CN112481189B - 一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用。所述方法包括：在驯化过程中，以总碳量计，碳源浓度维持在5～20g/L；以总氮量计，氮源浓度维持在0.5～3g/L，且使用的氮源为由无机氮源与有机氮源构成的全合成氮源；同时，在驯化过程中，不断排出发酵液保持发酵体系的体积不变。本发明通过限制发酵液环境中的碳源和氮源浓度，并以补充无机氮源为主，给裂殖壶菌创造一定的环境压力进行驯化，和现有技术相比，在驯化20天后，可以有效提高裂殖壶菌的细胞密度，并且使得裂殖壶菌的DHA产量相较于驯化培养前有所提升，在提高裂殖壶菌的产油量方面具有重要意义。

Description

一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，尤其涉及一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用。
背景技术
微生物规模化发酵技术需要通过一系列较为复杂的精细调控使得发酵的结果达到一个比较理想效果，实际上，为了进一步提高微生物发酵产量或者降低成本，研究人员往往需要对培养基或者工艺条件进行调控，然而，在培养基或者工艺调整后，微生物容易表现出不适应新的培养基或者新的工艺条件，导致调整工艺难以达到预期的提高产量或者降低成本的作用，由于菌株的不同的特性，往往需要反复多次进行不同的工艺调整及摸索才能达到其理想效果。而规模化发酵中，工艺调整的过程会耗费大量研发时间和人力及物力，并且有可能由于菌株自身的特性即使外部条件调控过后也无法达到理想效果。针对这一情况，本领域技术人员往往采用微生物驯化的方式，使得菌株能够快速适应新发酵环境的改变，能够减轻工艺上的负担。
微生物驯化是指驯化微生物的行为。在微生物培养过程，循序渐进地改变培养基的浓度或者种类，不适应新环境的细胞会生长非常缓慢，适应环境的细胞可以逐步恢复至之前的生长速率，通过这种方式，最终可以达到改善或改变环境中的有效成分。
目前的驯化工作基本都是通过多次独立或分级的传代，使微生物逐步适应某一条件，例如CN109913513B中对裂殖壶菌进行高糖驯化，采用的即为分批次的驯化方式，但是这种驯化方法并无法准确反应整体的发酵情况，需要花费大量时间进行传代、验证的工作，可能出现即使在摇瓶中指标良好，工艺放大以后又会出现效果变差，需要重新对工艺进行优化。
发明内容
为了至少解决一种现有技术存在的问题，本发明提供一种驯化裂殖壶菌的方法及其应用，在直接模拟工业发酵环境的条件下，限制发酵液环境中的碳源和氮源浓度，摒弃天然组分氮源使用由无机氮源与有机氮源构成的全合成氮源，给裂殖壶菌创造一定的环境压力进行驯化培养，可以有效提高裂殖壶菌的生物量，和生产DHA的效率，并且将驯化和工艺调控结合，实现驯化后的菌种可直接应用于工业生产的目的。
第一方面，本发明提供一种驯化裂殖壶菌方法，在驯化过程中，以葡萄糖计，碳源浓度维持在5～20g/L；以总氮量计，氮源浓度维持在0.5～3g/L，且使用的氮源为由无机氮源和/或有机氮源构成的全合成氮源；
同时，在驯化过程中，不断排出发酵液保持发酵体系的体积不变。
进一步地，在驯化过程中，所述无机氮源包括磷酸氢二铵、氨水、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠或硫酸铵中的一种或几种；所述有机氮源包括丙氨酸或其盐、谷氨酸或其盐、脯氨酸或其盐或尿素中的一种或几种；
在一个优选的实施例中，无机氮源为磷酸氢二铵；
在一个优选的实施例中，氮源中，磷酸二氢铵：丙氨酸或其盐：谷氨酸或其盐：脯氨酸或其盐的质量比为(18-40)：(0.01-0.5)： (0.03-15)：(0.05-0.5)；
所述碳源包括葡萄糖、甘油或糖蜜中的一种或几种。
进一步地，在驯化过程中，还添加维生素和无机盐，所述发酵液中维生素及无机盐组分维持如下浓度：50-100ppm维生素B1、 50-100ppm维生素B2、50-100ppm维生素B5、50-100ppm生物素、 0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、0.05-0.5g/L 硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和0.02-0.2g/L硫酸铜。
过程中的各组分的含量或者浓度均可采用在线或者人工检测进行监控。
目前的驯化工作基本都是通过多次独立或分级的传代，使微生物逐步适应某一条件，但单独传代一般需要驯化5代以上，在一些现有方案中甚至需要驯化20代以上，驯化时间非常长。发酵工业中天然组分氮源与无机氮源等合成氮源相比，来源广泛，成分复杂，会给微生物提供额外的多种营养成分，因此目前的发酵培养中都是使用天然组分氮源或者天然组分氮源混合无机或有机氮源进行微生物发酵)，但天然组分氮源批次间的质量不稳定会造成生产指标的波动。本发明从发酵培养基本身入手，采用无机氮源等合成氮源取代常规使用的天然组分氮源连续不断地添加至发酵体系中，给予裂殖壶菌环境压力进行驯化，能够显著提高了裂殖壶菌驯化效率，并且得到的菌株能快速适应放大生产，能够提高裂殖壶菌的DHA生产效率。
本发明中的裂殖壶菌在产业化的应用中一直采用的主要成分为天然组分氮源进行发酵，发酵培养基为葡萄糖40-80g/L、谷氨酸钠 20-40g/L、酵母浸膏8-15g/L、氯化钠10-20g/L、硫酸镁5-10g/L、磷酸二氢钾5-10g/L和氯化钙0.5-1g/L。在本发明中，裂殖壶菌首先利用此培养基作为初始发酵培养基，发酵至裂殖壶菌至稳定期，对应的细胞密度(菌浓)为45％以上，开始以磷酸氢二铵作为唯一无机氮源的后续驯化工作。
进一步地，所述排出发酵液的速度为每小时排出所述发酵体系体积的1/800～1/300。保持该发酵液排出速度可以既保持菌体不被排空，又能保证较高的驯化速率。
进一步地，所述驯化的条件为：所述发酵驯化的条件为：温度 25～30℃，搅拌转速100～300转/分钟，通气量1～2vvm。
进一步地，驯化持续至发酵液中所述裂殖壶菌的细胞密度，保持稳定，本发明中细胞密度用菌浓来表示。
保持稳定可以理解为菌浓在一定时间内波动较小，例如从当前时间开始24小时内菌浓的变化不超过2％±5％。
进一步地，在所述裂殖壶菌的菌浓保持稳定后，接种至如下成分的发酵培养基中进行培养：
葡萄糖40-80g/L、磷酸氢二铵18-40g/L、丙氨酸或其盐0.01-0.5g/L、谷氨酸或其盐0.03-15g/L、脯氨酸或其盐0.05-0.5g/L、50-100ppm维生素B1、50-100ppm维生素B2、50-100ppm维生素B5、50-100ppm 生物素、0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、 0.05-0.5g/L硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和 0.02-0.1g/L硫酸铜。
进一步地，所述裂殖壶菌的接种量为所述发酵体系体积的 5％～10％。
进一步地，在所述驯化前还包括种子活化培养和种子扩大培养。所述种子活化培养包括：将裂殖壶菌接种于活化培养基中振摇培养获得种子活化培养液；后接种到活化培养基中培养，培养温度25-28℃，摇床振摇转速为150-250r/min，培养时间40-48h，所述活化培养基为：葡萄糖10-20g/L，谷氨酸或其盐20-30g/L、酵母浸膏5-10g/L、氯化钠10-20g/L和硫酸镁0.5-1g/L，pH自然。
所述种子扩大培养包括：将活化后的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液；扩大培养基包括如下组分：葡萄糖30-50g/L、谷氨酸或其盐10-30g/L、酵母浸膏5-10g/L、氯化钠 10-20g/L、硫酸镁5-10g/L、磷酸二氢钾5-10g/L和氯化钙0.5-1g/L， pH自然。
本发明进一步提供一种用于驯化裂殖壶菌的培养基，包括：
葡萄糖40-80g/L、18-40g/L磷酸氢二铵、丙氨酸或其盐0.01-0.5g/L、谷氨酸或其盐0.03-15g/L、脯氨酸或其盐0.05-0.5g/L、50-100ppm维生素B1、50-100ppm维生素B2、50-100ppm维生素B5、50-100ppm生物素、0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、0.05-0.5g/L 硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和0.02-0.1g/L硫酸铜。
本发明进一步提供所述方法和所述培养基在提高裂殖壶菌生产 DHA效率中的应用。
本发明具备如下有益效果：
本发明通过限制裂殖壶菌培养过程中的碳源和氮源浓度，摒弃天然组分氮源使用由无机氮源与有机氮源构成的全合成氮源，给裂殖壶菌创造一定的环境压力进行驯化，使得裂殖壶菌不断适应新的环境条件，并且淘汰不适宜该环境条件的菌株完成对裂殖壶菌的驯化。该方法和现有技术的阶段式驯化过程相比显著缩短驯化时间至20天左右，并且同时可以提高裂殖壶菌生产DHA的效率，和驯化前相比，生产 DHA效率提高了50％以上，并且驯化后的菌种可直接应用于工业生产的目的，在菌株驯化领域有重要意义。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中所用的裂殖壶菌菌株号为CCTCCM2019990，由于裂殖壶菌属发酵产物的普遍特性，本发明中不涉及裂殖壶菌的某些特殊代谢产物，本领域技术人员应当能够得知，本驯化方法对于裂殖壶菌具有普适性。
实施例1
本实施例提供一种驯化裂殖壶菌的方法，所采用的的裂殖壶菌为CCTCCM2019990，公开于专利CN201911399018.2，具体流程如下：
1、种子活化培养：将裂殖壶菌菌株接种于活化培养基中振摇培养获得种子活化培养液；将裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为150r/min，培养时间40h，所述活化培养基为：葡萄糖15g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
2、种子扩大培养：将上述步骤振摇培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液；摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠25g/L、酵母浸膏8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁 5g/L、磷酸二氢钾5g/L和氯化钙0.5g/L，pH自然。
3、发酵罐培养：当种子扩大培养液的菌浓达到10％(体积浓度) 时，接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积为50L，装液量为60％，接种量5％(体积比)，发酵罐温度28℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1L，罐压0.05Mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖40g/L、谷氨酸钠 30g/L、酵母浸膏8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁5g/L、磷酸二氢钾5g/L 和氯化钙0.5g/L，pH自然。
培养过程取样测菌浓，发酵至40h时菌液浓度稳定达到54％并呈现持续稳定状态。
4、菌株驯化
驯化过程:以100mL/h匀速排出发酵罐中培养液，同时补加驯化培养基。其中维生素与无机盐成分为：100ppm维生素B1、100ppm B2、 100ppm B5、100ppm生物素、0.1g/L氯化钙、0.1g/L硫酸镁、1g/L磷酸二氢钾、0.05g/L硫酸亚铁、0.1g/L硫酸锌、0.1g/L氯化钠和0.05g/L硫酸铜，维生素与无机盐成分配置成设计含量20倍的浓度进行补加，直至发酵液中无机盐与维生素成分达到驯化培养基设计含量。
氮源成分为磷酸氢二铵：丙氨酸：谷氨酸钠：脯氨酸的比例(质量比)为25:0.2:8:0.2，在添加时配置成较高的浓度进行持续补充，控制氮源(总氮量计)浓度维持在0.5-3g/L，直至驯化结束。
碳源优选为葡萄糖，持续补充并控制葡萄糖的浓度维持在10g/L，直至驯化结束。
另外根据需要补加水、酸或碱，确保培养液液面保持不变，pH 维持在6.5左右。开始补充驯化培养基时，记为0h，后每隔24小时统计一次细胞密度，得到如表1所示的结果。
表1驯化过程中菌浓值的变化
驯化时间 菌浓(％) 驯化时间 菌浓(％)
0 52 264 26
24 52 288 28
48 48 312 34
72 44 336 40
96 40 360 44
120 33 384 46
144 27 408 51
168 25 432 54
192 22 456 55
216 25
240 26
整体来看，菌种浓度呈现先逐渐下降，并且在较低水平维持一段时间，然后逐渐上升并且达到甚至高于初始菌浓的过程，整个过程持续10～30天。而从408-456h的菌浓值来看，生物量已呈现稳定，此时得到的菌株可作为驯化后的菌株进行后续的发酵培养。
5、后续发酵培养：将驯化后的菌液作为种子液进行发酵培养，发酵罐体积为50L，上样量为60％，接种量5％(体积比)，发酵罐温度28℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1L，罐压0.5Mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的培养基为：葡萄糖40g/L，32g/L磷酸氢二铵，丙氨酸0.5g/L，谷氨酸钠8g/L，脯氨酸0.5g/L，100ppm维生素B1，100ppm维生素B2，100ppm 维生素B5，100ppm生物素，0.1g/L氯化钙，0.1g/L硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾、0.05g/L硫酸亚铁、0.1g/L硫酸锌、0.1g/L氯化钠、0.05g/L硫酸铜。
最终得到的发酵液中生物量为115g/L，总油含量为55.0％，DHA 产量为34.7g/L。
多批次驯化结果验证：
采用以上相同方法对驯化过程进行验证，驯化三批的驯化结果及在50L的发酵罐上发酵结果如下，表2：
表2：不同批次裂殖壶菌驯化结果
批次 驯化时间(h) 菌浓(％) 生物量g/L 总油％ DHA产量g/L
1 456 53 115 53.0 33.5
2 504 56 120 54.2 35.7
3 432 54 111 55.8％ 34.6
实施例2
本实施例提供一种驯化裂殖壶菌的方法，具体流程如下：
种子活化培养、种子扩大培养步骤与实施例1相同，不同之处在于：
发酵罐培养：当种子扩大培养液的菌浓达到10％(体积浓度)时，接种到发酵罐中进行发酵培养，发酵罐体积为50L，上样量为60％，接种量5％(体积比)，发酵罐温度30℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1.5vvm(L/L.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为 1.5L，罐压0.5Mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖60g/L、谷氨酸或其盐40g/L、酵母浸膏8g/L、氯化钠10g/L、硫酸镁10g/L、磷酸二氢钾10g/L和氯化钙1g/L，pH自然。
培养过程取样测菌浓，发酵至32h时菌液菌浓稳定达到47％并呈现持续稳定状态。
4、菌株驯化
驯化过程:以60mL/h匀速排出发酵罐中培养液，同时补加驯化培养基。其中维生素与无机盐成分为：50ppm维生素B1、50ppm维生素B2、50ppm维生素B5、50ppm生物素、0.5g/L氯化钙、0.5g/L硫酸镁、 1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸亚铁、0.3g/L硫酸锌、1g/L氯化钠和0.1g/L 硫酸铜，维生素与无机盐成分配置成设计含量20倍的浓度进行补加，直至发酵液中无机盐与维生素成分达到筛选培养基设计含量。
氮源成分为磷酸氢二铵：丙氨酸：谷氨酸钠：脯氨酸的比例(质量比)为36:0.01:0.03:0.05，在添加时配置成较高的浓度进行持续补充，控制氮源(总氮量计)浓度维持在0.5-3g/L，直至驯化结束。
碳源优选为葡萄糖，持续补充并控制葡萄糖的浓度维持在20g/L，直至驯化结束。
另外根据需要补加水、酸或碱，确保培养液液面保持不变，pH 维持在6.5左右。开始补充驯化培养基时，记为0h，此时菌浓为50％，后每隔24小时统计一次菌株的菌浓值，经过504h后得到稳定的生物量，此时菌浓值为48％。
5、后续发酵培养：将驯化后的菌液作为种子液进行发酵培养，发酵罐体积为50L，上样量为60％，接种量5％(体积比)，发酵罐温度28℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1L，罐压0.5Mpa，并在发酵过程中通过流加碳源来控制发酵液中碳源浓度在10g/L，所述发酵罐中的培养基为：葡萄糖60g/L，磷酸氢二铵38g/L，丙氨酸0.01g/L，谷氨酸钠0.03g/L，脯氨酸0.05g/L，50ppm维生素B1，50ppmB2，50ppmB5， 50ppm生物素，0.5g/L氯化钙，0.5g/L硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾、0.1g/L硫酸亚铁、0.3g/L硫酸锌、1g/L氯化钠、0.1g/L硫酸铜。
最终得到的发酵液中生物量为110g/L，总油含量为56.0％，DHA 产量为33.2g/L。
多批次驯化结果验证：
采用以上相同方法对驯化过程进行验证，驯化两批的驯化结果及在50L的发酵罐上发酵结果如下，表3 ：
表3 ：不同批次裂殖壶菌驯化结果
批次 驯化时间(h) 菌浓(％) 生物量g/L 总油％ DHA产量g/L
1 528 50 113 55.0 32.3
2 504 49 112 55.5 32.3
实施例3
本实施例将实施例1的驯化后的发酵体系进行放大规模化实验，在12m3发酵罐进行批次实验，得到的规模化发酵的结果如表4 所示。
表4 多批次规模化发酵结果
Figure BDA0002869174960000101
实施例4
本实施例的驯化流程和实施例1相同，区别仅在于，驯化过程的氮源成分为硫酸铵，添加时配置成较高的浓度进行持续补充，控制氮源(总氮量计)浓度维持在0.5-3g/L，直至驯化结束。
从结果可以看出，在改变驯化培养基的组成成分后，驯化48小时，微生物的菌浓值小于实施例1。
表5 实施例4驯化过程中菌株的菌浓值变化
驯化时间 菌浓(％)
0 51
432 40
456 43
480 43
实施例5
本实施例的驯化流程和实施例1相同，区别仅在于，驯化培养基变更为：驯化过程的氮源成分为尿素：丙氨酸：谷氨酸钠：脯氨酸的比例为9:0.2:8:0.2，在添加时配置成较高的浓度进行持续补充，控制氮源(总氮量计)浓度维持在0.5-3g/L，直至驯化结束。
从结果可以看出，在改变驯化培养基的组成成分后，驯化接近480 小时，微生物的菌浓值和实施例1类似。
表6 对比例3驯化过程中菌株的菌浓值变化
驯化时间 菌浓(％)
0 50
432 48
456 49
后续发酵步骤中的培养基为：葡萄糖40g/L，14.5g/L尿素，丙氨酸0.5g/L，谷氨酸钠8g/L，脯氨酸0.5g/L，100ppm维生素B1，100ppmB2， 100ppmB5，100ppm生物素，0.1g/L氯化钙，0.1g/L硫酸镁，1g/L磷酸二氢钾、0.05g/L硫酸亚铁、0.1g/L硫酸锌、0.1g/L氯化钠、0.05g/L硫酸铜。
同实施例1后续发酵培养的方法进行发酵，得到的发酵液中生物量为103g/L，总油含量为48％，DHA产量为25.6g/L，由此可见，虽然微生物的菌浓值和实施例1类似，但是其产油量和DHA产量要显著小于实施例1。
对比例1
本实施例采用的未经过驯化的菌株，活化和扩大培养过程和实施例1中的相同，后续发酵培养过程中的发酵培养基为发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾5g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。其他条件不变，得到的发酵液中生物量为100g/L，总油含量为52％，DHA产量为 30.0g/L。
对比例2
本对比例的整体流程和实施例1相同，区别在于采用未经驯化的菌株，直接使用筛选后发酵培养基进行培养。
最终得到的发酵液中生物量为89g/L，总油含量为50％，DHA产量为20.2g/L。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种驯化裂殖壶菌的方法，其特征在于，在驯化过程中，以总葡萄糖计，碳源浓度维持在5~20g/L；以总氮量计，氮源浓度维持在0.5~3g/L，且使用的氮源为由无机氮源和/或有机氮源构成的全合成氮源；
同时，在驯化过程中，不断排出发酵液保持发酵体系的体积不变。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机氮源包括磷酸氢二铵、氨水、硝酸铵、硝酸钾、硝酸钠或硫酸铵中的一种或几种；所述有机氮源包括丙氨酸或其盐、谷氨酸或其盐、脯氨酸或其盐或尿素中的一种或几种。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述无机氮源为磷酸氢二铵。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，氮源中磷酸氢二铵：丙氨酸或其盐：谷氨酸或其盐：脯氨酸或其盐的质量比为（18-40）：（0.01-0.5）：（0.03-15）：（0.05-0.5）。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、甘油或糖蜜中的一种或几种。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在驯化过程中，还添加维生素和无机盐，所述发酵液中维生素及无机盐组分维持如下浓度：50-100ppm维生素B1、50-100ppm维生素B2、50-100ppm 维生素B5、50-100ppm生物素、0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、0.05-0.5g/L硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和0.02-0.2g/L硫酸铜。
7.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述排出发酵液的速度为每小时排出所述发酵体系体积的1/800~1/300。
8.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述驯化的条件为：温度25~30℃，搅拌转速100~300转/分钟，通气量1~2 vvm。
9.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，驯化持续至发酵液中所述裂殖壶菌的细胞密度保持稳定。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在所述裂殖壶菌的细胞密度保持稳定后，接种至如下成分的发酵培养基中进行培养：
葡萄糖40-80g/L、磷酸氢二铵18-40g/L、丙氨酸或其盐0.01-0.5g/L、谷氨酸或其盐0.03-15 g/L、脯氨酸或其盐0.05-0.5g/L、50-100ppm维生素B1、50-100ppm维生素B2、50-100ppm 维生素B5、50-100ppm生物素、0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、0.05-0.5g/L硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和0.02-0.1g/L硫酸铜。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂殖壶菌的接种量为所述发酵体系体积的5%~10%。
12.一种裂殖壶菌的培养基，其特征在于，由如下成分组成：葡萄糖40-80g/L、18-40g/L磷酸氢二铵、丙氨酸或其盐0.01-0.5g/L、谷氨酸或其盐0.03-15 g/L、脯氨酸或其盐0.05-0.5g/L、50-100ppm维生素B1、50-100ppm维生素B2、50-100ppm 维生素B5、50-100ppm生物素、0.1-1g/L氯化钙、0.1-1g/L硫酸镁、0.5-5g/L磷酸二氢钾、0.05-0.5g/L硫酸亚铁、0.03-0.3g/L硫酸锌、0.1-1g/L氯化钠和0.02-0.1g/L硫酸铜。
13.权利要求1-11任一项所述的方法，或权利要求12所述的培养基在提高裂殖壶菌生产DHA效率中的应用。
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