能可以将多不饱和脂肪酸分为ω-6系列和ω-3系列，亚油酸和花生四烯酸属ω-6系列，亚麻酸、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)属ω-3系列。二十二碳六烯酸(DHA)又称为“脑黄金”，是人体心血管、神经和视觉系统发挥正常功能所不可缺少的物质。DHA在人体大脑皮层中含量较高，约占大脑灰质磷脂的24.30-36.60％，在眼睛视网膜中所占比例约50％，对婴幼儿智力和视力发育至关重要。
基于DHA的作用，市面上陆续出现一些含有DHA的产品，例如DHA配方奶粉、孕妇营养奶粉、鱼油胶囊等等，主要致力于促进婴幼儿智力发育、孕妇补充营养、中老年人群增强免疫力等。根据脂质结构的差异，DHA可分为甘油酯型(TAG)、乙酯型(EE)、游离型(FFA)等，相关研究表明，DHA的构型以及分布位置的差异会影响其生物利用度。乙酯DHA含量虽然会高于甘油三酯型DHA，但是其在体内的生物利用度确远不及甘油酯型和游离型DHA。由于人体摄入DHA后sn-1,3特异性脂肪酶可将TAG水解成sn-2单甘酯和游离脂肪酸，其中sn-2单甘酯可通过小肠黏膜吸收，再由体内转化合成DAG和磷脂从而发挥其生理功能，而胰脂酶水解EE-DHA的速率比TAG-DHA低10-15倍。因此，DHA在甘油骨架上的分布影响其消化和吸收的效率以及功能的转化。Narcisa等给小鼠分别饲喂鱼油、鱼油乙酯和sn-2DHA脂质，结果发现饲喂sn-2DHA脂质的小鼠大脑、肝脏、血液中的n-3脂肪酸水平明显高于其他组，而且小鼠体内胆固醇、低密度脂蛋白和TGA的水平也显著降低了。在另一项研究中发现，饲喂sn-2DHA补充剂的小鼠大脑如磷脂酰丝氨酸中DHA水平会高于饲喂牛奶的小鼠。人乳是提供婴幼儿生长和发育的主要营养物质，乳脂中DHA主要以甘油三酯形式存在，其中50％以上的DHA分布在sn-2位上，随着乳汁的成熟，乳脂中DHA含量会相对减少，但是sn-2位DHA的占比会逐渐增加。由此可见，哺乳期补充DHA尤其是sn-2DHA对婴幼儿神经系统发育尤为重要。商业化DHA的主要来源是深海鱼油和藻油，天然鱼油DHA含量普遍在20-30％左右，其中油金枪鱼、沙丁鱼、凤尾鱼等提取而来的天然鱼油中sn-2DHA占比可在44.79-72.99％之间。但深海鱼类资源有限，鱼油中DHA含量相对较低且存在纯化成本高、夹杂难闻的鱼腥味、含有重金属、产量不稳定等问题，由此鱼油来源的DHA不能满足日益增长的市场需求。
利用海洋微藻发酵生产DHA一直是研究关注的热点。裂壶藻作为商业化生产DHA的优势菌种，具有发酵周期短、不受外界环境影响、DHA产量高等特点，因此是替代鱼油的可持续性资源。裂壶藻油的DHA含量一般在40-60％之间。有研究表明，藻油sn-2DHA占比普遍在甘油酯型DHA的31.66％-42.09％之间，低于天然鱼油sn-2-DHA占比。此外，作为异养型微生物，酵母浸粉、酵母膏是裂壶藻发酵生产DHA的良好有机氮源。传统工业化生产藻油DHA主要应用酵母浸粉，但酵母浸粉价格较为昂贵，且转化是低效率的，加之生产过程中需输入大量能量，设备投资与维护费用不菲，使得当前藻油DHA的生产成本非常高。因此，利用优势菌种，通过改善发酵工艺，获得产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的发酵技术工艺，以提高DHA生物利用度以及充分发挥DHA的生理功能。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基，其特征在于，所述培养基含有啤酒酵母破壁液。啤酒酵母破壁液在本发明的的技术方案中，其不仅作为氮源提供给裂壶藻，特别的，其还能够解决了如何提高发酵液干重、总油脂、DHA含量及sn-2DHA占比的问题；同时，如果利用本发明所述的调节发酵液pH值方法，碳酸钙、碳酸钠等碳酸盐作缓冲剂来调节发酵液pH值，能获得更优的技术效果。
一方面，本发明提供一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基，所述培养基含有啤酒酵母破壁液。
在一些实施例中，啤酒酵母破壁液制备方法包括：啤酒酵母与水，料液体积比为1:10，调节pH值至5.5-6.5，50-60℃下，采用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解18-24h；酶解后升温灭酶，获得啤酒酵母破壁液。
在一些实施例中，啤酒酵母破壁液制备方法包括：将新鲜啤酒酵母与水，料液体积比为1:10，调节pH值至6，55℃下，采用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解18-24h；酶解后升温灭酶，获得啤酒酵母破壁液。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述调节pH值采用盐酸和氢氧化钠。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述蛋白酶为微生物蛋白酶、动物蛋白酶、植物蛋白酶。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述蛋白酶采用碱性蛋白酶。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述蛋白酶和β-葡聚糖酶的质量比为(8-12)：1。
在啤酒酵母破壁液制备方法的一些实施例中，所述蛋白酶和β-葡聚糖酶的质量比为10：1。
在一些实施例中，所述啤酒酵母破壁液浓度为15-25g/L。
在一些实施例中，所述啤酒酵母破壁液浓度为15-20g/L。
在一些实施例中，所述培养基含有pH调节剂。
在一些实施例中，所述pH调节剂包括：选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙、柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酸、盐酸和硫酸中的一种或多种。
在一些实施例中，所述pH调节剂包括：选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙中的一种或多种，和选自柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酸、盐酸和硫酸中的一种或多种。
在一些实施例中，所述pH调节剂包括：选自氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙中的一种或多种，和选自柠檬酸和苹果酸中的一种或多种。
在一些实施例中，所述pH调节剂包括：选自氨水、碳酸钙中的一种或多种，和苹果酸中。
在一些实施例中，所述培养基还包括碳源、无机盐、维生素。
在一些实施例中，所述碳源包括：葡萄糖、玉米糖浆、甘油、蔗糖的一种或多种；
在一些实施例中，所述碳源浓度为50～80g/L。
在一些实施例中，所述碳源浓度为60～70g/L。
在一些实施例中，所述无机盐包括：无水硫酸钠、无水硫酸镁、硫酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾和无水氯化钙中的一种或多种组合。
在一些实施例中，无水硫酸钠11-19g/L、无水硫酸镁2.0～6.0g/L、硫酸钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、氯化钾0.3～1g/L、无水氯化钙0.1～0.3g/L。
在一些实施例中，所述维生素包括：维生素B1、维生素B5、维生素B2、维生素B6和维生素B12中的一种或多种组合。
在一些实施例中，所述维生素包括：维生素B10.5～2.0mg/L，维生素B52～6mg/L，维生素B22～6mg/L，维生素B60.01～0.05mg/L，维生素B120.2～0.6mg/L。
在一些实施例中，所述培养基还包括氮源。
在一些实施例中，所述氮源选自：酵母粉、玉米浆干粉、硫酸铵的一种或多种。
在一些实施例中，所述氮源选自：硫酸铵。
在一些实施例中，所述氮源浓度为1-20g/L。
在一些实施例中，所述氮源选自：硫酸铵，硫酸铵的浓度为1.0～3.0g/L。
另一方面，本发明还提供了一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的发酵方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)一级种子罐培养：接种量为2-5％；控制pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐；
(2)二级种子罐培养：接种量为8-15％；控制pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐；
(3)发酵罐培养：pH控制在5.0-6.5，72h前糖浓度控制在40-60g/L；72～96h，糖浓度控制10～20g/L；
所述发酵罐培养所用培养基为权利要求1-7任一项所述的培养基。
在一些实施例中，所述方法包括下列步骤：
(1)一级种子罐培养：将裂壶藻种子接种至一级培养基中，接种量为2.5％；初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐；
(2)二级种子罐培养：接种量为10％；初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐；
(3)发酵罐培养：发酵罐培养的pH控制在5.0-6.5，通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％；72h前糖浓度控制在40-60g/L；72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。
在一些实施例中，pH采用氨水和/或碳酸钙，和苹果酸调控。
在一些实施例中，pH采用氨水和苹果酸调控。在一些实施例中，pH采用碳酸钙和苹果酸调控。
在一些实施例中，pH采用氨水和碳酸钙，和苹果酸调控。
在一些实施例中，发酵0-48小时，pH采用氨水和苹果酸调控；发酵48小时之后，pH采用碳酸钙和苹果酸调控。
有益效果
本发明采用啤酒酵母破壁液替换成酵母浸粉，并采用碳酸钙调节裂壶藻发酵液pH为创新点，啤酒酵母破壁液含有丰富的维生素B群、多种维他命、矿物质，高达50％以上的蛋白质，含有完整的氨基酸群，是补充优质蛋白质的最佳来源，所以经常作为氮源使用。然而在本发明采用啤酒酵母破壁液的技术方案，解决了如何提高发酵液干重、总油脂、DHA含量及sn-2DHA占比的问题。特别是，意外的发现利用碳酸钙、碳酸钠等碳酸盐作缓冲剂来调节发酵液pH值，能更进一步的提供了解决这几个技术问题的优选方案。
术语说明
现在详细描述本发明的某些实施方案。本发明意图涵盖所有的替代、修改和等同技术方案，它们均包括在如权利要求定义的本发明范围内。本领域技术人员应认识到，许多与本文所述类似或等同的方法和材料能够用于实践本发明。本发明绝不限于本文所述的方法和材料。在所结合的文献、专利和类似材料的一篇或多篇与本申请不同或相矛盾的情况下(包括但不限于所定义的术语、术语应用、所描述的技术，等等)，以本申请为准。
应进一步认识到，本发明的某些特征，为清楚可见，在多个独立的实施方案中进行了描述，但也可以在单个实施例中以组合形式提供。反之，本发明的各种特征，为简洁起见，在单个实施方案中进行了描述，但也可以单独或以任意适合的子组合提供。
除非另外说明，本发明所使用的所有科技术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。本发明涉及的所有专利和公开出版物通过引用方式整体并入本发明。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
在下面的内容中，无论是否使用“大约”或“约”等字眼，所有在此公开了的数字均为近似值。每一个数字的数值有可能会出现1％、2％、5％、7％、8％、10％、15％或20％等差异。每当公开一个具有N值的数字时，任何具有N+/-1％,N+/-2％,N+/-3％,N+/-5％,N+/-7％,N+/-8％,N+/-10％,N+/-15％或N+/-20％值的数字会被明确地公开,其中“+/-”是指加或减。
啤酒酵母破壁液：是对啤酒酵母进行破壁得到的。在本发明中，具体制备方法为称取5kg新鲜啤酒酵母，水洗离心三遍之后加入一定量水，使之料液体积比为1:10；使用氢氧化钠和盐酸调节pH值至6.0，并将料液升温至55℃，然后加入50g的碱性蛋白酶和5gβ-葡聚糖酶，持续搅拌水解18-24h，期间将pH稳定在6.0左右。酶解结束后再升温至85～95℃，灭酶10～15min，获得啤酒酵母破壁液。
本发明中，氨水浓度范围为5％至30％之间。在一些实施例中，氨水浓度范围为10％至25％之间。在一些实施例中，氨水浓度范围为20％至25％之间。
消泡剂是消除泡沫的一种添加剂。本发明所使用的消泡剂为适用生物发酵领域的消泡剂。
发酵液干重和油脂含量参照《裂殖壶菌高产DHA的发酵技术研究及其代谢机理分析》文献中的检测方法。
DHA含量采用GB 5009.168-2016中的内标法检测。
sn-2DHA含量采用GB/T 24894-2010中的检测方法。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
培养方法：
(1)一级种子罐培养：将裂壶藻种子接种至一级培养基中，接种量为2.5％，初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐，时间约为24小时。
(2)二级种子罐培养：接种量为10％。初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐，时间约为13～16小时。
(3)发酵罐培养：发酵罐培养的pH控制在5.0-6.5，通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％。72h前糖浓度控制在40-60g/L。72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵，并进行结果检测。
在一些实施例中，所述种子罐培养基为：葡萄糖50～80g/L、酵母粉10～20g/L、无水硫酸钠10～25g/L、氯化钾0.3～1.0g/L、七水硫酸镁2.0～6.0g/L、硫酸钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、硫酸铵1.0～3.0g/L和无水氯化钙0.1～0.3g/L，pH值自然，优选为pH 5.5～6.0。
在一些实施例中，所述发酵罐培养基为：葡萄糖55～80g/L、啤酒酵母破壁液10-30g/L、硫酸铵1.0～3.0g/L、无水硫酸钠11-19g/L、无水硫酸镁2.0～6.0g/L、硫酸钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、氯化钾0.3～1g/L、无水氯化钙0.1～0.3g/L，维生素B10.5～2.0mg/L，维生素B52～6mg/L，维生素B22～6mg/L，维生素B60.01～0.05mg/L，维生素B120.2～0.6mg/L。
在一些实施例中，所述发酵罐培养基为：葡萄糖55～80g/L、酵母粉10-30g/L、啤酒酵母破壁液10-30g/L，硫酸铵1.0～3.0g/L、无水硫酸钠11-19g/L、无水硫酸镁、2.0～6.0g/L、硫酸钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、氯化钾0.3～1g/L、无水氯化钙0.1～0.3g/L，维生素B10.5～2.0mg/L，维生素B52～6mg/L，维生素B22～6mg/L，维生素B60.01～0.05mg/L，维生素B120.2～0.6mg/L。
在一些实施例中，所述发酵罐培养基配方：葡萄糖60g/L、啤酒酵母破壁液15-25g/L，无水硫酸钠15g/L，无水硫酸镁4.1g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，硫酸钾1.0g/L，硫酸铵0.17g/L，氯化钾0.5g/L，无水氯化钙0.17g/L，维生素B11 mg/L，维生素B53 mg/L，维生素B2，维生素B60.01 mg/L，维生素B120.4 mg/L。
在一些实施例中，所述发酵罐培养基所用pH调节剂可为氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙；柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酸、盐酸、硫酸。
在一些实施例中，发酵罐培养基所用pH调节剂为氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙、柠檬酸、苹果酸。
在一些实施例中，发酵培养基所用pH调节剂为氨水、碳酸钙、苹果酸。
种子培养
(1)一级种子罐培养：将裂壶藻种子接种至一级培养基中，接种量为2.5％，初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐，时间约为24小时。
(2)二级种子罐培养：接种量为10％。初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐，时间约为13～16小时。
种子罐培养基组成：葡萄糖60g/L、酵母粉10g/L、无水硫酸钠15g/L、氯化钾0.5g/L、七水硫酸镁4.1g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、硫酸铵1.0g/L和无水氯化钙0.17g/L，pH值自然(即不加额外添加pH调节剂)。
发酵罐培养
实施例1
80立方发酵罐：接种量为10％。通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％。72h前糖浓度控制在40-60g/L。72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。发酵pH控制在5.0-6.5，用氨水和L-苹果酸2.0g/L来调节pH。
发酵培养基：葡萄糖60g/L、酵母粉20g/L、硫酸铵1.5g/L、无水硫酸钠15g/L、无水硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.7g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、氯化钾0.5g/L、无水氯化钙0.18g/L、维生素B11 mg/L，维生素B53 mg/L，维生素B23 mg/L，维生素B60.01 mg/L，维生素B120.4mg/L。发酵时加入消泡剂30mL/L。
发酵结果：发酵液干重为84.5g/L，总油脂含量为463mg/g，DHA含量为219.3mg/g，sn-2DHA占总DHA比例26.92％。
实施例2
80立方发酵罐：接种量为10％。通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％。72h前糖浓度控制在40-60g/L。72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。发酵pH控制在5.0-6.5，用氨水和L-苹果酸2.0g/L来调节pH。
发酵培养基：葡萄糖60g/L、啤酒酵母破壁液15g/L、硫酸铵1.5g/L、无水硫酸钠15g/L、无水硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.7g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、氯化钾0.5g/L、无水氯化钙0.18g/L、维生素B11 mg/L，维生素B53 mg/L，维生素B23 mg/L，维生素B60.01 mg/L，维生素B120.4mg/L。发酵时加入消泡剂30mL/L。
发酵结果：发酵液干重为199g/L，总油脂含量为676mg/g，DHA含量为336mg/g，DHA占总油脂的比例为49.70％。sn-2DHA占总DHA的比例为31.4％。
实施例3
80立方发酵罐：接种量为10％。通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％。72h前糖浓度控制在40-60g/L。72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。发酵pH控制在5.0-6.5，0～48h前，用氨水和L-苹果酸2.0g/L来调节pH。在发酵48h后用碳酸钙4.0g/L和L-苹果酸来调节pH。
实验组3-1补充氨水700L；0～48h前，pH下降使用氨水补加，氨水量达到700L后，改为碳酸钙，pH上升全程使用苹果酸调节。
实验组3-2补充氨水1500L；0～48h前，pH下降使用氨水补加，氨水量达到1500L后，改为碳酸钙，pH上升全程使用苹果酸调节。
实验组3-3补充氨水3000L。0～48h前，pH下降使用氨水补加，氨水量达到3000L后，改为碳酸钙，pH上升全程使用苹果酸调节。
继续培养96h后结束发酵。
发酵培养基：葡萄糖60g/L、啤酒酵母破壁液17g/L、硫酸铵1.5g/L、无水硫酸钠15g/L、无水硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.7g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、氯化钾0.5g/L、无水氯化钙0.18g/L、维生素B11 mg/L，维生素B53 mg/L，维生素B23 mg/L，维生素B60.01 mg/L，维生素B120.4mg/L。发酵时加入消泡剂30mL/L。
发酵结果：
实验组3-1：发酵液干重为188.9g/L；总油脂含量为480mg/g；DHA含量为128.2mg/g；DHA占总油脂的比例为45.79％；sn-2DHA占总DHA的比例为41.0％。
实验组3-2：发酵液干重为207g/L；总油脂含量为496mg/g；DHA含量为240.4mg/g；DHA占总油脂的比例为48.47％；sn-2DHA占总DHA的比例为43.4％。
实验组3-3：发酵液干重为204.3g/L；总油脂含量为431mg/g；DHA含量为227.4mg/g；DHA占总油脂的比例为52.76％；sn-2DHA占总DHA的比例为44.8％。
实施例4
80立方发酵罐：接种量为10％。通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％。72h前糖浓度控制在40-60g/L。72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。发酵pH控制在5.0-6.5，用碳酸钙10.8g/L和L-苹果酸2.0g/L来调节pH。
发酵培养基：葡萄糖60g/L、啤酒酵母破壁液17g/L、硫酸铵1.5g/L、无水硫酸钠15g/L、无水硫酸镁2.0g/L、硫酸钾0.7g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、氯化钾0.5g/L、无水氯化钙0.18g/L、维生素B11 mg/L，维生素B53 mg/L，维生素B23 mg/L，维生素B60.01 mg/L，维生素B120.4mg/L。发酵时加入消泡剂30mL/L。
发酵结果：发酵液干重为210.8g/L、总油脂含量为715mg/g、DHA含量为379.7mg/g、DHA占总油脂的比例为53.11％。sn-2DHA占总DHA的比例为52.79％。
由上可知，实施案例2相对实施例1，采用啤酒酵母破壁液替换成酵母浸粉，显著提高了发酵液干重、总油脂、DHA产量，以及sn-2DHA占总DHA的比例。实施例3补充氨水，随着氨水加入量的增多，各项指标都有所上升，整体在发酵液干重、总油脂、DHA产量，以及sn-2DHA占总DHA的比例也比实施例1高。实施例4在发酵期间pH用碳酸钙和苹果酸进行调节，其发酵液中总油脂、DHA含量、sn-2DHA占总DHA比例相较于实施例1、2、3都有显著的提高。
本发明采用啤酒酵母破壁液替换成酵母浸粉，并采用碳酸钙调节裂壶藻发酵液pH为创新点，啤酒酵母破壁液含有丰富的维生素B群、多种维他命、矿物质，高达50％以上的蛋白质，含有完整的氨基酸群，是补充优质蛋白质的最佳来源，所以经常作为氮源使用。然而在本发明采用啤酒酵母破壁液的技术方案，解决了如何提高发酵液干重、总油脂、DHA含量及sn-2DHA占比的问题。特别是，意外的发现利用碳酸钙、碳酸钠等碳酸盐作缓冲剂来调节发酵液pH值，能更进一步的提供了解决这几个技术问题的优选方案。
另外，碳酸盐价格低廉，无任何毒副作用且可通过一些手段沉淀析出，循环利用，能节约生产成本。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
1.一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基，其特征在于，所述培养基含有啤酒酵母破壁液；优选地，所述啤酒酵母破壁液浓度为15-25g/L；优选地，啤酒酵母破壁液制备方法包括：啤酒酵母与水，按料液体积比为1:10混合，调节pH值至5.5-6.5，50-60℃下，采用蛋白酶和β-葡聚糖酶水解18-24h；酶解后升温灭酶，获得啤酒酵母破壁液。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有pH调节剂；优选地，所述pH调节剂包括：选自氨水、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙中的一种或多种，和选自柠檬酸、苹果酸、乙酸、丙酸、盐酸和硫酸中的一种或多种；优选地，所述pH调节剂包括：选自氨水、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙中的一种或多种，和选自柠檬酸和苹果酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括碳源、无机盐、维生素。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述碳源包括：葡萄糖、玉米糖浆、甘油、蔗糖中的一种或多种；优选地，所述碳源浓度为50～80g/L。
5.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述无机盐包括：无水硫酸钠、无水硫酸镁、硫酸钾、磷酸二氢钾、氯化钾和无水氯化钙中的一种或多种组合；优选地，无水硫酸钠11-19g/L、无水硫酸镁2.0～6.0g/L、硫酸钾0.5～1.5g/L、磷酸二氢钾0.5～1.5g/L、氯化钾0.3～1g/L、无水氯化钙0.1～0.3g/L。
6.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述维生素包括：维生素B1、维生素B5、维生素B2、维生素B6和维生素B12中的一种或多种组合；优选地，所述维生素包括：维生素B10.5～2.0mg/L，维生素B52～6mg/L，维生素B22～6mg/L，维生素B60.01～0.05mg/L，维生素B120.2～0.6mg/L。
7.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基还包括氮源；优选地，所述氮源选自：酵母粉、玉米浆干粉、硫酸铵中的一种或多种；优选地，所述氮源浓度为1-20g/L。
8.一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的发酵方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)一级种子罐培养：接种量为2-5％；控制pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐；
(2)二级种子罐培养：接种量为8-15％；控制pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐；
(3)发酵罐培养：pH控制在5.0-6.5，72h前糖浓度控制在40-60g/L；72～96h，糖浓度控制10～20g/L；
所述发酵罐培养所用培养基为权利要求1-7任一项所述的培养基。
9.根据权利要求8所述的发酵方法，其特征在于，所述方法包括下列步骤：
(1)一级种子罐培养：将裂壶藻种子接种至一级培养基中，接种量为2.5％；初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入二级种子罐；
(2)二级种子罐培养：接种量为10％；初始葡萄糖60g/L，温度控制在25℃，溶氧控制大于30％，pH 5.5～6.0，残糖低于20g/L接种入发酵罐；
(3)发酵罐培养：发酵罐培养的pH控制在5.0-6.5，通过调节通气量和转速，控制溶氧在40％-70％；72h前糖浓度控制在40-60g/L；72～96h，糖浓度控制10～20g/L，培养96h后结束发酵。
10.根据权利要求8或9所述的发酵方法，其特征在于，pH采用氨水和/或碳酸钙，和苹果酸调控；任选地，pH采用氨水和苹果酸调控；任选地，pH采用碳酸钙和苹果酸调控；任选地，pH采用氨水和碳酸钙，和苹果酸调控；任选地，发酵0-48小时，pH采用氨水和苹果酸调控；发酵48小时之后，pH采用碳酸钙和苹果酸调控。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311411521.1A CN117467714A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311411521.1A CN117467714A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117467714A true CN117467714A (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=89628568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311411521.1A Pending CN117467714A (zh) | 2023-10-27 | 2023-10-27 | 一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117467714A (zh) |
-
2023
- 2023-10-27 CN CN202311411521.1A patent/CN117467714A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7134938B2 (ja) | エイコサペンタエン酸生成微生物、脂肪酸組成物、ならびにそれらの作製方法および使用 | |
| KR101293135B1 (ko) | 발효기 내에서 진핵 미생물의 고밀도 배양에 의한 고도불포화 지방산을 함유하는 지질의 증진된 생산 방법 | |
| De Swaaf et al. | High‐cell‐density fed‐batch cultivation of the docosahexaenoic acid producing marine alga Crypthecodinium cohnii | |
| CN110846346B (zh) | 富含Sn-2位DHA的微生物油脂及其制备方法和应用 | |
| EP2883958B1 (en) | Improved methods for fermentative production of docosahexaenoic acid | |
| WO1991014427A1 (en) | Eicosapentaenoic acids and methods for their production | |
| CA2675691A1 (en) | Methods for producing polyunsaturated fatty acid and lipid containing polyunsaturated fatty acid | |
| CN111356767A (zh) | 通过限制至少两种限制性营养源增强脂质的产生 | |
| CN103981009A (zh) | 一种裂殖壶菌发酵液破壁提取其胞内油脂的方法 | |
| JP2017502680A (ja) | 微細藻類バイオマスのタンパク質を富化するための方法 | |
| CN105132485B (zh) | 一种裂殖壶菌发酵生产dha的方法 | |
| CN101538592B (zh) | 用寇氏隐甲藻工业化发酵生产二十二碳六烯酸的方法 | |
| US8889382B2 (en) | Process for cultivating microorganisms of the genus Thraustochytriales | |
| Razavi et al. | Fatty acid and carotenoid production by Sporobolomyces ruberrimus when using technical glycerol and ammonium sulfate | |
| CN117467714A (zh) | 一种提高裂壶藻发酵生产高DHA含量以及高sn-2DHA占比的培养基及发酵方法 | |
| CN116024102A (zh) | 裂殖壶藻发酵方法及发酵产物、应用 | |
| CN114686534A (zh) | 一种磷脂型dha的制备方法 | |
| KR100768757B1 (ko) | 오메가-3 지방산(epa/dha)을 함유하는 클로렐라의 발효 제조방법 | |
| KR20020096020A (ko) | 모르티에렐라속 균주의 유가배양을 통한 아라키돈산의생산방법 | |
| MXPA06005301A (en) | Process for the cultivation of microorganisms of the genus thraustochytriales |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |