CN108285915B

CN108285915B - 赤霉酸的发酵方法

Info

Publication number: CN108285915B
Application number: CN201810048112.2A
Authority: CN
Inventors: 刘健; 杨宝强; 沈颂娣; 熊仁科; 齐昊; 景飞江
Original assignee: Sichuan Lomon Bio Technology Co ltd
Current assignee: Sichuan Lomon Bio Technology Co ltd
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2038-01-18
Also published as: CN108285915A

Abstract

本发明提供了一种赤霉酸的发酵方法，包括：将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液；在发酵过程中当溶氧高于20％时，补加葡萄糖与植物油。与现有技术相比，本发明在发酵过程中采用糖油混补，提高了产酸量，同时以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；再者，添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

Description

赤霉酸的发酵方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，尤其涉及一种赤霉酸的发酵方法。

背景技术

赤霉酸是通过一种赤霉菌发酵培养代谢得到的一类次级代谢产物，被分离、鉴定和命名的一种有116种，其中在农业中应用最广泛的就是GA₃，在我国农业生产中发挥着巨大的作用。

GA₃具有非常高的植物调节活性，对各种农作物的生长和发育都有很明显的调节作用。在北方，GA₃主要应用于葡萄、红枣、山楂、油桃等经济作物上，在花期喷洒一定浓度赤霉酸溶液可以有效提高果树的坐果率，促进果实生长发育，果树产量提高20％～30％左右。在南方，赤霉酸主要应用于杂交水稻制种上，调节水稻父母本在同一时间开花，使母本授粉率大幅提高，进一步提高了杂交水稻种子的产量，降低了种子的生产成本，为农民减轻了负担。

现有赤霉酸的制备通常采用液体深层发酵法，在发酵过程中采用分批/流加豆油或葡萄糖等方式，得到的发酵产酸较高水平为2800～3000ppm，但其仍有待提高。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种赤霉酸的发酵方法，该发酵方法产量较高且稳定。

本发明提供了一种赤霉酸的发酵方法，包括：

将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液；所述发酵罐中的发酵培养基，包括：玉米蛋白粉10～40g/L；磷酸二氢钾1～10g/L；小分子有机碳源5～30g/L；植物油0.5～5g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸铵0.5～2g/L；微量元素0.1～1g/L；在发酵过程中当溶氧高于20％～30％时，补加葡萄糖与植物油。

优选的，所述发酵的温度为28℃～30℃；所述发酵的时间为8～10天；所述发酵的pH值为5.0～5.2。

优选的，所述发酵的压力为0.01～0.05MPa；所述发酵的空气流量为2000～3000Nm³/h。

优选的，所述葡萄糖与植物油的质量比为(1～3)：1。

优选的，所述葡萄糖以葡萄糖溶液的形式添加；所述葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为40％～50％；所述葡萄糖溶液与植物油的体积比为(2～4)：1。

优选的，所述小分子有机碳源选自蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种。

优选的，所述小分子有机碳源为蔗糖与葡萄糖。

优选的，所述蔗糖与葡萄糖的质量比为(1～2)：(2～1)。

优选的，所述微量元素包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴。

优选的，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)。

本发明提供了一种赤霉酸的发酵方法，包括：将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液；所述发酵罐中的发酵培养基，包括：玉米蛋白粉10～40g/L；磷酸二氢钾1～10g/L；小分子有机碳源5～30g/L；植物油0.5～5g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸铵0.5～2g/L；微量元素0.1～1g/L；在发酵过程中当溶氧高于20％时，补加葡萄糖与植物油。与现有技术相比，本发明在发酵过程中采用糖油混补，提高了产酸量，同时以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；再者，添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种赤霉酸的发酵方法，包括：将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液；所述发酵罐中的发酵培养基，包括：玉米蛋白粉10～40g/L；磷酸二氢钾1～10g/L；小分子有机碳源5～30g/L；植物油0.5～5g/L；硫酸镁0.5～2g/L；硫酸铵0.5～2g/L；微量元素0.1～1g/L；在发酵过程中当溶氧高于20％时，补加葡萄糖与植物油。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

所述赤霉酸的种子液为本领域技术人员熟知的种子液即可，并无特殊的限制；所述种子液的湿重优选为30％～40％。

按照本发明，所述赤霉酸的种子液优选按照以下方法进行制备：S1)将冷冻保藏的GA₃菌种接入至种子培养基中进行摇瓶培养，得到悬浮液；所述种子培养基包括5～15g/L第一有机氮源、5～15g/L第一小分子有机碳源、1～5g/L磷酸二氢钾、0.1～1g/L硫酸镁与0.1～1g/L聚丙二醇；S2)将所述悬浮液转入种子罐中进行发酵培养，得到种子液；所述种子罐的培养基包括5～15g/L第二有机氮源、5～15g/L第二小分子有机碳源、1～5g/L磷酸二氢钾、0.1～1g/L硫酸镁与0.1～1g/L聚丙二醇。

本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。

将冷冻保藏的GA₃菌种接种至种子培养基中进行摇瓶培养，得到悬浮液；所述种子培养基包括5～15g/L第一有机氮源、5～15g/L第一小分子有机碳源、1～5g/L磷酸二氢钾、0.1～1g/L硫酸镁与0.1～1g/L聚丙二醇，优选包括8～12g/L第一有机氮源、8～12g/L第一小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.3～0.8g/L硫酸镁与0.3～0.8g/L聚丙二醇，更优选包括9～11g/L第一有机氮源、9～11g/L第一小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.5～0.7g/L硫酸镁与0.4～0.5g/L聚丙二醇，再优选包括10g/L第一有机氮源、10g/L第一小分子有机碳源、3g/L磷酸二氢钾、0.6g/L硫酸镁与0.5g/L聚丙二醇；所述第一有机氮源为本领域技术人员熟知的有机氮源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大豆蛋白、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉与鱼粉中的一种或多种；有机氮源在微生物分泌的蛋白酶的作用下，分解成氨基酸，被菌体吸收后作为菌体蛋白质等的组成部分，并且有机氮源除提供菌体生长繁殖的营养外，还可作为产物前体；所述第一小分子有机碳源为本领域技术人员熟知的小分子有机碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种；小分子有机碳源可为微生物细胞的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的碳成分，还可为合成目的产物提供所需的碳成分；培养基中磷酸二氢钾用以提供磷元素，磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递着-三磷酸腺苷(ATP)的成分，在代谢途径的调节方面，磷也起着很重要的作用，其有利于糖代谢的进行，因此可促进微生物的生长；本发明中所用的硫酸镁为本领域技术人员熟知的硫酸镁即可，并无特殊的限制，本发明中优选为七水硫酸镁；硫酸镁用以提供镁元素，镁元素是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成及磷酸盐的转化等；聚丙二醇(PPG)其在培养基中作为消泡剂使用，可避免因气泡引起的逃液流失营养剂菌体，并且逃液也会增加染菌风险；所述摇瓶培养的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中所述摇瓶培养的温度优选为28℃～30℃，更优选为28.5℃～29.5℃，再优选为28.8℃～29.2℃；所述摇瓶培养的时间优选为60～80h，更优选为62～75h，再优选为64～70h，再优选为66～70h，最优选为68h。

将所述悬浮液转入种子罐中进行发酵培养；转入的接种量即转入悬浮液与种子罐中培养基的体积比优选为0.01％～0.02％，更优选为0.014％～0.018％，再优选为0.016％～0.018％；所述种子罐的培养基包括5～15g/L第二有机氮源、5～15g/L第二小分子有机碳源、1～5g/L磷酸二氢钾、0.1～1g/L硫酸镁与0.1～1g/L聚丙二醇，优选包括8～12g/L第二有机氮源、8～12g/L第二小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.3～0.8g/L硫酸镁与0.3～0.8g/L聚丙二醇，更优选包括9～11g/L第二有机氮源、9～11g/L第二小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.5～0.7g/L硫酸镁与0.4～0.5g/L聚丙二醇，再优选包括10g/L第二有机氮源、10g/L第二小分子有机碳源、3g/L磷酸二氢钾、0.6g/L硫酸镁与0.5g/L聚丙二醇；所述第二有机氮源为本领域技术人员熟知的有机氮源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大豆蛋白、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉与鱼粉中的一种或多种；所述第二小分子有机碳源为本领域技术人员熟知的小分子有机碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种；在本发明中，该培养基的pH值优选为4.5～5.5，更优选为4.8～5.4，再优选为5～5.2，最优选为5.1，即培养基灭菌前采用硫酸将其pH值调节至上述数值；所述发酵培养的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中其温度优选为28℃～30℃，更优选为28.5℃～29.5℃，再优选为28.8℃～29.2℃；所述发酵培养的时间优选为48～72h，更优选为48～60h，再优选为48～55h，最优选为CO₂升至最高点，下降0.2或2h后结束发酵培养；所述发酵培养的压力优选为0.01～0.05MPa，更优选为0.02～0.04MPa，再优选为0.03～0.04MPa，最优选为0.035MPa；所述发酵培养的空气流量优选为60～70Nm³/h，更优选为62～68Nm³/h，再优选为64～66Nm³/h，最优选为65Nm³/h。

发酵培养结束后，优选进行转种扩大培养，即转入二级种子罐中继续发酵培养，得到种子液；此步骤的接种量优选为二级种子罐培养液质量的10～15％；所述二级种子罐的培养基包括5～15g/L第三有机氮源、5～15g/L第三小分子有机碳源、1～5g/L磷酸二氢钾、0.1～1g/L硫酸镁与0.1～1g/L聚丙二醇，优选包括8～12g/L第三有机氮源、8～12g/L第三小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.3～0.8g/L硫酸镁与0.3～0.8g/L聚丙二醇，更优选包括9～11g/L第三有机氮源、9～11g/L第三小分子有机碳源、2～4g/L磷酸二氢钾、0.5～0.7g/L硫酸镁与0.4～0.5g/L聚丙二醇，再优选包括10g/L第三有机氮源、10g/L第三小分子有机碳源、3g/L磷酸二氢钾、0.6g/L硫酸镁与0.5g/L聚丙二醇；所述第三有机氮源为本领域技术人员熟知的有机氮源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为大豆蛋白、花生饼粉、棉籽饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉与鱼粉中的一种或多种；所述第三小分子有机碳源为本领域技术人员熟知的小分子有机碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种；在本发明中，该培养基的pH值优选为4.5～5.5，更优选为4.8～5.4，再优选为5～5.2，最优选为5.1，即培养基灭菌前采用硫酸将其pH值调节至上述数值；所述继续发酵培养的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制，本发明中其温度优选为28℃～30℃，更优选为28.5℃～29.5℃，再优选为28.8℃～29.2℃；所述继续发酵培养的时间优选为15～25h，更优选为18～25h，再优选为20～24h，最优选为CO₂升至最高点，下降0.2或2h后结束发酵培养；所述发酵培养的压力优选为0.01～0.05MPa，更优选为0.02～0.04MPa，再优选为0.03～0.04MPa，最优选为0.035MPa；所述发酵培养的空气流量优选为600～800Nm³/h，更优选为650～800Nm³/h，再优选为700～800Nm³/h，再优选为740～780Nm³/h，最优选为760Nm³/h。

本发明将冷冻菌种直接接入摇瓶，避免了斜面活化剂在斜面生长过程中出现的菌种变异风险，冷冻管能很好地保持菌种的平行性，从而保证后续扩大生长的稳定性。

本发明所提供的发酵培养基中玉米蛋白粉的含量优选为15～35g/L，更优选为15～30g/L，再优选为20～25g/L，最优选为22g/L。玉米蛋白粉富含丰富的蛋白质，达到50％以上，能够为赤霉素的高密度发酵提供充足的氮源，保证菌体的合成与代谢。

所述磷酸二氢钾的含量优选为3～10g/L，更优选为4～8g/L，再优选为5～7g/L，最优选为6g/L。磷是核酸和蛋白质的必要成分，也是重要的能量传递者-三磷酸腺苷(ATP)的成分，在代谢途径的调节方面，磷也起着很重要的作用，磷有利于糖代谢的进行，因此其可促进微生物的生长。磷作为赤霉素合成过程中必不可少的元素，其缺乏会导致赤霉素前体合成受阻，而本发明提高了磷酸二氢钾的浓度，避免了在发酵过程中添加磷酸二氢钾增加人工、操作成本。

按照本发明，所述小分子有机碳源的含量优选为5～25g/L，更优选为8～15g/L，再优选为8～12g/L，最优选为10g/L；所述小分子有机碳源为本领域技术人员熟知的有机碳源即可，并无特殊的限制，本发明中优选为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉糊精、甘露糖与半乳糖中的一种或多种，更优选为蔗糖与葡萄糖；所述蔗糖与葡萄糖的质量比优选为(1～2)：(2～1)，更优选为(1～1.5)：(1.5～1)，再优选为(1～1.2)：(1.2～1)，最优选为1：1。在本发明中以小分子有机碳源作为发酵碳源，能够为发酵代谢提供快速、缓效利用的碳源，为微生物细胞的生长繁殖提供能源和合成菌体所必须的碳成分，为合成目的产物提供所需的碳成分。在本发明中，蔗糖的加入避免葡萄糖过多造成赤霉素发酵的反馈抑制，影响赤霉素的合成，蔗糖作为葡萄糖的替代碳源，能够及时分解供菌体代谢，又减少了反馈抑制的发生。

所述植物油的含量优选为1～4g/L，更优选为2～3g/L，再优选为2g/L；所述植物油为本领域技术人员熟知的植物油即可，并无特殊的限制，本发明中优选为色拉油、葵花籽油、亚麻仁油、乙基棕榈油与橄榄油中的一种或多种，但硬脂酸会抑制赤霉素的发酵，因此本发明中更优选为色拉油。植物油能够减少发酵过程中泡沫的产生，避免逃液等现象，进而避免了物料损失、染菌等潜在风险；同时植物油还可为发酵提供碳源，为赤霉素的合成提供碳骨架，加速赤霉素的合成。

本发明提供的用于生产赤霉酸的发酵培养基中硫酸镁的含量优选为0.5～1.5g/L，更优选为0.8～1.2g/L，再优选为1g/L；所述硫酸镁为本领域人员熟知的硫酸镁即可，并无特殊的限制，本发明中优选为七水合硫酸镁。镁元素是许多酶的活化剂，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等。

所述硫酸铵的含量优选为0.5～1.5g/L，更优选为0.8～1.2g/L，再优选为1g/L。

按照本发明，所述微量元素的含量优选为0.2～0.8g/L，更优选为0.2～0.6g/L，再优选为0.3～0.5g/L，最优选为0.39g/L；所述微量元素为本领域技术人员熟知的微量元素即可，并无特殊的限制，本发明优选包括硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴；所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.5～1.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)：(0.1～0.5)，更优选为(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.2～0.4)：(0.2～0.4)：(0.2～0.4)，再优选为1：1：1：0.3：0.3：0.3。添加微量元素的组合物能够满足微生物生长所需的微量元素，全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性，增加某些参与产物合成的酶的活性，使发酵产量明显提高。

在本发明中，所述发酵培养基最优选包括：

本发明提供的发酵培养基以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；同时，前提添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液。所述转入量优选为发酵罐培养液质量的10％～15％；所述发酵的温度优选为28℃～30℃，更优选为28.5℃～29.5℃，再优选为28.8℃～29.2℃；所述发酵的时间优选为8～10天，更优选为8.5～9.5天，再优选为9天；所述发酵的pH值优选为5.0～5.2；开始发酵后，pH值逐步增加，每次增加0.1/半小时，优选流加氨水控制pH为5.0～5.2；所述发酵的压力优选为0.01～0.05MPa，更优选为0.02～0.04MPa，再优选为0.03～0.04MPa，最优选为0.035MPa；所述发酵的空气流量优选为2000～3000Nm³/h，更优选为2000～2800Nm³/h，再优选为2000～2500Nm³/h，最优选为2200～2300Nm³/h。在发酵过程中，溶氧逐步反弹，当溶氧高于20％～30％时，补加葡萄糖与植物油；所述植物油同上所述，在此不再赘述；当补加的葡萄糖为固体时，葡萄糖与植物油的质量比优选为(1～3)：1，更优选为(1.5～2.5)：1，再优选为2：1；当葡萄糖以葡萄糖溶液的形式添加时，所述葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度优选为40％～50％，更优选为42％～48％，再优选为45％～48％；所述葡萄糖溶液与植物油的体积比优选为(2～4)：1，更优选为(2.5～3.5)：1，再优选为(3～3.5)：1，最优选为3.2：1。

本发明提供的发酵方法采用糖油混补，流加工艺，优于单独流加糖或油的发酵产量，增加补油量或单独补油，副产物GA₁增加，但后提取杂质少，单独补糖或补糖多，会导致发酵杂质、杂蛋白等增多。

本发明在发酵过程中采用糖油混补，提高了产酸量，同时以玉米蛋白粉作为有机氮源，其蛋白质含量较高，达50％以上，能够实现赤霉素高密度发酵，且能够避免如花生饼粉产生黄曲霉的隐患，保证菌体的合成与代谢，使其能够快速稳定的发酵；再者，添加植物油不仅能够为发酵提供碳源，还可有效减少发酵气泡逃液等情况的发生，避免了物料损失、染菌等潜在风险；另外，在发酵培养基中添加微量元素能够全面保证微生物生长代谢过程中各类酶与代谢物的活性。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种赤霉酸的发酵方法进行详细描述。

以下实施例中所用的试剂均为市售。

实施例1

1.1将GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶,接种量为摇瓶培养基体积的0.8％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

表1摇瓶培养基配方

1.2将所述悬浮液接种至一级种子罐中，接种量为培养液体积的0.016％，一级种子罐培养基配方见表2。

表2一级种子罐培养基配方

发酵体积：定容1.3t，消后体积按1.5t计(灭菌前加硫酸将pH调整到5.1)。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：65Nm³/h。

转种时间：CO₂升至最高点，下降0.2或2h后转种(48h-72h)。

1.3将一级种子罐培养液接种至二级种子罐中，接种量为培养液体积的8％,二级种子罐培养基配方见表3。

表3二级种子罐培养基配方

发酵体积：定容15t，消后体积16.5t、转后体积18t计(灭菌前加硫酸将pH调整到5.1)。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：760Nm³/h。

转种时间：CO₂升至最高点，下降0.2或2h后(预估20h左右)，得到种子液。

摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表4。

表4摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

31％

4.52

较长

较细

较均匀

少量

++++

一级种子液

16.5％

4.99

较长

较细

较均匀

少量

++++

二级种子液

22.5％

5.53

较长

较细

较均匀

少量

++++

1.4将1.3中得到的种子液按培养液质量的10-15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表5。

表5发酵培养基的配方

发酵体积：定容82t，消后体积90t、转后体积100t计。

发酵温度：29±0.2℃。

运行罐压：0.035MPa。

空气流量：2200Nm³/h。

PH控制：开始运行后，PH逐步增加，每次增加0.1/半小时，流加氨水控制PH 5.0～5.2。

补料控制：溶氧反弹20％，开启自动流加葡萄糖、色拉油，葡萄糖(45％)溶液：油(3.2L:1L)，溶氧控制点20％～30％。

发酵周期：9天。

对实施例1中得到的发酵液进行检测，得到结果见表6与表7。

表6发酵液检测数据

表7发酵液湿重

实施例2

培养基配方及培养条件同实施例1。

补料控制：溶氧反弹20％，开启自动流加葡萄糖(45％)溶液，溶氧控制点20％～30％。

对实施例2中得到的发酵液进行检测，得到结果见表8与表9。

表8发酵液检测数据

表9发酵液湿重

实施例3

培养基配方及培养条件同实施例1。

补料控制：溶氧反弹20％，开启自动流加色拉油，溶氧控制点20％～30％。

对实施例3中得到的发酵液进行检测，得到结果见表10与表11。

表10发酵液检测数据

表11发酵液湿重

实施例4

培养基配方及培养条件同实施例1。

补料控制：溶氧反弹20％，开启自动流加葡萄糖、色拉油，葡萄糖(45％)溶液：色拉油(4L:1L)，溶氧控制点20％～30％。

对实施例4中得到的发酵液进行检测，得到结果见表12与表13。

表12发酵液检测数据

表13发酵液湿重

通过实施例2、3可以看出单独补葡萄糖或色拉油直接影响最终目标产物GA₃的量；再通过实施例4可以看葡萄糖(45％)与色拉油的不同比例最终目标产物GA₃远低于实施例1。所以实施例1补料比例为最佳补料组合，利用实施例1培养基通过批次发酵生产，得到结果见表14。由表14可以看出其能得出稳定的高产的GA₃。

表14GA₃批次生产检测数据

实施例5

5.1将GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶，接种量为摇瓶培养基体积的1.2％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

5.2一级二级种子罐同实施例1。

5.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表15。

表15摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

22％

4.0

长

细

均匀

大量

++

一级种子液

19％

3.99

长

较细

均匀

少量

++

二级种子液

20％

4.58

长

细

较均匀

少量

+++

实施例6

6.1将GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶，接种量为摇瓶培养基体积的0.4％，摇瓶中培养基配方见表1，发酵温度29±0.2℃，摇瓶培养约68h，得到悬浮液。

6.2一级二级种子罐同实施例1

6.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表16。

表16摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

18.5％

4.2

长

较细

较均匀

大量

+++

一级种子液

17.7％

4.33

较长

较细

均匀

大量

+++

二级种子液

18.6％

4.12

长

细

较均匀

大量

+++

比较例1

1.1通过多次活化GA₃保藏菌种斜面取1～2环菌种接至种子摇瓶中，震荡培养；然后将GA₃菌种接种到种子罐中进行培养，得到悬浮液；再将得到的悬浮液继续在种子罐内培养，最后接种到发酵罐内进行发酵，得到发酵液。

1.2摇瓶、一级及二级种子罐培养基和发酵条件同实例1。

1.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表17。

表17摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

25.3％

4.55

较长

细

均匀

大量

+++

一级种子液

16.5％

4.99

长

较细

较均匀

大量

+++

二级种子液

22.5％

5.53

较长

细

均匀

少量

++++

比较例2

2.1通过多次活化GA₃保藏菌种斜面取1～2环菌种接至种子摇瓶中，震荡培养；然后将GA₃菌种接种到种子罐中进行培养，得到悬浮液；再将得到的悬浮液继续在种子罐内培养，最后接种到发酵罐内进行发酵，得到发酵液。

2.2摇瓶、一级及二级种子罐培养基和发酵条件同实例1。

2.3摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据见表18。

表18摇瓶、一级及二级种子罐培养液检测数据

种子罐

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

摇瓶种子液

22.6％

4.71

长

较细

均匀

少量

++++

一级种子液

16.5％

4.99

较长

细

均匀

大量

+++

二级种子液

22.5％

5.53

较长

较细

较均匀

少量

++++

通过实施例5～6与实施例1对比，GA₃菌种冷冻管直接接入摇瓶的量对种子的质量有一定影响，但都能为发酵罐正常供种，最终确定实施例1的摇瓶接种量为最优；通过比较例1～2与实施例1对比，摇瓶、一级及二级种子罐培养液都在正常范围，但减少了多次活化GA₃保存菌种斜面的步骤，缩短了种子液制备时间，简化了种子制备工艺流程，通过实施例1批次生产得到摇瓶数据见表19。

表19摇瓶批次生产数据

批次

湿重

pH

菌丝长短

菌丝粗细

胞质均匀与否

有无空泡

发酵液粘稠度

1751

31％

4.54

较长

较细

较均匀

少量

++++

1752

27％

4.26

较长

较细

较均匀

少量

++++

1753

26％

4.46

较长

较细

较均匀

少量

++++

1754

23％

4.73

较长

较细

较均匀

少量

++++

实施例7

7.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10％～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表20。

表20发酵培养基的配方

发酵条件同实例1。

对实施例7中得到的发酵液进行检测，得到结果见表21与表22。

表21发酵液检测数据

表22发酵液湿重

实施例8

8.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10％～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表23。

表23发酵培养基的配方

发酵条件同实施例1。

对实施例8中得到的发酵液进行检测，得到结果见表24与表25。

表24发酵液检测数据

表25发酵液湿重

实施例9

9.1将1.3中得到的种子液按培养液质量的10～15％转入发酵罐中进行发酵，发酵培养基配方见表26。

表26发酵培养基的配方

培养条件同实施例1。

对实施例9中得到的发酵液进行检测，得到结果见表27与表28。

表27发酵液检测数据

表28发酵液湿重

通过实施例7、8可以看出调节玉米蛋白粉及磷酸二氢钾的量直接影响最终目标产物GA₃的量，即实施例1培养基优于实例7、8；再通过实施例9可以看出用花生饼粉代替玉米蛋白粉最终目标产物远低于实施例1。所以实施例1配方为最佳培养基组合。

Claims

1.一种赤霉酸的发酵方法，其特征在于，包括：

将赤霉酸的种子液转入发酵罐中进行发酵，得到赤霉酸发酵液；所述发酵罐中的发酵培养基，由以下组分组成：玉米蛋白粉10~40 g/L；磷酸二氢钾1~10 g/L；小分子有机碳源5~30 g/L；植物油0.5~5 g/L；硫酸镁0.5~2 g/L；硫酸铵0.5~2 g/L；微量元素0.1~1 g/L；在发酵过程中当溶氧高于20%~30%时，补加葡萄糖与植物油；

所述小分子有机碳源为蔗糖与葡萄糖；

所述微量元素为硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴；

所述发酵的温度为28℃~30℃；所述发酵的时间为8~10天；所述发酵的pH值为5.0~5.2；

所述葡萄糖与植物油的质量比为（1~3）：1。

2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵的压力为0.01~0.05 MPa；所述发酵的空气流量为2000~3000 Nm³/h。

3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述葡萄糖以葡萄糖溶液的形式添加；所述葡萄糖溶液中葡萄糖的质量浓度为40%~50%；所述葡萄糖溶液与植物油的体积比为（2~4）：1。

4.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述蔗糖与葡萄糖的质量比为（1~2）：（2~1）。

5.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、钼酸钠、硫酸铜与氯化钴的质量比为（0.5~1.5）：（0.5~1.5）：（0.5~1.5）：（0.1~0.5）：（0.1~0.5）：（0.1~0.5）。