CN109913513B - 一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法，包括如下步骤：(1)将保存在甘油管中的裂殖壶菌接种至种子培养基中培养，获得一级种子；(2)将上述一级种子接种至种子培养基中培养，获得二级种子；(3)将上述二级种子接种至葡萄糖的含量为25～185g/L的第一级高糖驯化培养基中进行驯化培养获得第一代后，进行连续传代的驯化培养，每驯化培养9～11代，接种至葡萄糖的含量高28～32g/L的下一级高糖驯化培养基中继续进行连续传代的驯化培养，直至葡萄糖的含量达到85～215g/L，再进行连续驯化培养9～11代，获得高糖驯化菌株；(4)将上述高糖驯化菌株接种至发酵罐中的发酵培养基扩大培养，期间分析不同时期内的油脂组分。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸是构成生物膜组分不可缺少的物质，影响着细胞的结构和功能。维持ω-6系列和ω-3系列多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acids，PUFAs)均衡在保护生物膜结构、避免肥胖、抗氧化、增强免疫力等方面具备十分显著的作用(扬州：扬州大学，2012；Pharmacological Research，2008，57(6)：451-455)。缺乏ω-3系列多不饱和脂肪酸会导致大脑和视网膜磷脂外层中DHA的流失，从而被ω-6系列多不饱和脂肪酸所代替，引起学龄前幼儿大脑发育减缓和视力下降(OCL-Oleagineux Corps Gras Lipides，2011，18(6)：307-313)。此外，ω-3系列多不饱和脂肪酸通过对花生四烯酸(ArachidonicAcid，ARA)代谢产生抑制作用和清除代谢中产生的花生四烯酸，消除炎症(Springer BerlinHeidelberg，1987，29(11)：167-173)。
裂殖壶菌生长速度快，油脂含量高(15％以上)，其DHA含量高(45％以上)且无毒副作用，易于提取，是生产多不饱和脂肪酸的理想途径。裂殖壶菌作为高产油脂的微生物，被认为产DHA和EPA的理想工业菌株，但是其合成多不饱和脂肪酸的途径仍不清晰，处于探究阶段(Frontiers in Bioengineering&Biotechnology，2015，3：158)。基因工程技术是提升菌株性能的技术，但其结果的不可控性和人们对安全性的担忧，阻碍了基因工程技术改良菌株的发展。培养基优化可以提升工业生产的效率，但提升空间有限，不能根本上提升菌株性能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法。
本发明的技术方案如下：
一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法，包括如下步骤：
(1)将保存在甘油管中的裂殖壶菌以2～10％的接种量接种至pH为6.4～6.6的新鲜的种子培养基中，于温度27～29℃及转速180～220rpm的条件下培养45～50h，获得一级种子；
(2)将上述一级种子以4～6％的接种量接种至pH为6.4～6.6的新鲜的种子培养基中，于温度27～29℃及转速180～220rpm的条件下培养45～50h，获得二级种子；
(3)将上述二级种子接种至pH为6.4～6.6且葡萄糖的含量为25～185g/L的第一级高糖驯化培养基中进行驯化培养获得第一代后，进行连续传代的驯化培养，每驯化培养9～11代，接种至葡萄糖的含量高28～32g/L且pH为6.4～6.6的下一级高糖驯化培养基中继续进行连续传代的驯化培养，直至葡萄糖的含量达到85～215g/L，再进行连续驯化培养9～11代，获得高糖驯化菌株；
该步骤中各培养的条件如下：接种量为2～10％，培养温度为27～29℃，转速180～220rpm，培养时间为45～50h；各上述高糖驯化培养基由上述种子培养基添加葡萄糖而成；
(4)将上述高糖驯化菌株接种至发酵罐中的发酵培养基扩大培养10～12d，期间分析不同时期内的油脂组分。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将保存在甘油管中的裂殖壶菌以2～10％的接种量接种至pH为6.5的新鲜的种子培养基中，于温度28℃及转速200rpm的条件下培养48h，获得一级种子。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将上述一级种子以5％的接种量接种至pH为6.5的新鲜的种子培养基中，于温度28℃及转速200rpm的条件下培养48h，获得二级种子。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)中各培养的条件如下：接种量为2～10％，培养温度为28℃，转速200rpm，培养时间为48h。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(4)包括：
a、将所述高糖驯化菌株接入发酵罐中的发酵培养基扩大培养10～12d，用水杨酸法监测糖量，当糖浓度过低时，间歇流加葡萄糖溶液，发酵至中期，即95～97h时，通过加料口补入无机盐；
b、每11～13h取样，进行生物量、油脂总量和油脂组分鉴定分析。
在本发明的一个优选实施方案中，所述种子培养基的配方包括：酵母粉9～11g/L、硫酸钠11～13g/L、氯化钾0.4～0.6g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、硫酸钾0.60～0.70g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、二水合氯化钙0.16～0.18g/L。
进一步优选的，所述种子培养基的配方包括：酵母粉10g/L、硫酸钠12g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵1g/L、二水合氯化钙0.17g/L。
在本发明的一个优选实施方案中，所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖88～92g/L、谷氨酸钠4.8～5.1g/L、固体玉米浆粉4.8～5.1g/L、硫酸钠11～13g/L、氯化钾0.45～0.55g/L、硫酸镁1.9～2.1g/L、硫酸钾0.60～0.70g/L、磷酸二氢钾0.8～1.1g/L、硫酸铵0.8～1.1g/L、二水合氯化钙0.16～0.18g/L、七水合硫酸锌2.9～3.1mg/L、六水合氯化钴0.035～0.042mg/L、五水合硫酸铜1.9～2.1mg/L、六水合硫酸镍1.9～2.1mg/L、七水合硫酸铁9.5～10.3mg/L、泛酸钙3.15～3.25mg/L、四水合氯化锰2.9～3.1mg/L、二水合钼酸钠0.035～0.042mg/L、维生素B1 9.4～9.6mg/L、维生素B12 0.14～0.16mg/L。
进一步优选的，所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖90g/L、谷氨酸钠5g/L、固体玉米浆粉5g/L、硫酸钠12g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵1g/L、二水合氯化钙0.17g/L、七水合硫酸锌3mg/L、六水合氯化钴0.04mg/L、五水合硫酸铜2mg/L、六水合硫酸镍2mg/L、七水合硫酸铁10mg/L、泛酸钙3.2mg/L、四水合氯化锰3mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B1 9.5mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
本发明的有益效果是：本发明的方法对裂殖壶菌进行高糖驯化后，相较于原始菌株，总油脂含量提升47.75％，达到26.3g/L；油脂中二十碳五烯酸(EicosapntemacniocAcid，EPA)比例提高204.14％，二十二碳六烯酸(DocosahexaenoicAcid，DHA)比例提高了18.12％。生物量达到41.75g/L，相较于原始菌株生物量提升了14.4％。同时，将20代150g/L驯化菌株采用3.5L发酵罐进行补料发酵培养，生物量和油脂总量可达261.3g/L和94.6g/L，相较于原始菌株提升了105％和15.5％。其中DHA占总油脂比例38.68％，产量34.89g/L，EPA的比例1.91％，产量1.74g/L。经过发酵培养驯化菌株DHA和EPA比例含量和产量都明显高于原始菌株。
附图说明
图1为本发明第10代高糖驯化条件下多不饱和脂肪酸含量变化图(％)，其中，(A)EPA，(B)DPA，(C)DHA和(D)C16∶0
图2为本发明第20代高糖驯化条件下多不饱和脂肪酸含量变化图(％)，其中，(A)EPA，(B)DPA，(C)DHA和(D)C16∶0
图3为本发明第30代高糖驯化条件下多不饱和脂肪酸含量变化图(％)，其中，(A)EPA，(B)DPA，(C)DHA和(D)C16∶0
图4为本发明驯化菌株与原始菌株3.5L发酵罐发酵培养对比图，其中，(A)生物量变化(g/L)和(B)油脂总量变化(g/L)(C)DHA比例含量(％)，(D)EPA比例含量(％)，(E)DHA产量(g/L)和(F)EPA(g/L)
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
下述实施例中，种子培养基的配方为：酵母粉9～11g/L、硫酸钠11～13g/L、氯化钾0.4～0.6g/L、硫酸镁1.8～2.2g/L、硫酸钾0.60～0.70g/L、磷酸二氢钾0.8～1.2g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、二水合氯化钙0.16～0.18g/L。发酵培养基的配方为：葡萄糖90g/L、谷氨酸钠5g/L、固体玉米浆粉5g/L、硫酸钠12g/L、氯化钾0.5g/L、硫酸镁2g/L、硫酸钾0.65g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸铵1g/L、二水合氯化钙0.17g/L、七水合硫酸锌3mg/L、六水合氯化钴0.04mg/L、五水合硫酸铜2mg/L、六水合硫酸镍2mg/L、七水合硫酸铁10mg/L、泛酸钙3.2mg/L、四水合氯化锰3mg/L、二水合钼酸钠0.04mg/L、维生素B1 9.5mg/L、维生素B12 0.15mg/L。
实施例1
(1)将保存在甘油管中的裂殖壶菌ATCC-1381(购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC))接入20mL种子培养基中，接种量为2～10％，于28℃的温度及200rpm的转速下，培养48h，获得一级种子；
(2)将上述一级种子接入20mL种子培养基中，接种量为5％，于28℃的温度及200rpm的转速下，培养48h，获得二级种子；
(3)将上述二级种子接入20mL的葡萄糖浓度分别为30g/L、60g/L、90g/L、120g/L、150g/L和180g/L第一级高糖驯化培养基(由上述种子培养基添加葡萄糖而成)中，接种量为2～10％，于28℃的温度及200rpm的转速下，培养48h，得第一代高糖驯化裂殖壶菌，连续传代培养；
(4)将第十代高糖驯化裂殖壶菌接入50mL发酵培养基中，接种量为2～10％，于28℃的温度及200rpm的转速下，培养5～7d，得发酵液；
(5)分别取5～7天发酵液测不同高糖浓度下总油脂含量，并对脂肪酸进行分析鉴定，具体结果如图1所示。
总油脂含量的测定方法如下：
(1)选取发酵液样品3mL于15mL离心管中，混匀后再加入4mL质量分数38％的浓盐酸。于60～70℃水浴加热40～50min至菌体消化完全。
(2)然后再加入3～5mL正己烷，震荡，再于20℃，3000rpm离心1min后，取上层分层部分的正己烷置于已称重的50mL离心管中。用正己烷重复震荡萃取，3000rpm离心1min取上层有机相，此过程重复3～5次，直至上层有机相无色。
(3)常温下N2吹干正己烷，称重，得到净油脂产量。
(4)提取得到油脂进行甲酯化，干燥，滤膜过滤，所得样品即可进行气相色谱分析。
分析鉴定的具体方法如下：
向提取得到油脂中添加5mL的0.5mol/L的KOH-CH3OH溶液于65℃水浴至油滴溶解(大约10min)，然后加入5mL30％的三氟化硼乙醚，65℃水浴加热反应30min；冷却后加入5mL正己烷充分振荡，加40μL内标物(如十六烷乙酸)，然后加入足量的饱和食盐水，静置待两液面分层后取上层正己烷相并用过量无水硫酸钠脱水，0.22μL孔径有机系滤膜过滤，所得样品即可进行气相色谱分析。
气相色谱检测条件如下：安捷伦气相色谱分析仪，使用SP2560盘；使用N2作为载体，初始柱温140℃，检测器温度250℃，柱箱温度250℃；升温程序：初始温度140℃保持2min，之后以每分钟上升10℃的速度提升温度到230℃，保持5min。
实施例2
连续培养，提升葡萄糖浓度梯度(即将实施例1中的第十代高糖驯化裂殖壶菌接入葡萄糖浓度分别为60g/L、90g/L、120g/L、150g/L、180g/L和210g/L第二级高糖驯化培养基)，分别驯化传代至二十代，再分别接入发酵培养基，取5～7天发酵液测总油脂含量，并对油脂成分进行分析鉴定。其余同实施例1，具体结果如图2所示。
实施例3
连续培养，提升葡萄糖浓度梯度(即将实施例2中的经60g/L、90g/L、120g/L、150g/L和180g/L的第二级高糖驯化培养基驯化培养获得的第二十代高糖驯化裂殖壶菌种子接入葡萄糖浓度分别为90g/L、120g/L、150g/L、180g/L和210g/L第三级高糖驯化培养基)，分别驯化传代至三十代，再分别接入发酵培养基，取5～7天发酵液测总油脂含量，并对脂肪酸进行分析鉴定。其余同实施例1，具体结果如图3所示。
实施例4
选取PUFAs比例优化明显的驯化菌株，进行3.5L发酵罐发酵，验证驯化菌株优化PUFAs效果。步骤如下：
(1)活化实施例2中第二十代150g/L驯化菌株种子，接入葡萄糖浓度150g/L种子培养基中培养24h。
(2)3.5L发酵罐中，培养基2L，125℃灭菌40min。
(3)接种驯化菌株，培养温度28℃，起始转速300rpm，通气量2vvm。通过流加氨水和1mol/L柠檬酸，控制pH值在6.5。发酵过程中通过控制通气量和搅拌速度来调节溶氧，控制在5～8％。
(4)使用DNS法测葡萄糖浓度，具体方法为：每12h取样，10000rpm下离心1min，取1μL上清液，加至990μL纯水中稀释100倍，取125μL稀释后样品，加至125μL的DNS中，得到混合溶液于90℃水浴加热5min，再冰浴5min，加入2mL纯水，取200μL加至酶标板，540nm分光光度测得吸光度，对应标准曲线得到葡萄糖浓度。
当糖浓度降至20g/L时，开始间歇流加高浓度的葡萄糖溶液，控制补加后葡萄糖浓度维持在60g/L左右。发酵至96h，补入等量无机盐。
(5)每12h取样，并进行生物量、油脂总量和油脂组分鉴定分析。
图1显示了高糖驯化第10代后多不饱和脂肪酸含量变化。其中油脂中EPA比例有较明显提升，60g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为0.74％，提升最多，相较原始菌株比例提高115％。油脂中DHA比例提升明显，180g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为34.21％，提升最多，相较原始菌株提高17.5％。油脂中DPA比例提升明显，60g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为7.84％，提升最多，相较原始菌株提高18.12％。而C16∶0的比例则有明显降低。
图2显示了高糖驯化第20代后多不饱和脂肪酸含量变化。其中油脂中EPA比例有较明显提升，150g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为1.16％，提升最多，相对原始菌株比例提高204.14％。油脂中DHA比例提升明显，120g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为33.34％，提升最多，相较于原始菌株提高18.12％。油脂中DPA比例提升明显，180g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为8.08％，提升最多，相较于原始菌株提高23.92％。而C16∶0的比例则有明显降低。
图3显示了高糖驯化第30代后多不饱和脂肪酸含量变化。其中油脂中DHA比例提升较少，180g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为30.87％，提升最多，相对原始菌株比例提高6.95％。油脂中EPA比例降低，180g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为0.32％，降低最多，相较于原始菌株降低13.75％。油脂中DPA比例提升，180g/L葡萄糖驯化菌株比例含量为7.25％，提升最多，相较于原始菌株提高11.14％。而C16∶0的比例则有提升。
图4中显示，在3.5L发酵罐发酵培养中，驯化菌株相较原始菌株在整个生长期内有更高的生物量，驯化菌株24h后处于对数生长期，在180h生物量达到峰值261.3g/L，相较于原始菌株127.45g/L提升了105％。驯化菌株相较原始菌株有更高的油脂总量，驯化菌株在120h油脂总量达到峰值94.6g/L，相较于原始菌株在214h的峰值81.9g/L提升了15.5％。高糖驯化可以影响裂殖壶菌对葡萄糖的摄入量和代谢途径，明显提高驯化菌株的生物量和油脂总量，提升多不饱和脂肪酸的产量。3.5L发酵罐发酵培养下驯化菌株的DHA和EPA比例含量都明显高于原始菌株，且随时间推移逐渐增大。DHA的比例含量在214h达到最大值38.68％，产量在192h达到最大值34.89g/L，EPA的比例含量在214h达到最大值1.91％，产量在192h达到最大值1.74g/L。
由上述实施例可知，高糖驯化显著优化PUFAs比例，10代驯化中60g/L葡萄糖驯化菌株和20代的中150g/L葡萄糖驯化菌株在产油脂中EPA和DPA的比例有显著的提升，油脂中DHA的比例显示随着糖浓度增高而增高的趋势。高糖驯化对于油脂中C16∶0的比例有降低作用。高糖驯化到30代，驯化菌株出现退化，未显著优化PUFAs比例。驯化菌株采用3.5L发酵罐进行补料发酵培养，生物量和油脂总量可达261.3g/L和94.6g/L，相较于原始菌株提升了105％和15.5％。其中DHA占总油脂比例38.68％，产量34.89g/L，EPA的比例1.91％，产量1.74g/L。驯化菌株发酵培养后的DHA和EPA比例含量和产量都明显高于原始菌株。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (9)
1.一种驯化裂殖壶菌产油脂的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）将保存在甘油管中的裂殖壶菌以2~10%的接种量接种至pH为6.4~6.6的新鲜的种子培养基中，于温度27~29℃及转速180~220rpm的条件下培养45~50h，获得一级种子；
（2）将上述一级种子以4~6%的接种量接种至pH为6.4~6.6的新鲜的种子培养基中，于温度27~29℃及转速180~220rpm的条件下培养45~50h，获得二级种子；
（3）将上述二级种子接种至pH为6.4~6.6且葡萄糖的含量为30~180g/L的第一级高糖驯化培养基中进行驯化培养获得第一代后，进行连续传代的驯化培养，每驯化培养9~11代，接种至葡萄糖的含量高30g/L且pH为6.4~6.6的下一级高糖驯化培养基中继续进行连续传代的驯化培养，直至葡萄糖的含量达到90~210g/L，再进行连续驯化培养9~11代，获得高糖驯化菌株；
该步骤中各培养的条件如下：接种量为2~10%，培养温度为27~29℃，转速180~220rpm，培养时间为45~50h；各上述高糖驯化培养基由上述种子培养基添加葡萄糖而成；
（4）将上述高糖驯化菌株接种至发酵罐中的发酵培养基扩大培养10~12d，期间分析不同时期内的油脂组分。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）为：将保存在甘油管中的裂殖壶菌以2~10%的接种量接种至pH为6.5的新鲜的种子培养基中，于温度28℃及转速200rpm的条件下培养48h，获得一级种子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）为：将上述一级种子以5%的接种量接种至pH为6.5的新鲜的种子培养基中，于温度28℃及转速200rpm的条件下培养48h，获得二级种子。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中各培养的条件如下：接种量为2~10%，培养温度为28℃，转速200rpm，培养时间为48h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）包括：
a、将所述高糖驯化菌株接入发酵罐中的发酵培养基扩大培养10~12d，用水杨酸法监测糖量，当糖浓度过低时，间歇流加葡萄糖溶液，发酵至中期，即95~97h时，通过加料口补入无机盐；
b、每11~13 h取样，进行生物量、油脂总量和油脂组分鉴定分析。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的配方包括：酵母粉9~11 g/L、硫酸钠11~13 g/L、氯化钾0.4~0.6 g/L、硫酸镁1.8~2.2 g/L、硫酸钾0.60~0.70 g/L、磷酸二氢钾0.8~1.2 g/L、硫酸铵0.8~1.2g/L、二水合氯化钙0.16~0.18g/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述种子培养基的配方包括：酵母粉10 g/L、硫酸钠12 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸镁2 g/L、硫酸钾0.65 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸铵1g/L、二水合氯化钙0.17 g/L。
8.如权利要求1至5中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖88~92g/L、谷氨酸钠4.8~5.1 g/L、固体玉米浆粉4.8~5.1g/L、硫酸钠11~13 g/L、氯化钾0.45~0.55g/L、硫酸镁1.9~2.1g/L、硫酸钾0.60~0.70 g/L、磷酸二氢钾0.8~1.1g/L、硫酸铵0.8~1.1 g/L、二水合氯化钙0.16~0.18 g/L、七水合硫酸锌2.9~3.1 mg/L、六水合氯化钴0.035~0.042 mg/L、五水合硫酸铜1.9~2.1 mg/L、六水合硫酸镍1.9~2.1 mg/L、七水合硫酸铁9.5~10.3 mg/L、泛酸钙3.15~3.25 mg/L、四水合氯化锰2.9~3.1 mg/L、二水合钼酸钠0.035~0.042 mg/L、维生素B1 9.4~9.6 mg/L、维生素B12 0.14~0.16 mg/L。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基的配方包括：葡萄糖90 g/L、谷氨酸钠5 g/L、固体玉米浆粉5 g/L、硫酸钠12 g/L、氯化钾0.5 g/L、硫酸镁2 g/L、硫酸钾0.65 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸铵1 g/L、二水合氯化钙0.17 g/L、七水合硫酸锌3 mg/L、六水合氯化钴0.04 mg/L、五水合硫酸铜2 mg/L、六水合硫酸镍2 mg/L、七水合硫酸铁10mg/L、泛酸钙3.2 mg/L、四水合氯化锰3 mg/L、二水合钼酸钠0.04 mg/L、维生素B1 9.5 mg/L、维生素B12 0.15 mg/L。
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