CN112430636B - 一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法 - Google Patents

一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法，涉及生物发酵技术领域，该方法包括以下步骤：将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；所述发酵补加剂包括L‑蛋氨酸、银耳多糖、叶酸和葛根素的一种或多种。本发明通过分批次补加银耳多糖、叶酸和葛根素，能够有效地促进碳源、氮源以及磷源的利用，提高菌体的代谢活动，进而保持菌体的生物量，促进腺苷蛋氨酸产量的提高。

Description

一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法。
背景技术
腺苷蛋氨酸，简称SAM，是生物体内的一种重要的生理活性物质和中间代谢物质，它具有关键的生理作用，是人体内最重要的甲基供体，在生命活动过程中，使得重要物质如蛋白质、脂类、核酸以及碳水化合物等甲基化，此外，其还具备转硫和转氨丙基的作用。目前为止，腺苷蛋氨酸可以由化学合成、酶促转化法以及微生物发酵三种途径得到，其中，化学合成法通常产量低且价格高昂，酶促转化法尽管纯度较高，但同样也存在着价格高昂的问题，相比较而言微生物发酵成本较低且产量较高，成为腺苷蛋氨酸合成的主流方式。
在菌体的发酵过程中，L-蛋氨酸的浓度以及ATP的浓度均是促进SAM产量的关键因素，如ATP可以通过菌体利用碳源等进行代谢产生，其既是SAM的合成前体，又为SAM的生产提供能量。因此现有技术中多采用补加L-蛋氨酸或者优化发酵培养基的方式来优化发酵过程中L-蛋氨酸的浓度以及ATP的浓度进而提高SAM的最终产量。例如，文献：林海军.酿酒酵母发酵生产腺苷蛋氨酸及其分离纯化工艺的研究[D].西南大学,2008.对酿酒酵母发酵生产腺苷蛋氨酸进行了详细的研究，该文献主要筛选出一种酵母菌Sake，进一步复筛出编号为552的酵母菌，进而探索了该菌种的发酵条件，通过各项工艺参数的优化，使SAM的产量达到3g/L以上。中国专利CN104878059B公开了一种制备S-腺苷蛋氨酸的方法，以D/L-蛋氨酸为原料，发酵获得S-腺苷蛋氨酸，该发明将柠檬酸和磷酸盐添加入发酵液中，使菌株利用柠檬酸和磷酸盐合成ATP，在保证不显著提高原料成本的情况下，解决了现有技术中S-腺苷蛋氨酸产量因胞内ATP浓度低造成的产物产量低的问题，显著提高了S-腺苷蛋氨酸产量和L-蛋氨酸的转化率。上述两篇专利或文献均主要通过补加D/L-蛋氨酸作为底物，或是通过发酵液的优化，即添加柠檬酸和磷酸盐等，从而控制L-蛋氨酸的浓度以及ATP的浓度来促进SAM的生产。但上述两篇现有技术在发酵过程中主要仍依赖于D/L-蛋氨酸的浓度，难以在菌体层面促进菌体的代谢活动，因此有一定的局限性。
针对现有技术存在的D/L-蛋氨酸浓度依赖性高，发酵过程存在局限性等问题，需要寻找一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法，从而合理调节碳源、氮源以及磷源的利用平衡，进一步提高菌体的代谢活动，使得培养基的生物量能够保持较高的水准，进而促进腺苷蛋氨酸产量的提高。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种生物法制造腺苷蛋氨酸的方法，该方法通过发酵培养基的以及补加情况的优化，能够有效地促进碳源、氮源以及磷源的利用，提高菌体的代谢活动，进而保持菌体的生物量，促进腺苷蛋氨酸产量的提高。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供了一种制造腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；
所述发酵补加剂包括L-蛋氨酸、银耳多糖、叶酸和葛根素的一种或多种。
进一步地，所述发酵培养基包括：土豆培养液、葡萄糖、L-蛋氨酸、鱼蛋白胨、酵母粉、K2HPO、银耳多糖、MgCl2和余量水。
优选地，所述发酵培养基按重量百分比计，包括：土豆培养液18-22％、葡萄糖2.5-3.5％、L-蛋氨酸0.8-1％、鱼蛋白胨1-2％、酵母粉0.8-1.2％、K2HPO40.4-0.6％、银耳多糖0.2-0.5％、MgCl20.01-0.02％和余量水。
进一步优选地，所述发酵培养基按重量百分比计，包括：土豆培养液20％、葡萄糖3％、L-蛋氨酸1％、鱼蛋白胨1.5％、酵母粉1％、K2HPO40.5％、银耳多糖0.3％、MgCl20.01％和余量水。
进一步地，所述分批次补加包括：发酵24-28h进行第一次补加，发酵48-52h进行第二次补加，发酵90-95h进行第三次补加。
进一步地，所述第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸8-10g/L、银耳多糖0.5-1g/L、叶酸0.001-0.0015g/L和葛根素1-2g/L。优选为L-蛋氨酸8g/L、银耳多糖0.8g/L、叶酸0.001g/L和葛根素1.5g/L(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
进一步地，所述第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸3-5g/L、银耳多糖0.3-0.5g/L和葛根素0.5-0.8g/L。优选为L-蛋氨酸4g/L、银耳多糖0.4g/L和葛根素0.6g/L(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
进一步地，所述第三次补加中，发酵补加剂的补加量为：葛根素0.2-0.5g/L。优选为0.3g/L(此处的补加量为补加剂相对于发酵培养基的量)。
进一步地，所述种子培养基包括：葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4和余量水。
优选地，所述种子培养基按重量百分比计，包括：葡萄糖0.5-1.5％、鱼蛋白胨0.3-0.6％、酵母粉0.4-0.5％、KH2PO40.2-0.5％、K2HPO4 0.1-0.3％和余量水。
进一步优选地，所述种子培养基按重量百分比计，包括：葡萄糖1％、鱼蛋白胨0.5％、酵母粉0.4％、KH2PO40.3％、K2HPO4 0.2％和余量水。
进一步地，所述发酵培养基的接种量为发酵培养基总体积的5％。
进一步地，所述种子培养基的培养条件为：25-32℃，150rpm条件下震荡培养24h。
进一步地，所述发酵培养基的培养条件为：25-32℃，发酵液初始pH＝5，150rpm条件下震荡培养100h。
进一步地，在发酵过程中每隔24h，补加质量分数为80％的磷酸和25％的氨水，调节pH在5左右，在此过程中，氮源和磷源也得到了补充。
本发明所取得的技术效果是：本发明利用酿酒酵母发酵培养制造腺苷蛋氨酸，在此过程中，通过对培养基的组分进行优化，并进行分批次的补加，进而提高腺苷蛋氨酸的产量以及培养基中的生物量。在补加过程中，补加氨水和磷酸，调节pH的同时也能够补充氮源和磷源，此外，主要补加银耳多糖、叶酸以及葛根素，其中，叶酸能够为菌体代谢提供缺乏的营养物质，消除发酵过程中相关营养物质的浪费，研究发现，适量的银耳多糖以及葛根素的加入能够对菌体细胞产生刺激性，同时能够合理调节碳源、氮源以及磷源的利用平衡，促进ATP的合成，进一步提高菌体的代谢活动，使得培养基的生物量能够保持较高的水准，进而促进腺苷蛋氨酸产量的提高。
具体实施方式
值得说明的是，本发明中使用的酿酒酵母为酿酒酵母ATCC9763，其余原料均为普通市售产品，因此对其来源不做具体限定。
实施例1
一种制造腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；分批次补加包括：发酵24h进行第一次补加，发酵48h进行第二次补加，发酵90h进行第三次补加。第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸8g/L、银耳多糖0.5g/L、叶酸0.001g/L和葛根素1g/L。第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸3g/L、银耳多糖0.3g/L和葛根素0.5g/L。第三次补加中，发酵补加剂的补加量为：葛根素0.2g/L。
其中，种子培养基按重量百分比计，包括：葡萄糖0.5％、鱼蛋白胨0.3％、酵母粉0.4％、KH2PO40.2％、K2HPO4 0.1％和余量水。种子培养基的培养条件为：25℃，150rpm条件下震荡培养24h。
发酵培养基包括：土豆培养液18％、葡萄糖2.5％、L-蛋氨酸0.8％、鱼蛋白胨1％、酵母粉0.8％、K2HPO40.4％、银耳多糖0.2％、MgCl20.01％和余量水。发酵培养基的培养条件为：25℃，发酵液初始pH＝5，150rpm条件下震荡培养100h。
实施例2
一种制造腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；分批次补加包括：发酵28h进行第一次补加，发酵52h进行第二次补加，发酵95h进行第三次补加。第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸10g/L、银耳多糖1g/L、叶酸0.0015g/L和葛根素2g/L。第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸5g/L、银耳多糖0.5g/L和葛根素0.8g/L。第三次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：葛根素0.5g/L。
其中，种子培养基按重量百分比计，包括：葡萄糖1.5％、L-蛋氨酸1％、鱼蛋白胨0.6％、酵母粉0.5％、KH2PO4 0.5％、K2HPO4 0.3％和余量水。种子培养基的培养条件为：32℃，150rpm条件下震荡培养24h。
发酵培养基包括：土豆培养液22％、葡萄糖3.5％、鱼蛋白胨2％、酵母粉1.2％、K2HPO4 0.6％、银耳多糖0.5％、MgCl20.02％和余量水。发酵培养基的培养条件为：32℃，发酵液初始pH＝5，150rpm条件下震荡培养100h。
实施例3
一种制造腺苷蛋氨酸的方法，包括以下步骤：
将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；分批次补加包括：发酵25h进行第一次补加，发酵50h进行第二次补加，发酵92h进行第三次补加。第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸8g/L、银耳多糖0.8g/L、叶酸0.001g/L和葛根素1.5g/L。第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸4g/L、银耳多糖0.4g/L和葛根素0.6g/L。第三次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：葛根素0.3g/L。
其中，种子培养基按重量百分比计，包括：葡萄糖1％、L-蛋氨酸1％、鱼蛋白胨0.5％、酵母粉0.4％、KH2PO40.3％、K2HPO4 0.2％和余量水。种子培养基的培养条件为：30℃，150rpm条件下震荡培养24h。
发酵培养基包括：土豆培养液18-22％、葡萄糖2.5-3.5％、鱼蛋白胨1-2％、酵母粉0.8-1.2％、K2HPO40.4-0.6％、银耳多糖0.2-0.5％、MgCl20.01-0.02％和余量水。发酵培养基的培养条件为：30℃，发酵液初始pH＝5，150rpm条件下震荡培养100h。
对比例1
与实施例3的区别仅在于，不进行补加发酵补加剂。
对比例2
与实施例3的区别仅在于，第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸8g/L和叶酸0.001g/L。第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸4g/L，不进行第三次补加(即仅补加L-蛋氨酸和叶酸)。
对比例3
与实施例3的区别仅在于，第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸6g/L、银耳多糖1.2g/L、叶酸0.0008g/L和葛根素2.5g/L。第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸2g/L、银耳多糖0.6g/L和葛根素0.3g/L。第三次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：葛根素0.1g/L。
对比例4
与实施例3的区别仅在于，不补加葛根素。
SAM产量以及生物量检测
发酵结束后取样检测实施例1-3以及对比例1-4中SAM的产量以及菌体生物量(菌体湿重)，具体方法参照文献：林海军.酿酒酵母发酵生产腺苷蛋氨酸及其分离纯化工艺的研究[D].西南大学,2008.中的具体方法进行(本发明中仅检测发酵结束时对应的SAM产量以及生物量)，得到表1。
表1
实例 SAM产量(g/L) 生物量(g/L)
实施例1 3105.4 150
实施例2 3189.5 155
实施例3 3227.8 158
对比例1 1305.5 86
对比例2 2532.0 123
对比例3 2765.4 140
对比例4 2869.0 132
由表1可知，实施例1-3中的方法得到的SAM产量可达3105.4-3227.8g/L，生物量达150-158g/L，由此可知本发明的方法能够提高SAM的产量同时在一定时间内避免菌体的自溶保证菌体的生物量。对比例1-4与实施例3相比，SAM的产量以及生物量均有所降低，如对比例1不进行分批次补加时，由于原培养基中的各类原料水平下降，没有额外的营养补入，同时底物L-蛋氨酸在前期已经消耗殆尽，进一步地菌种代谢降低，生物量下降，进而导致SAM产量的降低。对比例2当仅补加L-蛋氨酸和叶酸或者如对比例4所示不补加葛根素时，由于难以促成二者之间对于菌体的刺激作用，进而导致产量的下降，尤其表现在生物量的下降方面，极可能是由于菌体代谢降低进而菌体产生自溶的原因。对比例3则表明发酵补加剂的组分含量也有着较高的要求，一旦各个原料的补加量过多或多少时，将造成一定的浪费亦或是难以维持发酵环境的平衡性，导致生物量难以维持较高水平，SAM产量出现下降的情况。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (4)

1.一种制造腺苷蛋氨酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
将酿酒酵母活化后接种到种子培养基，得到种子液后，将种子液接种到发酵培养基，发酵培养得到腺苷蛋氨酸；在发酵培养过程中分批次补加发酵补加剂；
所述发酵补加剂由L-蛋氨酸、银耳多糖、叶酸和葛根素的一种或多种组成；
所述发酵培养基包括：土豆培养液、葡萄糖、L-蛋氨酸、鱼蛋白胨、酵母粉、K2HPO4、银耳多糖、MgCl2和余量水；所述发酵培养的培养条件为：25-32℃，发酵液初始pH=5，150rpm条件下震荡培养100h；
所述分批次补加包括：发酵24-28h进行第一次补加，发酵48-52h进行第二次补加，发酵90-95h进行第三次补加；所述第一次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸8-10g/L、银耳多糖0.5-1g/L、叶酸0.001-0.0015g/L和葛根素1-2g/L；所述第二次补加中，发酵补加剂的补加量分别为：L-蛋氨酸3-5g/L、银耳多糖0.3-0.5g/L和葛根素0.5-0.8g/L；所述第三次补加中，发酵补加剂的补加量为：葛根素0.2-0.5g/L；
所述酿酒酵母为酿酒酵母ATCC9763。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基包括：土豆培养液18％-22%、葡萄糖2.5％-3.5％、L-蛋氨酸0.8％-1％、鱼蛋白胨1％-2％、酵母粉0.8％-1.2％、K2HPO4 0.4％-0.6％、银耳多糖0.2％-0.5%、MgCl2 0.01％-0.02％和余量水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述种子培养基包括：葡萄糖、鱼蛋白胨、酵母粉、KH2PO4、K2HPO4和余量水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：种子培养的培养条件为：25-32℃，150rpm条件下震荡培养24h。
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